[논문]당귀사역탕(當歸四逆湯)이 MIA로 유발된 골관절염 흰쥐에 미치는 영향

양두화; 우창훈; 김정민; 안희덕

doi:10.18325/jkmr.2015.25.2.037

당귀사역탕(當歸四逆湯)이 MIA로 유발된 골관절염 흰쥐에 미치는 영향
Effects of Danggwisayeok-tang (Dangguisinitang) on MIA-Induced Osteoarthritis Rats 원문보기

Journal of Korean Medicine Rehabilitation : JKMR = 한방재활의학과학회지, v.25 no.2, 2015년, pp.37 - 50

양두화 (대구한의대학교 한의과대학 한방재활의학과교실) , 우창훈 (대구한의대학교 한의과대학 한방재활의학과교실) , 김정민 (대구한의대학교 한의과대학 한방재활의학과교실) , 안희덕 (대구한의대학교 한의과대학 한방재활의학과교실)

Abstract ▼ AI-Helper

Objectives The purpose of this study was to know the effects of Danggwisayeok-tang (Dangguisinitang) extract (DGSYT) on monosodium iodoacetate (MIA)-induced rat osteoarthritis. Methods For this purpose, rats were divided into 5 groups. Normal group was not injected with MIA and orally administered any medication. Control group was injected with MIA and not orally administered any medication. DGSYT100 group was injected with MIA and orally administered 100 mg/kg of DGSYT. DGSYT300 group was injected with MIA and orally administered 300 mg/kg of DGSYT. JoinsT group was injected with MIA and orally administered 20 mg/kg of Joins tablet. DGSYT100 and DGSYT300 groups were orally administered DGSYT during a week before and 3 weeks after based on the day MIA injected. The changes of hepatotoxicity, nephrotoxicity, relative hind paw weight distribution, cytokine in serum, cytokine messenger ribonucleic acid (mRNA) in joint tissue and histopathological observation (Hematoxylin & Eosin and Safranin-O staining) were measured. Results Alanine aminotransferase (ALT) levels of DGSYT100, DGSYT300 and JoinsT groups were increased significantly, but these results were within normal range. Aspartate aminotransferase (AST) and creatinine levels of all groups were not changed significantly. In the change of relative hind paw weight distribution, DGSYT300 and JoinsT groups were decreased significantly 14 and 21 days after MIA injected. Interleukin-$1{\beta}$ (IL-$1{\beta}$) and Interleukin-6 (IL-6), Leukotriene $B_4$ and Osteocalcin levels of DGSYT300 and JoinsT groups were decreased significantly. In measurement of IL-$1{\beta}$ and nitric oxide synthase-II mRNA relative quantitative of control, DGSYT100, DGSYT300 and JoinsT groups were decreased significantly. In measurement of TNF-${\alpha}$, IL-6 and Cyclooxygenase-2 mRNA relative quantitative of control, DGSYT300 and JoinsT groups was decreased significantly. In histopathological observation of knee, synovial tissue, cartilage and proteoglycan of DGSYT100, DGSYT300 and JoinsT were well preserved compared with control group. Conclusions According to the results, DGSYT has anti-inflammation and pain relief effects. So it should be suppressed progression of arthritis in MIA-induced osteoarthritis rat.

주제어

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문제 정의

이에 저자는 當歸四逆湯의 항염증 효과를 실험적으로 규명하기 위하여 흰쥐를 MIA로 골관절염을 유발시켜 뒷다리 체중부하 검사, 혈청 내 염증 cytokine 및 매개인자 측정, 슬관절 조직의 cytokine 유전자 발현 분석과 연골의 병리조직학적 변화 등을 관찰하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
이에 저자는 골관절염에 대한 효과와 안전성이 뛰어난 약물 개발을 위하여 본 실험을 진행하였으며, 뒷다리 체중부하 검사, 체중변화, 식이효율, 간 및 신장독성 검사, 혈청 내 염증 cytokine 및 매개인자 측정, 슬관절 조직의 cytokine 유전자 발현 분석과 연골의 병리조직학적 변화를 관찰하여 이를 검증하고자 하였다.
이러한 연골파괴의 과정에서 IL-1β, IL-6 등과 같은 cytokine의 역할이 중요하기 때문에 세포외기질 분해효소나 cytokine을 억제하는 치료제가 개발되고 있다¹⁵⁾. 한의학에서는 한약을 이용한 골관절염의 실험^16-19)이 다수가 있으며 본 실험에서는 當歸四逆湯의 골관절염에 대한 효과를 규명하고자 하였다.

