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문제 정의
- 본 실험에서는 8주령의 rat을 사용하여 나노섬유의 유착방지능을 평가하였다. 유착면적 및 유착부위의 조직검사는 생략하였고, 본 실험에서는 유착정도를 평가하기 위하여 Vlahos 실험방법을 기초로 계산하였다.
- 본 연구에서는 우수한 생체적합성과, 생분해성을 가지며 친수성의 특성을 가지고 있는 천연고분자인 키토산과 생체적합성 및 조절가능한 생분해성을 특징으로 하는 합성고분자인 PLGA를 이용하여 나노섬유를 제작하였다. 키토산 단독으로 전기방사법을 이용하여 나노섬유를 제작할 때 탈아세틸화도와 분자량 등의 차이에 의해 나노섬유 제조가 어려우나, PLGA를 도입하여 방사성을 향상시켰다.
- 이때 방사성의 향상을 위하여 화장품과 식품에 널리 사용되는 비이온성 계면활성제인 polysorbate80을 소량 첨가함으로서 재현성을 확보하였다[17]. 아울러 제조한 Chitosan/PLGA/Polysorbate80 나노섬유 부직포를 조직유착실험에 적용함으로서, 생분해특성과 조직유착방지 특성을 종합적으로 평가하고자 하였다.
- 제조한 나노섬유의 in vitro 생체적합성 평가: 본 연구에서 제조된 다양한 나노섬유 시트의 세포의 증식거동을 조사하여, 유착방지막으로서의 가능성을 평가하였다. 증식거동을 위하여 섬유아세포(NIH/3T3, Fibroblast)를 배양하였으며, 세포배양액은 10% 우태혈청(FBS, WelGENE Inc.
제안 방법
- ), 평판형태(200×200 mm, stainless steel)와 회전드럼형태(400(w)×216(φ) mm, stainless steel)의집전판(collector), 금속 드럼의 회전속도 제어장치(0−176 rpm) 및 고분자용액을 일정한 유량 및 유체속도로 제어하는 주사기펌프(KDS220,KD Scientific Inc.), 주사기(gastight and luer lock type, 10.0ml, Hamilton81620 USA), 금속 주사기바늘(Hamilton91022, 21 gauge(inner diameter: 0.514 mm), USA), 디지털 온/습도계(JB913R, Oregon Scientific Inc., USA) 등으로 구성하였다.
- 1주일간 배양접시(Corning®, 100 mm)에서 배양시킨 섬유아세포는 PBS 용액으로 1회 세척 후 Trypsin-EDTA 용액(WelGENE Inc., Korea)으로 처리하여 떼어내고 원심분리기(1500 rpm, 5 min)로 분리한 세포만을 회수하여 5×104 cell/ml의 농도로 희석시킨후 12-well culture plate에 1ml/well 씩 분주하고, 37 °C, 5% CO2 인큐베이터에서 각각 4 h, 1, 3, 5, 7일 동안 배양시켜 관찰하였다.
- 한편 in vitro에서의 생분해거동이 주로 가수분해에 의해 일어나는 것과 달리 in vivo에서는 단순한 가수분해는 물론 생체내에 존재하는 다양한 가수분해효소에 의해 그 분해속도가 가속된다는 점을 고려할 필요가 있다. Chitosan/PLGA(7:3)/Polysorbate80의 분해 경향이 3일차부터 관찰되어 생체내에서의 그 분해속도가 더욱 더 가속화되는 것을 고려하여 in vivo 유착방지능 평가실험에서는 실험군으로는 Chitosan/PLGA(5:5)/Polysorbate80과 Chitosan/PLGA(6:4)/polysorbate80을, 비교군으로는 PLGA 섬유를 사용하여 유착방지특성을 평가하였다. 실험 결과, 대조군은 유착형성률이 78% 정도로 대부분의 경우 복벽과 맹장과의 유착이 관찰되었고, 유착의 정도 2.
- Chitosan/PLGA/Polysorbate80 나노섬유 시트의 제조: 나노섬유 시트를 제조하기 위하여 제조한 혼합 용액을 전기방사 하였다. 주사기 끝과 집전판 사이에 23 kV의 전압, 주사기 끝과 집전판 사이의 간격은 10 cm, 주사기 펌프에 의한 유체속도는 1.