제안 방법

1주일에 1회씩 식이섭취량(g)을 측정하였다. 식이섭취량은 MIA유발 후 0, 7, 14, 21일째 되는 날의 일정한 시간에 측정하여 일평균 섭취 식이량을 산출하였으며, 식이효율(food efficiency ratio)은 체중증가량을 식이섭취량으로 나누어서 계산하였다.
Decalcification 과정을 거쳐 파라핀으로 고정된 조직을 7 μm의 크기로 자른 뒤, H&E 및 Safranin-O 염색을 실시하여 조직의 상태를 관찰하였다.
실험 종료 후 슬관절 부위를 절단하여 10% EDTA가 포함된 10% formalin 용액에 넣어 joint를 decalcification시킨다. Radiographic technique을 이용하여 decalcification 유무를 확인한 후 parafin wax에 joint를 넣고 고정한 다음 coronal section을 실시하였다. Decalcification 과정을 거쳐 파라핀으로 고정된 조직을 7 μm의 크기로 자른 뒤, H&E 및 Safranin-O 염색을 실시하여 조직의 상태를 관찰하였다.
이 20 μl의 반응 혼합액을 잘 섞은 뒤 2,000 rpm에서 5초간 원심 침강하여 37℃ heating block에서 45분 동안 반응시켜 first-strand cDNA를 합성한 다음, 95℃에서 5분 동안 방치하여 M-MLV RT를 불활성화 시킨 후 합성이 완료된 cDNA를 PCR에 사용하였다. Real time quantitative PCR은 Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR system (Applied Biosystems, USA)를 이용하여 수행하였다. Rat probe 및 oligonucleotide의 염기배열은 다음과 같다(Table II).
유전자 발현은 internal standard로 TaqMan probe (FAM dye-labeled, ABi, USA)인 Mouse Glyceralde-hyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) probe set을 사용하였고, primer의 최종 농도가 200 nM이 되게 반응시켰다. Real time quantitative PCR의 조건을, pre-denaturation은 50℃에서 2분간, 94℃에서 10분간, 그리고 40 cycle을 95℃에서 15초간, 45℃에서 60초간 수행하였다. 실험군과 대조군은 internal standard로 GAPDH를 사용하여 target group의 Quantitative PCR은 y=x(1＋e)n, x=starting quantity, y=yield, n=number of cycles, e= efficiency로 계산하여 relative quantitative (RQ)를 측정하였다.
當歸四逆湯의 2첩 분량에 증류수 2,000 ml를 가하여 열탕 추출기(대웅, DWT-1800T, 한국)에서 2시간 추출하여 얻은 액을 흡입 여과하여 이를 감압 증류장치(Rotary evaporator, BUCHI B-480, Switzerland)로 농축하여, 이를 다시 동결 건조기(Freeze dryer, EYELA FDU-540, Japan)를 이용하여 완전 건조한 當歸四逆湯 추출물(DGSYT 14.4 g)을 냉동 보관(−84℃)하면서 적당한 농도로 희석하여 사용하였다.
當歸四逆湯의 안전성을 확인하기 위하여 흰쥐의 체중 변화와 식이효율을 측정하였다. 각 군의 체중변화는 모든 군에서 정상군과 비슷하게 완만하고 지속적인 증가 곡선으로 나타났으며, 식이 효율에서도 대조군에 비하여 當歸四逆湯 투여군에서 유의한 차이가 관찰되지 않았으므로 當歸四逆湯의 투여는 흰쥐의 몸무게 및 증상에 영향을 미치지 않았다(Fig.