- , Korea)을 사용하였다. Chitosan/PLGA/Polysorbate80 나노섬유와 PLGA 나노섬유를 직경이 20 mm인 원형 시편으로 준비하여 감마선 25 kGy로 조사하여 멸균처리 하였다. 1주일간 배양접시(Corning®, 100 mm)에서 배양시킨 섬유아세포는 PBS 용액으로 1회 세척 후 Trypsin-EDTA 용액(WelGENE Inc.
- MTT assay를 통해 세포의 증식정도를 정량적으로 평가하였다. MTT assay는 thiazolyl blue tetrazolium bromide(MTT tetrazolium)라는 물질이 미토콘드리아 산화환원 반응에 의해 MTT formazan으로 바뀌고, 육안적으로는 노란색에서 보라색으로 변한다.
- PLGA 나노섬유 시트 제조: PLGA 나노섬유 시트를 제조하기 위해 5 wt%의 HFIP 용액을 전기방사 하였다. 주사기 끝과 집전판 사이에 15 kV의 전압, 주사기 끝과 집전판 사이의 간격은 19 cm, 주사기 펌프에 위한 유체속도는 1.
- SEM을 통해 얻어진 나노섬유 이미지를 통하여 섬유의 직경 및 직경분포를조사하기 위해 이미지 영상분석 프로그램 (IMT i-solution ver 3.1, Image & Microscope Technology Inc.)를 이용하였다.
- 각 샘플은 37 °C 인산완충용액(PBS, pH 7)에 담근 후 상온에서 10분간 건조한 뒤, 나노섬유 부직포의 사이즈를 비교함으로써 수축의 여부 및 정도를 평가하였다.
- 나노섬유 표면의 친수성 정도를 측정하기 위해 접촉각 측정기를 사용하여 섬유 표면위의 물 접촉각을 확인하였다. 상대적인 비교를 위해 PLGA 나노섬유 표면을 측정하였을 때 각도는 109.
- 나노섬유의 수축거동을 조사하기 위해서 37 °C PBS에 시편을 침지시킨 후 건조하여, 나노섬유의 수축을 관찰하였다.
- 이를 microplate reader를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하여 세포 증식 거동을 평가하는 방법이다. 나노섬유의 유착방지막으로서의 적합성을 평가하기 위하여 대조군인 PLGA 나노섬유와 Chitosan/PLGA/Polysorbate80 나노섬유들 위에 섬유아세포를 파종하여 세포의 생존율을 MTT assay로 측정하였다. 결과를 보았을 때 대조군인 PLGA 섬유는 7일차까지 섬유아세포의 증식이 지속적으로 증가하였다(Figure 6).
- 나노섬유의 형태 및 직경 분석: 전기방사법으로 제작된 나노섬유는 주사전자현미경(scanning electron microscope(SEM), JSM-6380, d=3.0 nm, JEOL, Japan)를 이용하여 섬유의 형태 및 섬유 직경을 관찰하였다. 시료표면은 60초간 sputter coater(108auto, degree of vacuum: 0.
- 나노섬유의수축관찰: PLGA와 Chitosan/PLGA/Polysorbate80 나노섬유 부직포를 직경이 20 mm인 원형 형태로 샘플을 준비한 뒤 수축 테스트를 실시하였다. 각 샘플은 37 °C 인산완충용액(PBS, pH 7)에 담근 후 상온에서 10분간 건조한 뒤, 나노섬유 부직포의 사이즈를 비교함으로써 수축의 여부 및 정도를 평가하였다.
- rat의 맹장의 장막을 사포로 마찰시켜 출혈을 유도하고, 맹장과 맞닿은 안쪽 복벽을 칼로 긁어내어 상처를 내어 유착이 쉽게 발생할 수 있는 환경을 인위적으로 만들어주었다. 대조군으로서 유착방지막을 삽입하지 않은 rat과 실험군으로는 유착방지막을 삽입한 rat에 대하여 4주 후 개복 후 유착발생 상태, 심도 및 유착방지효과를 살펴보고 Vlahos의 실험방법에 따라 유착정도를 평가하였다. Vlahos의 실험방법에 따르면 유착의 세기를 0에서 4까지 5등급으로 분류하며, 1등급은 필름형이며 매우 약한 힘으로도 떨어지는 유착, 2등급은 중간 정도의 힘이 요구되는 유착, 3등급은 상당한 압력이 걸려야 뗄 수 있는 유착, 4등급은 유착이 매우 강해서 떼기 힘들거나, 매우 큰 압력이 요구되는 경우로 분류하였다[20].
- 점도가 낮은 경우에는 액체로 흩뿌려지는 경우가 발생하고, 점도가 높은 경우에는 주사기 바늘에 용액이 고화되어 방사성이 저하된다. 따라서 시험 방사과정을 통하여 최적의 방사조건을 확립하였다. 본 연구에서 제조된 나노섬유 시트의 평균섬유직경을 SEM 촬영과, 이미지 영상분석 프로그램을 통해 분석하였다.
- 5 wt%)인 나노섬유를 제조하였다. 또한 원활한 방사를 위해 전체고분자양의 약 1 wt%의 polysorbate80을 고분자용액에 첨가하여 실온에서 24시간 교반시켰다. 비교군으로는 PLGA를 5 wt%의 HFIP 용액으로 제조하여 실온에서 24시간 교반시켜 방사용액으로 사용하였다.
- rat을 Zoletil® 50과 Rompun®을 4:1의 비율로 섞어 다리근육에 주사하여 마취시킨다. 마취가 된 rat의 복부를 제모한 뒤, 포비돈 요오드 용액으로 복부를 소독한 후 복부를 절개한다. rat의 맹장의 장막을 사포로 마찰시켜 출혈을 유도하고, 맹장과 맞닿은 안쪽 복벽을 칼로 긁어내어 상처를 내어 유착이 쉽게 발생할 수 있는 환경을 인위적으로 만들어주었다.
- 3 µm로 측정되었고, Chitosan/PLGA/Polysorbate80 나노섬유의평균 직경은 Chitosan/PLGA(5:5)/Polysorbate80은 126 nm, Chitosan/PLGA(6:4)/Polysorbate80은 102 nm, Chitosan/PLGA(7:3)/Polysorbate80은 110 nm로 측정되었다(Figure 1). 본 실험에서 사용한 키토산은 HFIP와 TFE의 혼합용매에서 높은 점도를 나타내므로 키토산 함량이 높아질수록 방사용액의 농도는 점차 낮추어 전기방사 하였다. 나노섬유의 직경은 가급적 유사하도록 제조하고자 노력하였으며, 그 차이값이 크지 않음을 알 수 있었다[21].
- 따라서 시험 방사과정을 통하여 최적의 방사조건을 확립하였다. 본 연구에서 제조된 나노섬유 시트의 평균섬유직경을 SEM 촬영과, 이미지 영상분석 프로그램을 통해 분석하였다.
- 또한 원활한 방사를 위해 전체고분자양의 약 1 wt%의 polysorbate80을 고분자용액에 첨가하여 실온에서 24시간 교반시켰다. 비교군으로는 PLGA를 5 wt%의 HFIP 용액으로 제조하여 실온에서 24시간 교반시켜 방사용액으로 사용하였다.
- 4) 용액을넣고 37 °C, 5% CO2 인큐베이터 (MCO-15AC, SANYO, Japan)에서 시간경과(0d, 3d, 7d, 14d, 21d,28d)에 따라 SEM image 분석을 통하여 섬유의 형태변화, 수축 및 생분해 거동을 관찰하였다. 시간에 따라 회수한 시편은 각 시료병에 넣고 24시간 동안 상온에서 진공건조 후 주사전자현미경으로 나노섬유의 미세형태와 구조변형을 분석하였다.
- 유착방지막의 적용가능성을 알아보기 위해 나노섬유를 37 oC PBS에 넣어 0d, 3d, 7d, 14d, 21d, 28d에 관찰함으로써 생분해 실험을 진행하였다. 비교군인 PLGA 나노섬유의 경우 키토산을 함유한 나노섬유에 비해서 생분해 거동이 현저히 느린 것을 SEM 사진을 통해서 확인할 수 있었다.