실험군은 골관절염을 유발시키지 않은 정상군(Normal), MIA로 골관절염 유발한 대조군(Control), MIA로 골관절염 유발 후 當歸四逆湯 100 mg/kg 투여군(DGSYT100), MIA로 골관절염 유발 후 當歸四逆湯 300 mg/kg 투여군(DGSYT300), 양성대조군으로 MIA로 골관절염 유발 후 Joins Tablet (J200, SK케미칼, 경기, 한국) 20 mg/kg 투여군(JoinsT)으로 나누어 5마리씩 배정하였고, 배정받은 날로부터 4주간 경구 투여 하였다. 當歸四逆湯의 희석은 0.25% Carboxymethylcellulose (CMC, Sigma Co., USA)용액에 녹여서 투여했고, MIA 유도 골관절염 대조군은 0.5% CMC 용액을 동량 투여하였다. 약물 투여는 금속제 존대(sonde)를 이용하여 위내로 강제 경구 투여하였다.
상기 ELISA법을 상세히 살펴보면, 먼저 코팅된 LTB₄, Osteocalcin의 96 well plate에 100 μl씩 각각 흰쥐 혈청을 분주하고 실온에서 16시간 방치하였다. 다음으로, 상기 플레이트를 0.05%의 트윈(tween)이 포함된 PBST로 3회 이상 세척하고, 1%의 Bovine Serum Albumin를 함유한 PBS로 차단하였고, 실온에서 2시간 방치하였다. 다시, 각 well을 세척한 후 2차 항체 바이오틴(biotin)이 결합된 LTB₄, Osteocalcin를 첨가하고 실온에서 2시간 방치하였다.
뒷다리 체중 부하 측정은 Incapacitance tester를 사용하여, 흰쥐의 배가 기기의 센서에 닿지 않은 상태에서 오른쪽, 왼쪽의 발무게(g)를 각각 측정하였다. 실험결과는 관절염이 유발된 뒷다리의 체중 부하량에 대한 정상 뒷다리의 체중 부하량을 계산하여 체중 부하 비율을 계산하고, 정상군의 체중 부하 비율에 대한 각 군의 체중 부하비율을 계산하여 평균(%)±표준오차로 표시하였다.
마지막으로, well을 PBST로 세척한 다음, ABTS [2,2’-azino-bis(3-ethyl-benzthiazolin-6-sulfonic acid)] 기질을 첨가하고 발색반응을 ELISA 판독기로 405 nm의 파장에서의 흡광도(OD)를 측정하였다.
마취 후 Sprague-Dawley rat의 왼쪽 무릎관절 주변을 깨끗이 제모한 후 골관절염 유발물질인 MIA를 0.3 ml 주사기(BD 31 G Ultra-Fine II, USA)를 사용하여 무릎 관절강 내에 0.9% saline으로 희석하여 50 μl (60 mg/ml)씩 투여하였다.
마취된 실험동물 심장에서 혈액을 10 ml를 syringe (21G, 한국백신, 한국)로 취해 혈청분리용 tube에 담고, 혈청분리용 tube의 혈액은 3000 rpm에서 20분간 원심분리 후 혈청을 얻어 생화학적 지표 분석을 위한 시료로 이용하였다. 분리한 혈장(plasma)에서 간 기능의 지표인 Aspartate aminotransferase (AST)와 Alanine aminotransferase (ALT)를, 신장 기능의 지표인 Creatinine의 수준을 생화학자동 분석기(Hitachi-720, Hitachi Medical, Japan)를 이용하여 측정하였다.
마취된 실험동물 심장에서 혈액을 10 ml를 syringe (21G, 한국백신, 한국)로 취해 혈청분리용 tube에 담고, 혈청분리용 tube의 혈액은 3000 rpm에서 20분간 원심분리 후 혈청을 얻어 생화학적 지표 분석을 위한 시료로 이용하였다. 분리한 혈장(plasma)에서 간 기능의 지표인 Aspartate aminotransferase (AST)와 Alanine aminotransferase (ALT)를, 신장 기능의 지표인 Creatinine의 수준을 생화학자동 분석기(Hitachi-720, Hitachi Medical, Japan)를 이용하여 측정하였다.
슬관절 내 활막조직, 연골세포, 섬유조직의 병리조직학적 관찰을 위하여 H&E와 Safranin-O 염색을 실시하였다.
실험결과는 관절염이 유발된 뒷다리의 체중 부하량에 대한 정상 뒷다리의 체중 부하량을 계산하여 체중 부하 비율을 계산하고, 정상군의 체중 부하 비율에 대한 각 군의 체중 부하비율을 계산하여 평균(%)±표준오차로 표시하였다. 시험물질은 오전에 투여하고 측정은 오후에 하는 것을 원칙으로 하며, 뒷다리 체중 부하 측정일은 MIA 유발 후 0, 7, 14, 21일째 되는 날에 각각 시행하였다.