- 본 연구에서는 키토산과 PLGA를 블렌드한 혼합용액을 전기방사법을 이용하여 나노사이즈의 직경을 갖는 나노섬유를 제조하였다. 이때 방사성의 향상을 위하여 화장품과 식품에 널리 사용되는 비이온성 계면활성제인 polysorbate80을 소량 첨가함으로서 재현성을 확보하였다[17]. 아울러 제조한 Chitosan/PLGA/Polysorbate80 나노섬유 부직포를 조직유착실험에 적용함으로서, 생분해특성과 조직유착방지 특성을 종합적으로 평가하고자 하였다.
- 전기방사는 목재 챔버 안에서 최적의 습도(<30%)와온도(25−35 °C)를 일정하게 유지하며 수행하였으며 금속 드럼의 회전속도는 20 rpm(13.56 m/min)으로 고정하여 실험하였다.
- 전기방사한 나노섬유 시트를 1×1 cm 크기로 제작한 다음 24-well tissue culture plate 바닥에 고정시킨 후 1ml 인산완충용액(PBS, pH 7.4) 용액을넣고 37 °C, 5% CO2 인큐베이터 (MCO-15AC, SANYO, Japan)에서 시간경과(0d, 3d, 7d, 14d, 21d,28d)에 따라 SEM image 분석을 통하여 섬유의 형태변화, 수축 및 생분해 거동을 관찰하였다.
- , Korea)를 이용하여 Sessile drop method(증류수, 5 µl, 15 °C)로 나노섬유의 물 접촉각을 측정하였다[18]. 정확성을 위하여 측정할 나노섬유의 표면을 평평하게 한 뒤 각각 다른 5군데에 물방울을 떨어트리고 5초 후 측정하여 평균값을 계산하였다.
- 회전드럼 위에 알루미늄 포일을 덧씌움으로써 포집된 섬유를 쉽게 분리할 수 있도록 하였고, 그 위에 10시간 동안 방사하였다. 제조된 샘플은 공기 중의 수분에 의한 분해 및 변형을 방지하기 위하여 밀봉하여 제습보관 하였다.
- 제조한 나노섬유의 in vitro 생분해거동: 유착방지막으로서 적용하기 위해서 생분해 거동을 분석하였다. 전기방사한 나노섬유 시트를 1×1 cm 크기로 제작한 다음 24-well tissue culture plate 바닥에 고정시킨 후 1ml 인산완충용액(PBS, pH 7.
- PLGA 나노섬유 시트 제조: PLGA 나노섬유 시트를 제조하기 위해 5 wt%의 HFIP 용액을 전기방사 하였다. 주사기 끝과 집전판 사이에 15 kV의 전압, 주사기 끝과 집전판 사이의 간격은 19 cm, 주사기 펌프에 위한 유체속도는 1.0 ml/h의 속도로 설정하고, 마찬가지로 회전드럼을 감싼 알루미늄 포일 위에 방사를 하였다. 제조된 샘플은 공기 중의 수분에 의한 분해 및 변형을 방지하기 위하여 밀봉하여 제습 보관하였다.
- 56 m/min)으로 고정하여 실험하였다. 중력의 영향을 배제하기 위해 방사방향은 중력의 수직상태로 설치하여 방사하였다.
- 본 연구에서는 우수한 생체적합성과, 생분해성을 가지며 친수성의 특성을 가지고 있는 천연고분자인 키토산과 생체적합성 및 조절가능한 생분해성을 특징으로 하는 합성고분자인 PLGA를 이용하여 나노섬유를 제작하였다. 키토산 단독으로 전기방사법을 이용하여 나노섬유를 제작할 때 탈아세틸화도와 분자량 등의 차이에 의해 나노섬유 제조가 어려우나, PLGA를 도입하여 방사성을 향상시켰다. 제조한 나노섬유는 FT-IR을 통하여 분석하였으며, 키토산의 함량이 증가할수록 표면은 친수화 되었음을 나노섬유의 물접촉각 측정 결과를 통해 확인하였다.
- 비이온성 계면활성제인 polysorbate80은 Fluka에서 구입하여 사용하였다. 키토산과 PLGA는 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol(HFIP)과 2,2,2-trifluoroethanol (TFE)의 공용매(6:4)를 사용하여 Chitosan/PLGA의 무게비율이 5:5(4 wt%), 6:4(3 wt%), 7:3(2.5 wt%)인 나노섬유를 제조하였다. 또한 원활한 방사를 위해 전체고분자양의 약 1 wt%의 polysorbate80을 고분자용액에 첨가하여 실온에서 24시간 교반시켰다.
- 키토산과 PLGA의 블렌드 여부를 평가하기 위해 PLGA 나노섬유와 Chitosan/PLGA/Polysorbate80 나노섬유의 표면을 ATR-FTIR을 이용하여 측정하였다. PLGA의 경우에는 특성기인 carbonyl기로 인하여 1750 cm-1 부근에서 특성 피크가 관찰되었다.
- )를 이용하였다. 프로그램을 이용하여 scale bar를 보정한 뒤, 서로 다른 200개의 섬유직경을 측정하여 평균직경을 분석하였다.
- 0 ml/h로 고정하였다. 회전드럼 위에 알루미늄 포일을 덧씌움으로써 포집된 섬유를 쉽게 분리할 수 있도록 하였고, 그 위에 10시간 동안 방사하였다. 제조된 샘플은 공기 중의 수분에 의한 분해 및 변형을 방지하기 위하여 밀봉하여 제습보관 하였다.
대상 데이터
- 제조한 나노섬유의 in vivo 유착방지능 평가: In vivo 유착방지능 평가는 칠곡경북대학교병원에 의뢰하여 실시하였으며, 경북대학교 병원의 동물실험규정을 준수하여 실시하였다. 나노섬유의 유착방지능을 평가하기 위해서 실험대상으로 outbred male Sprague Dawley rats(효창사이언스)을 사용하였다. 유착평가를 위한 수술을 시행하기 전 3일 정도 실험실에서 적응시켰으며, rat은 8주령(weight: 230−280 g) 36 마리를 건강한 상태에서 동물실험에 적용하였다.
- 키토산은 천연고분자이기 때문에 우수한 생체적합성, 생분해성을 보이며 면역반응을 일으키지 않아 의료용 소재로 널리 응용되고 있다[12−14]. 또한 키토산과 더불어 본 연구에서는 poly(D,L-lactic-co-glycolic acid)(PLGA)를 유착방지제 제조의 기본 재료로 사용하였다. PLGA는 미국 식품의약품안전청에 의해 임상용으로 승인된 합성고분자이며, 뛰어난 생체적합성, 조절가능한 생분해성이 특징이다[15,16].
- 본 연구에서는 블렌드 용액 제조를 위해, 키토산 (95% 탈아세틸화도, 9 cPs)은 삼성키토피아에서 구입하였고, poly(lactide-co-glycolide) (PLGA) (고유점도 1.6 dl/g)는 BoehringerIngelheim(Germany)에서 구입한 Resomer RG 509s(lactide:glycolide=5:5)를 사용하였다. 비이온성 계면활성제인 polysorbate80은 Fluka에서 구입하여 사용하였다.
- 본 연구에서는 유착방지능이 우수한 조직 유착방지제를 개발하기 위해 생체유래 물질이며 친수성 천연고분자인 키토산(chitosan)을 사용하였다. 천연유래 고분자는 널리 생체조직공학의 용도로 이용되며, 그 대표적인 소재로는 알지네이트, 콜라겐, 알부민, 셀룰로스, 히알루론산, 키토산(키틴), 실크, 풀루란, 덱스트란 등이 있다[11].
- 본 연구에서는 키토산과 PLGA를 블렌드한 혼합용액을 전기방사법을 이용하여 나노사이즈의 직경을 갖는 나노섬유를 제조하였다. 이때 방사성의 향상을 위하여 화장품과 식품에 널리 사용되는 비이온성 계면활성제인 polysorbate80을 소량 첨가함으로서 재현성을 확보하였다[17].
- 비교군으로 제조한 PLGA 나노섬유는 직경이 약 1.3 µm로 측정되었고, Chitosan/PLGA/Polysorbate80 나노섬유의평균 직경은 Chitosan/PLGA(5:5)/Polysorbate80은 126 nm, Chitosan/PLGA(6:4)/Polysorbate80은 102 nm, Chitosan/PLGA(7:3)/Polysorbate80은 110 nm로 측정되었다(Figure 1).