1주일에 1회씩 식이섭취량(g)을 측정하였다. 식이섭취량은 MIA유발 후 0, 7, 14, 21일째 되는 날의 일정한 시간에 측정하여 일평균 섭취 식이량을 산출하였으며, 식이효율(food efficiency ratio)은 체중증가량을 식이섭취량으로 나누어서 계산하였다.
Real time quantitative PCR의 조건을, pre-denaturation은 50℃에서 2분간, 94℃에서 10분간, 그리고 40 cycle을 95℃에서 15초간, 45℃에서 60초간 수행하였다. 실험군과 대조군은 internal standard로 GAPDH를 사용하여 target group의 Quantitative PCR은 y=x(1＋e)n, x=starting quantity, y=yield, n=number of cycles, e= efficiency로 계산하여 relative quantitative (RQ)를 측정하였다.
실험군은 골관절염을 유발시키지 않은 정상군(Normal), MIA로 골관절염 유발한 대조군(Control), MIA로 골관절염 유발 후 當歸四逆湯 100 mg/kg 투여군(DGSYT100), MIA로 골관절염 유발 후 當歸四逆湯 300 mg/kg 투여군(DGSYT300), 양성대조군으로 MIA로 골관절염 유발 후 Joins Tablet (J200, SK케미칼, 경기, 한국) 20 mg/kg 투여군(JoinsT)으로 나누어 5마리씩 배정하였고, 배정받은 날로부터 4주간 경구 투여 하였다. 當歸四逆湯의 희석은 0.
5% CMC 용액을 동량 투여하였다. 약물 투여는 금속제 존대(sonde)를 이용하여 위내로 강제 경구 투여하였다.
역전사(reverse transcription) 반응은 준비된 total RNA 3 μg을 DNase I (10 U/μl) 2 U/tube를 37℃ heating block에서 30분간 반응한 후 75℃에서 10분 동안 변성시키고, 이에 2.5 μl 10 mM dNTPs mix, 1 μl random sequence hexanucleotides (25 pmole/25 μl), RNA inhibitor로서 1 μl RNase inhibitor (20 U/μl), 1 μl 100 mM DTT, 4.5 μl 5×RT buffer (250 mM Tris-HCl, pH 8.3, 375 mM KCl, 15 mM MgCl2)를 가한 후, 1 μl의 M-MLV RT (200 U/μl)를 다시 가하고 DEPC 처리된 증류수로서 최종 부피가 20 μl가 되도록 하였다.
유전자 발현은 internal standard로 TaqMan probe (FAM dye-labeled, ABi, USA)인 Mouse Glyceralde-hyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) probe set을 사용하였고, primer의 최종 농도가 200 nM이 되게 반응시켰다. Real time quantitative PCR의 조건을, pre-denaturation은 50℃에서 2분간, 94℃에서 10분간, 그리고 40 cycle을 95℃에서 15초간, 45℃에서 60초간 수행하였다.
체중은 MIA유발 후 0, 7, 14, 21일째 되는 날 오전 10시에 동물용 체중계(카스전자 저울, 한국)로 측정하여 기록하였다.
실험 종료 후 각 실험동물로부터 적출한 왼쪽 슬관절(knee) 조직에서의 유전자 발현 양상을 Real-time PCR 증폭법을 사용하여 관찰하였다. 흰쥐 관절조직 0.1 g을 RNAzol^B (Tel-Test)용액으로 RNA를 추출한 뒤 One-step SYBR Green PCR kit (AB science)를 사용하여 cDNA 및 Real-time PCR 분석을 하였다. 활막조직(synovial tissue)에 RNAzol^B 500 μl를 넣고 homogenizer로 조직을 분쇄하여 여기에 chloro- form (CHCl₃) 50 μl를 첨가한 후 15초간 다시 혼합하였다.