- 6 dl/g)는 BoehringerIngelheim(Germany)에서 구입한 Resomer RG 509s(lactide:glycolide=5:5)를 사용하였다. 비이온성 계면활성제인 polysorbate80은 Fluka에서 구입하여 사용하였다. 키토산과 PLGA는 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol(HFIP)과 2,2,2-trifluoroethanol (TFE)의 공용매(6:4)를 사용하여 Chitosan/PLGA의 무게비율이 5:5(4 wt%), 6:4(3 wt%), 7:3(2.
- 유착평가를 위한 수술을 시행하기 전 3일 정도 실험실에서 적응시켰으며, rat은 8주령(weight: 230−280 g) 36 마리를 건강한 상태에서 동물실험에 적용하였다.
- 전기방사 장치 및 기구: 본 연구에서 사용한 전기방사장치의 구성은 0−40 kV의 전압공급이 가능한 직류 고전압 발생장치(DC High Voltage Generator(40 kV/3 mA), 청파 EMTCo.
- 증식거동을 위하여 섬유아세포(NIH/3T3, Fibroblast)를 배양하였으며, 세포배양액은 10% 우태혈청(FBS, WelGENE Inc., Korea), 1% penicillin G-streptomycin(WelGENE Inc., Korea)이 함유된 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM, WelGEN EInc., Korea)을 사용하였다.
이론/모형
- , Korea)으로 처리하여 떼어내고 원심분리기(1500 rpm, 5 min)로 분리한 세포만을 회수하여 5×104 cell/ml의 농도로 희석시킨후 12-well culture plate에 1ml/well 씩 분주하고, 37 °C, 5% CO2 인큐베이터에서 각각 4 h, 1, 3, 5, 7일 동안 배양시켜 관찰하였다. 3, 5일차에 배지 교환을 해주었고, 증식된섬유아세포의증식거동은 microplate reader(Opsys MR, DYNEX Tech. Inc.)를 사용하여 540 nm에서MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide) assay로 분석하였다[19].
- 본 실험에서는 8주령의 rat을 사용하여 나노섬유의 유착방지능을 평가하였다. 유착면적 및 유착부위의 조직검사는 생략하였고, 본 실험에서는 유착정도를 평가하기 위하여 Vlahos 실험방법을 기초로 계산하였다.
- 적외선 분광분석에 의한 표면 분석: 전기방사한 나노섬유의 표면 분석을 위하여 적외선 분광분석(attenuated total reflection-fourier transform infrared spectroscopy(ATR-FTIR), 300E Jasco)을 이용하였다. 이 때 프리즘은 MIRacleGe crystal(cat. 025-2050, MIRacle)을 사용하였으며, 4 cm-1의 분해능 및 256회의 스캔으로 측정하였다.
- 적외선 분광분석에 의한 표면 분석: 전기방사한 나노섬유의 표면 분석을 위하여 적외선 분광분석(attenuated total reflection-fourier transform infrared spectroscopy(ATR-FTIR), 300E Jasco)을 이용하였다. 이 때 프리즘은 MIRacleGe crystal(cat.
- 접촉각 측정: 제조한 나노섬유의 친수/소수 정도를 평가하기 위해 Contact Angle & Surface Tension Analyzer (Phoenix 300, SEO Co., Korea)를 이용하여 Sessile drop method(증류수, 5 µl, 15 °C)로 나노섬유의 물 접촉각을 측정하였다[18].
- 제조한 나노섬유의 in vivo 유착방지능 평가: In vivo 유착방지능 평가는 칠곡경북대학교병원에 의뢰하여 실시하였으며, 경북대학교 병원의 동물실험규정을 준수하여 실시하였다. 나노섬유의 유착방지능을 평가하기 위해서 실험대상으로 outbred male Sprague Dawley rats(효창사이언스)을 사용하였다.
성능/효과
- 78점으로 매우 저조한 결과를 나타냈다. Chitosan/PLGA(5:5)/Polysorbate80과 Chitosan/PLGA(6:4)/Polysorbate80은 각각 유착형성률이 각각 11%와 33%, 유착의 정도는 각각 0.33점과 0.44점으로 나타났으며 나노섬유는 완전히 분해되었음을 확인하였다. 이는 대조군과 비교군에 비해 현저하게 높은 유착방지효능을 보여주는 것이다.
- Chitosan/PLGA/Polysorbate80 나노섬유는 PLGA 나노섬유보다 polysorbate80의 존재와 키토산의 친수성으로 인해 더 낮은 접촉각이 측정되었으며, 각각 Chitosan/PLGA(5:5)/Polysorbate80는 53.88 °, Chitosan/PLGA(6:4)/Polysorbate80는 45.86 °, Chitosan/PLGA(7:3)/Polysorbate80은 35.62 °로 측정되었다(Figure 2).
- 나노섬유의 유착방지막으로서의 적합성을 평가하기 위하여 대조군인 PLGA 나노섬유와 Chitosan/PLGA/Polysorbate80 나노섬유들 위에 섬유아세포를 파종하여 세포의 생존율을 MTT assay로 측정하였다. 결과를 보았을 때 대조군인 PLGA 섬유는 7일차까지 섬유아세포의 증식이 지속적으로 증가하였다(Figure 6). 한편 키토산을 함유한 나노섬유는 7일동안의 세포성장이 미미하였다.
- C PBS에 넣어 0d, 3d, 7d, 14d, 21d, 28d에 관찰함으로써 생분해 실험을 진행하였다. 비교군인 PLGA 나노섬유의 경우 키토산을 함유한 나노섬유에 비해서 생분해 거동이 현저히 느린 것을 SEM 사진을 통해서 확인할 수 있었다. PLGA는 친유성 메틸기를 가지고 있어 키토산에 비해 생분해 거동이 느리다.
- 수술 후 조직유착으로 인해 환자에게 발생하는 합병증은 만성적 복부통증, 성기능 장애를 일으킬 뿐만 아니라 장폐색 49−74%, 불임 15−20%, 만성골반통증이 20−50%에 이르는 것으로 알려졌다[2].
- 수축거동실험에서 Chitosan/PLGA(5:5)/Polysorbate80의 경우 약간의 수축현상이 나타났음에도 불구하고 조금 더 우수한 유착방지특성을 보인 것은 손상된 조직 치유를 위해서는 최소 7−14일간 유착방지막이 그 형태를 유지해야 하는데 키토산의 함량이 더 높은 Chitosan/PLGA(6:4)/Polysorbate80의 경우 분해가 조금 더 빠르게 진행되어 유착방지특성이 좀 더 낮게 나타난 것으로 추정하였다.
- Chitosan/PLGA(7:3)/Polysorbate80의 분해 경향이 3일차부터 관찰되어 생체내에서의 그 분해속도가 더욱 더 가속화되는 것을 고려하여 in vivo 유착방지능 평가실험에서는 실험군으로는 Chitosan/PLGA(5:5)/Polysorbate80과 Chitosan/PLGA(6:4)/polysorbate80을, 비교군으로는 PLGA 섬유를 사용하여 유착방지특성을 평가하였다. 실험 결과, 대조군은 유착형성률이 78% 정도로 대부분의 경우 복벽과 맹장과의 유착이 관찰되었고, 유착의 정도 2.67점으로 평가되었다(Table 1). 비교군인 PLGA 나노섬유는 그 재료의 특성인 소수성 때문에 섬유가 수축하여 맹장과 복벽간의 물리적 장벽의 역할을 제대로 하지 못한 때문인지 유착형성률이 78%, 유착정도가 1.
- 앞선 in vitro 생분해 실험결과를 살펴보면 키토산의 함량이 많을수록 생분해속도가 빨라지는 것을 확인할 수 있었다. 한편 in vitro에서의 생분해거동이 주로 가수분해에 의해 일어나는 것과 달리 in vivo에서는 단순한 가수분해는 물론 생체내에 존재하는 다양한 가수분해효소에 의해 그 분해속도가 가속된다는 점을 고려할 필요가 있다.
- 키토산 단독으로 전기방사법을 이용하여 나노섬유를 제작할 때 탈아세틸화도와 분자량 등의 차이에 의해 나노섬유 제조가 어려우나, PLGA를 도입하여 방사성을 향상시켰다. 제조한 나노섬유는 FT-IR을 통하여 분석하였으며, 키토산의 함량이 증가할수록 표면은 친수화 되었음을 나노섬유의 물접촉각 측정 결과를 통해 확인하였다. 친수성 재료인 키토산의 첨가로 PLGA 섬유에서 보이는 in vitro에서의 수축현상을 극복할 수 있었으며, 키토산의 함량이 증가함에 따라 invitro 생분해성이 크게 향상됨을 확인하였다.