대상 데이터

본 실험에 사용된 기기는 CO₂ incubator (Forma scientific Co., USA), Clean bench (Visionscientific Co., 한국), Autoclave (Sanyo, Japan), Micro-pipet (Gilson, France), Water bath (Vision scientific Co., 한국), Vortex mixer (Vision scientific Co., 한국), Spectrophotometer (Shimazue, Japan), Centrifuge (Sigma, USA), Deep-freezer (Sanyo, Japan), Quantitative Real-Time RT-PCR (Applied Biosystems, USA), ELISA reader (Molecular devise, USA), Ice-maker (Vision scientific Co., 한국), Homogenizer (OMNI, USA), Plateshaker (Lab-Line, USA), Incapacitance analgesy meter (IITC Inc, USA) 등을 사용하였다.
본 실험에 사용된 시약 Diethyl pyrocarbonate (DEPC), Chloroform, Trichloroacetic acid, Isopropanol, Tris-HCl, KCl, MgCl2, Dulbecco’s phosphate buffered saline (D-PBS), 2-isopropanol, Monosodium iodoacetate (MIA)는 Sigma사(USA) 제품을 사용하였으며, 우태아혈청(Fetal bovine serum, FBS)은 Life Technologies사(NY, USA) 제품을, Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit로 Interleukin-1β (IL-1β), Interleukin-6 (IL-6)는 R&D system사(MN, USA) 제품을 사용하였고 Leukotriene B4 (LTB4), Cyclooxygenase-2 (COX-2)는 Cayman사(Michigan, USA), Nitric Oxide (NO) Detection Kit는 Intron사(cat. No. 21021, USA), Osteocalcin은 TaKaRa사(MK147, Japan) 제품을 사용하였다.
본 실험에서 골관절염을 유도하기 위하여 흰쥐의 관절강에 주입할 약물로 MIA를 선택했다. MIA는 GAPDH 활동의 억제를 통하여 해당 작용을 멈추게 하고 연골세포의 대사를 억제해 세포사멸을 유도하고 연골의 기질을 감소시킨다.
본 실험에서 사용한 처방의 약재들은 ≪新古方撰次≫¹⁴⁾에 의거하여 옴니허브(대구, 한국)에서 구입, 정선 후 사용하였으며 1첩당 분량은 다음과 같다(Table I).
본 연구에 사용된 當歸四逆湯의 처방은 當歸, 桂枝, 白灼藥, 細辛, 甘草, 通草, 大棗로 구성되어 있다. 이 중 當歸는 補血活血하고 行氣止痛하는 효능이 있으며⁷⁾, 염증 반응의 매개 물질인 NO, PGE₂, IL-6의 생성을 억제한다⁸⁾.
샘타코바이오코리아사(오산, 한국)에서 공급하는 7주령의 수컷 Sprague-Dawley rat (175~200 g)을 공급받았고, 실험 당일까지 고형사료(삼양사료 Co.)와 물을 충분히 공급하고, 온도(22±2℃), 습도(55±15%)가 조절된 사육실에서 12시간 light-dark cycle 환경을 유지하며 1주간 적응시킨 후 실험을 시작하였다.

데이터처리

Statistically significant value was calculated by compared with Control by student's t-test (***p＜0.001, **p＜0.01, *p＜0.05).
실험 결과는 평균±표준편차로 나타내었고 대조군과 약물 투여군의 측정치 및 오차를 근거로 SPSS의 11.0의 Student’s t-test를 사용하여 p＜0.05를 유의성이 있는 것으로 판단하여 통계처리 하였다.
실험결과는 관절염이 유발된 뒷다리의 체중 부하량에 대한 정상 뒷다리의 체중 부하량을 계산하여 체중 부하 비율을 계산하고, 정상군의 체중 부하 비율에 대한 각 군의 체중 부하비율을 계산하여 평균(%)±표준오차로 표시하였다.

이론/모형

실험 종료 후 각 실험동물로부터 적출한 왼쪽 슬관절(knee) 조직에서의 유전자 발현 양상을 Real-time PCR 증폭법을 사용하여 관찰하였다. 흰쥐 관절조직 0.
채혈한 혈액으로부터 혈청을 분리한 뒤, 혈청 중 염증성 지표로서 IL-1β, IL-6 단백질의 발현량을 ELISA법으로 측정하였다.