- 제조한 나노섬유는 FT-IR을 통하여 분석하였으며, 키토산의 함량이 증가할수록 표면은 친수화 되었음을 나노섬유의 물접촉각 측정 결과를 통해 확인하였다. 친수성 재료인 키토산의 첨가로 PLGA 섬유에서 보이는 in vitro에서의 수축현상을 극복할 수 있었으며, 키토산의 함량이 증가함에 따라 invitro 생분해성이 크게 향상됨을 확인하였다. 키토산을 함유한 나노섬유에서는 친수성의 증가로 인한 섬유아세포의 증식이 원활하지 않았으며, 이를 바탕으로 rat을 이용한 조직유착 동물실험결과 키토산을 함유한 나노섬유 부직포가 매우 우수한 유착방지특성을 가지며 유착방지 후 체내에서 완벽히 분해되었음을 확인할 수 있었다.
- 62 °로 측정되었다(Figure 2). 친수성을 나타내는 키토산 함량이 많아질수록 나노섬유의 접촉각이 낮아짐을 확인할 수 있었고, 시간이 지남에 따라 섬유표면이 물을 흡수하여 접촉각이 낮아지는 변화가 나타났다.
- Chitosan/PLGA/Polysorbate80 나노섬유는 계면활성제인 소량의 polysorbate80의 첨가와 키토산 구조의 아민기와 수산화기로 인해서 친수성이 증가하여PLGA의 수축작용을 완충시켜 PLGA 나노섬유에 비해 눈에 띄는 수축이 관찰되지 않았다[23]. 친수성이 매우 높거나 수용성의 고분자가 첨가되었을 때에는 나노섬유 부직포의 형태안정성을 저하시킬 수 있으나, 본 연구에서 사용한 키토산은 수용성을 가지지는 않지만 탈아세틸화도가 높고 분자량이 낮아 친수성을 향상시킬 수 있었다(Figure 3). 특히, 키토산의 함량이 60% 이상인 경우에는 전혀 수축이 일어나지 않음을 알 수 있었으며 유착방지막으로서 적용에 적합하다고 판단되었다.
- 친수성 재료인 키토산의 첨가로 PLGA 섬유에서 보이는 in vitro에서의 수축현상을 극복할 수 있었으며, 키토산의 함량이 증가함에 따라 invitro 생분해성이 크게 향상됨을 확인하였다. 키토산을 함유한 나노섬유에서는 친수성의 증가로 인한 섬유아세포의 증식이 원활하지 않았으며, 이를 바탕으로 rat을 이용한 조직유착 동물실험결과 키토산을 함유한 나노섬유 부직포가 매우 우수한 유착방지특성을 가지며 유착방지 후 체내에서 완벽히 분해되었음을 확인할 수 있었다.
- 친수성이 매우 높거나 수용성의 고분자가 첨가되었을 때에는 나노섬유 부직포의 형태안정성을 저하시킬 수 있으나, 본 연구에서 사용한 키토산은 수용성을 가지지는 않지만 탈아세틸화도가 높고 분자량이 낮아 친수성을 향상시킬 수 있었다(Figure 3). 특히, 키토산의 함량이 60% 이상인 경우에는 전혀 수축이 일어나지 않음을 알 수 있었으며 유착방지막으로서 적용에 적합하다고 판단되었다.
- PLGA의 경우에는 특성기인 carbonyl기로 인하여 1750 cm-1 부근에서 특성 피크가 관찰되었다. 한편 키토산을 함유하는 Chitosan/PLGA/Polysorbate80 나노섬유는 1640 cm-1와 3400 cm-1에서 primary amine과 O-H의 고유 피크가 나타났으며 피크의 강도는 키토산의 함량이 증가할수록 커짐을 알 수 있었다. 또한 PLGA 함량이감소함에따라 1750 cm-1 부근에서나타나는 carbonyl기의 특성 피크가 감소함을 확인할 수 있었다[24](Figure 4).
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