성능/효과

1. ALT는 대조군에 비해 DGSYT100, DGSYT300, JoinsT에서 유의하게 증가되었으나 정상범위에 속하였다. AST와 Creatinine도 대조군에 비해 유의한 차이는 없었다.
2. 뒷다리 체중부하 측정에서 MIA 유발 14, 21일 후 DGSYT300, JoinsT에서 대조군에 비해 유의한 감소를 나타냈다.
3. 혈청 내 cytokine 및 매개인자 측정에서 IL-1β, IL-6, LTB4와 Osteocalcin는 대조군에 비해 DGSYT300과 JoinsT에서 유의한 감소를 나타냈다.
4. 슬관절 조직 내 cytokine 유전자 발현 측정에서, IL-1β 및 NOS-II mRNA 발현량은 대조군에 비해 DGSYT100, DGSYT300, JoinsT에서 유의한 감소를 나타냈으며 TNF-α, IL-6, COX-2 mRNA 발현량은 대조군에 비해 DGSYT300와 JoinsT에서 유의한 감소가 나타났다.
5. 병리조직학적으로 관절에서 대조군에 비해 DGSYT100, DGSYT300, JoinsT에서 활막 조직, 연골 및 proteoglycan 등의 변화가 억제되었다.
무릎 관절 내 H&E 염색을 실시한 후 관찰한 결과, Normal의 활막 조직, 연골 등은 정상이었고 Control에서는 골관절염이 유발되어 활막 조직과 연골의 변성 및 변형이 현저하게 나타났다. DGSYT100, DGSYT300, JoinsT의 활막 조직 및 연골 등은 Control과 비교하여 정상에 가까워 조직 손상이 상대적으로 억제되는 것으로 나타났다(Fig. 7A).
H&E 염색 후 관찰한 결과, 대조군에 비하여 當歸四逆湯 투여군과 JoinsT는 관절 조직의 변형이 심한 대조군에 비하여 활막조직, 연골세포, 섬유조직 모두 비교적 안전하게 보존되어 있는 것을 관찰할 수 있었고(Fig. 7A), Safranin-O 염색 후 관찰에서도 대조군은 관절조직의 파괴가 일어나 적색이 적었으나 當歸四逆湯 투여군과 JoinsT에서는 연골부위에 적색이 많이 관찰되어 proteoglycan의 농도가 높다는 것을 알 수 있었기 때문에(Fig. 7B), 當歸四逆湯의 투여가 병리조직학적 보호가 양호하게 이루어 졌다고 사료된다.
IL-1β, IL-6 측정에서 대조군에 비해 DGSYT300과 JoinsT에서 유의하게 감소한 것으로 나타나(Fig. 5A, B) 當歸四逆湯이 염증 인자에 영향을 미쳐 골관절염에 효과있을 것으로 사료된다.
MIA 유발 후 3주간의 체중 측정에서 모든 군에서 체중이 증가하였으며 각 군 간의 유의성 있는 차이는 관찰되지 않았다(Fig. 1A).
Normal의 뒷다리 체중 부하 비율을 100으로 하였을 때 각 군의 상대적 체중 부하의 변화를 측정한 결과, MIA 투여 7일 후에는 Control 332.4±131.1, DGSYT100 173.9± 26.7, DGSYT300 112.0±5.0, JoinsT 152.7±18.9로 나타나 Control에 비해 유의성 있는 차이는 관찰되지 않았으나, 14일 후에는 Control 192.4±13.5, DGSYT100 156.1±16.1, DGSYT300 124.8±10.4, JoinsT 114.6±3.6으로 나타나 DGSYT300과 JoinsT에서 Control에 비해 유의성 있는 감소가 나타났고, 21일 후에는 Control 236.0±56.9, DGSYT100 127.1±8.4, DGSYT300 111.0±4.6 , JoinsT 120.5±8.7으로 나타나 DGSYT300과 JoinsT에서 Control에 비해 유의성 있는 감소가 나타났다(Fig. 4).
특히 뼈 흡수와 관련된 과정에서의 osteocalcin은 골기질에서 파골세포의 분화 마지막 단계에서 파골세포의 성숙에 기여한다^37,38). Osteocalcin 측정에서 대조군에 비해 DGSYT300과 JoinsT에서 유의한 감소가 나타났다(Fig. 5D). 이는 當歸四逆湯이 osteocalcin의 억제를 통한 파골세포의 성숙을 저해하여 골관절염에서 나타나는 골파괴를 예방할 것으로 사료된다.
Safranin-O 염색 후 관찰한 결과, Normal의 관절 조직 및 proteoglycan은 정상적으로 관찰되었으나 Control에서는 골관절염이 유발되어 관절조직이 변형되고 proteoglycan의 대부분이 파괴되었다. 반면 DGSYT100, DGSYT300, JoinsT에서는 Control에 비해 관절조직의 변형이 억제되고 proteoglycan의 소실도 억제되는 것으로 나타났다 (Fig.
관절 조직의 COX-2 mRNA 유전자 발현량은 Control이 1.170±0.170일 때 Normal 0.272±0.143, DGSYT100 0.881±0.315, DGSYT300 0.660±0.095, JoinsT 0.467± 0.308으로 DGSYT300과 JoinsT에서 유의성 있게 COX-2 mRNA 유전자 발현의 감소를 나타내었다(Fig. 6D).
관절 조직의 IL-1β mRNA 유전자 발현량은 Control이 1.009±0.009일 때 Normal 0.530±0.218, DGSYT100 0.754±0.120, DGSYT300 0.666±0.049, JoinsT 0.468± 0.209으로 DGSYT100, DGSYT300, JoinsT에서 유의성 있게 IL-1β mRNA 유전자 발현의 감소를 나타내었다(Fig. 6B).
관절 조직의 IL-6 mRNA 유전자 발현량은 Control이 0.938±0.062일 때 Normal 0.187±0.166, DGSYT100 .832±0.020, DGSYT300 0.652±0.123, JoinsT 0.616± 0.069으로 DGSYT300과 JoinsT에서 유의성 있게 IL-6 mRNA 유전자 발현의 감소를 나타내었다(Fig. 6C).
관절 조직의 NOS-II mRNA 유전자 발현량은 Control이 1.101±0.101일 때 Normal 0.164±0.062, DGSYT100 0.889±0.046, DGSYT300 0.723±0.147, JoinsT 0.578± 0.120로 DGSYT100, DGSYT300, JoinsT에서 Control에 비해 유의성 있게 NOS-II mRNA 유전자 발현의 감소를 나타내었다(Fig. 6E).
관절 조직의 TNF-α mRNA 유전자 발현량은 Control이 0.950±0.050일 때 Normal 0.613±0.313, DGSYT100 0.827±0.135, DGSYT300 0.596±0.068, JoinsT 0.492± 0.256로 DGSYT300, JoinsT에서 Control에 비해 유의성 있게 TNF-α mRNA 유전자 발현량의 감소를 나타내었다(Fig. 6A).
본 실험에서는 MIA 주사 7일 후에는 대조군에 비하여 유의성 있는 차이가 발생하지 않았으나 14, 21일 후에는 대조군에 비하여 DGSYT300과 JoinsT에서 유의한 감소가 나타났다. 따라서 當歸四逆湯은 골관절염이 유발된 흰쥐 뒷다리의 통증 억제에 효과가 있었다(Fig. 4).
Creatinine 수치도 대조군에 비하여 유의한 변화가 관찰되지 않았다. 따라서 체중변화, 식이효율, 간 및 신장 기능검사의 결과는 흰쥐에게 투여된 當歸四逆湯이 안전한 약물임을 알 수 있었다(Fig. 3).
무릎 관절 내 H&E 염색을 실시한 후 관찰한 결과, Normal의 활막 조직, 연골 등은 정상이었고 Control에서는 골관절염이 유발되어 활막 조직과 연골의 변성 및 변형이 현저하게 나타났다.
Safranin-O 염색 후 관찰한 결과, Normal의 관절 조직 및 proteoglycan은 정상적으로 관찰되었으나 Control에서는 골관절염이 유발되어 관절조직이 변형되고 proteoglycan의 대부분이 파괴되었다. 반면 DGSYT100, DGSYT300, JoinsT에서는 Control에 비해 관절조직의 변형이 억제되고 proteoglycan의 소실도 억제되는 것으로 나타났다 (Fig. 7B).
때문에 MIA 주입 7일 뒤부터 정상 뒷다리와 골관절염이 유발된 뒷다리의 체중 부하 변화가 발생하게 된다. 본 실험에서는 MIA 주사 7일 후에는 대조군에 비하여 유의성 있는 차이가 발생하지 않았으나 14, 21일 후에는 대조군에 비하여 DGSYT300과 JoinsT에서 유의한 감소가 나타났다. 따라서 當歸四逆湯은 골관절염이 유발된 흰쥐 뒷다리의 통증 억제에 효과가 있었다(Fig.
슬관절 조직 내 cytokine mRNA를 측정한 결과, TNF-α, IL-6 및 COX-2 mRNA 발현량은 대조군에 비해 DGSYT300과 JoinsT에서 유의한 감소를 나타내었고(Fig. 6A, C, D), IL-1β와 NOS-II mRNA 측정에서 DGSYT100 및 DGSYT300과 JoinsT에서 유의한 감소가 나타났다(Fig. 6B, E).
약물의 생체 내 독성을 알아보기 위해 간 기능을 반영하는 AST, ALT와 신장 기능을 반영하는 Creatinine 수치를 알아본 결과 AST는 MIA로 골관절염이 유발된 모든 군에서 정상군 대비 증가된 수치를 보였지만, 대조군과 비교하여 當歸四逆湯 투여군의 유의한 차이는 보이지 않았다. ALT는 대조군에 비하여 當歸四逆湯 투여군에서 유의하게 상승하였지만 ALT의 정상범위였으므로²⁶⁾ 간독성은 없었다(Fig.
이상의 결과로 보아 當歸四逆湯은 MIA로 유도된 흰쥐의 골관절염에서 항염증, 진통효과 및 골관절염 진행에 대해 억제하는 효과가 있다고 사료된다.
혈액 내 IL-1β를 측정한 결과 Normal 49.2±10.7, Control 355.0±52.6, DGSYT100 300.8±64.4, DGSYT300 197.1±26.1, JoinsT 140.6±16.3로 나타나 Control에 비하여 DGSYT300와 JoinsT에서 Control에 비해 유의성 있는 감소가 나타났다(Fig. 5A).
혈액 내의 IL-6를 측정한 결과 Normal 22.3±1.7, Control 50.8±5.6, DGSYT100 46.2±6.9, DGSYT300 36.0±4.1, JoinsT 30.5±5.3로 나타나 DGSYT300과 JoinsT에서 Control에 비해 유의성 있는 감소가 나타났다(Fig. 5B).
혈액 내의 LTB4를 측정한 결과 Normal 0.66±0.08, Control 4.11±0.13, DGSYT100 3.73±0.31, DGSYT300 2.18±0.14, JoinsT 1.98±0.15로 DGSYT300과 JoinsT에서 Control에 비해 유의성 있게 감소되었다(Fig. 5C).
혈액 내의 Osteocalcin을 측정한 결과 Normal 209.1± 57.3, Control 983.7±52.7, DGSYT100 843.3±88.6, DGSYT300 689.2±97.2, JoinsT 662.2±70.0로 나타나 DGSYT300과 JoinsT에서 유의성 있게 감소하였다(Fig. 5D).
혈청 중의 ALT는 Normal 27.0±2.1, Control 35.8±2.4, DGSYT100 37.2±3.3, DGSYT300 37.2±1.2, JoinsT 33.4±3.1로 나타났으며 DGSYT100, DGSYT300, JoinsT 에서 Control에 비하여 유의성 있게 증가되었다(Fig. 2).

후속연구

”라 하였으며, 溫經散寒하여 養血通脈의 효능이 있어 血虛한데 寒邪를 받아 陽虛血虧하여 四肢를 溫養하지 못해 經脈의 血行이 不利하여 발생하는 증상을 치료하는 처방이다⁶⁾. 當歸四逆湯은 當歸, 桂枝, 白灼藥, 細辛, 甘草, 通草, 大棗로 구성되어 있으며 각 한약재는 골관절염에 대한 항염증 및 진통 효과를 가지고 있기 때문에^7-13) 본 처방도 골관절염의 치료에 응용될 수 있을 것이라 생각되었다.
5D). 이는 當歸四逆湯이 osteocalcin의 억제를 통한 파골세포의 성숙을 저해하여 골관절염에서 나타나는 골파괴를 예방할 것으로 사료된다.
이상의 실험 결과로 미루어 볼 때, 當歸四逆湯은 MIA로 유발된 흰쥐의 골관절염에 작용하여 염증 cytokine 및 매개인자의 활성화를 억제하는 항염증의 효능과 진통 작용을 가지고 있었으며, 조골 작용의 저해를 방지하고 파골작용을 억제하여 관절의 연골 및 조직의 파괴에 대한 보호 작용이 있으므로 골관절염의 치료제로 이용될 수 있으리라 사료된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	골관절염이란?	퇴행성 관절염이라고도 불리는 골관절염은 국소적인 관절 부위의 연골이 점차적으로 소실되고 이와 동반된 2차적인 변화를 일으키는 질환으로, 과거에는 노화 현상의 일부로 생각되었지만 최근에는 관절 연골의 변화를 일으키는 질환이라고 인식되고 있다1).
	當歸四逆湯은 어떤 약재로 만들어지는가?	當歸四逆湯은 當歸, 桂枝, 白灼藥, 細辛, 甘草, 通草, 大棗 로 구성되어 있으며 각 한약재는 골관절염에 대한 항염증및 진통 효과를 가지고 있기 때문에7-13) 본 처방도 골관절염의 치료에 응용될 수 있을 것이라 생각되었다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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