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문제 정의
- 본 연구에서는 이러한 제한 효소 인식 부위에 따른 발현 벡터 구축의 어려움을 해결하고자 gateway system (Invitrogen) 을 이용한 발현 벡터 구축 시스템을 확립하고자 하였다. 또한, 연구에서는 새롭게 구축한 gateway system을 사용하여 희소방선균 Saccharopolyspora erythraea의 receptor gene (seaR) 을 Streptomyces 속 Streptomyces coelicolor A3(2)에 삽입시킨 후 Streptomyces coelicolor A3(2) (transformant)과 wild type 균과의 표현형의 변화 관찰을 통하여 Streptomyces coelicolor A3(2) (transformant)의 seaR 단백질의 기능에 관하여 조사하였다.
- , 2005). 특히, 현대 사회에서 의학적으로 항생물질 내성균의 출현에 따른 새로운 항생물질과 같은 이차대사산물의 필요성과 함께 기존에 사용되어 지고 있는 다양한 이차대사산물의 생산성 향상이라는 목적이 방선균이라는 미생물을 활발히 연구하게 된 계기가 되었다. 하지만 새로운 방선균을 분리한다거나 변이주를 획득하는 등의 일반적인 연구방법들은 많은 시간과 노력, 투자를 필요로 하기 때문에 좋은 결과를 얻기에는 한계가 있는 실정이다.
제안 방법
- cDNA를 합성하기에 앞서 DNase I을 처리한 전체 RNA내의 chromosomal DNA의 존재유무는 전체 RNA를 주형으로 사용하여 SeaR2 primers를 이용하여 PCR을 수행하여 확인하였다. DNase I으로 처리한 전체 RNA는 Superscript Ⅲ reverse transcriptase kit (Invitrogen)와 Random primers (Invitrogen)를 이용하여 cDNA로 합성하였다. 최종적으로 형질전환된 seaR 유전자의 발현 유무를 확인하기 위하여 cDNA를 주형으로 이용하여 PCR을 수행하였다.
- Entry vector의 형질전환용 세포는 Mach1-T1 cell (One shot Mach-T1 chemically competent E. coli, Invitogen)을 사용하였고, destination vector 및 expression vector의 형질전환 및 대량회수를 위해서는 일반적인 형질전환 균주인 E. coli DH5α를 사용하였다.
- MIC 시험은 미생물 동정 및 항균제 감수성 검사 장비인 Vitek II System (bioMérieux)를 이용하여 MIC를 측정하였다.
- 접합전달에 의한 방선균의 형질전환 유무는 pSET152의 전체 염기서열 중 apramycin 저항성 유전자를 PCR로 증폭할 수 있는 약 1 kb 정도의 유전자를 토대로 primers를 (주)바이오니아에서 제작하여 확인하였고 seaR 유전자의 발현유무는 seaR 염기서열을 참조하여 SphI site를 포함하는 primers를 (주)바이오니아에서 제작하여 확인하였다(Table 1). PCR (GeneAmp PCR System 2400, Applied Biosystems)은 Prime STAR HS DNA Polymerase (TaKaRa)와 Go Taq Master Mix (Promega)를 이용하여 수행하였다. DNA 는 TAE 완충용액(40 mM Tris-acetate, 1 mM EDTA, pH 8.
- S. coelicolor A3(2)와 transformant [seaR-integrated S. coelicolor A3(2)]의 변화된 표현형을 확인하기 위하여 한국생명공학연구원 단백질산업기술개발센터에 의뢰를 하여 표현형 microarray (Biolog)를 사용하여 수행하였다. 표현형 microarray 는 1,920여 가지의 기질이 20장의 96-well plate에 포함되어 있기 때문에 wild type과 transformant 의 생육곡선의 비교를 통하여 표현형을 비교할 수 있는 microarray 방법이다.
- Sequencing은 DNA sequencer (MegaBASE500, GE Lifescience) ㅈ를 이용하거나 (주)솔젠트사에 의뢰하였고, 염기서열분석과 상동성 비교는 GENETYX-WIN (version 3.2, Software Development)과 NCBI DNA database를 이용하였다.
- 회수한 균체로부터 전체 RNA (RNeasy mini purification kit, Qiagen)를 추출하고 DNase I (TaKaRa)을 처리하여 chromosomal DNA를 제거하였다. cDNA를 합성하기에 앞서 DNase I을 처리한 전체 RNA내의 chromosomal DNA의 존재유무는 전체 RNA를 주형으로 사용하여 SeaR2 primers를 이용하여 PCR을 수행하여 확인하였다. DNase I으로 처리한 전체 RNA는 Superscript Ⅲ reverse transcriptase kit (Invitrogen)와 Random primers (Invitrogen)를 이용하여 cDNA로 합성하였다.
- 목적 유전자인 seaR 유전자는 Sacch. erythreae IFO 13426의 chromosomal DNA와 특이적으로 결합하도록 제작된 primer을 이용하여 PCR을 수행하고 1% agarose gel에 전기영동 후 615 bp 정도의 목적 DNA 단편인 seaR 유전자를 회수하였다(Fig. 1). 회수된 단편은 entry vector에 삽입하였으며, seaR 유전자가 삽입된 entry vector의 attL site와 destination vector의 attR site를 이용한 LR reaction으로 seaR 발현 벡터 (pEV615)를 제조(Fig.
- Sacch. erythreae 유래 seaR 유전자는 PCR을 통한 증폭을 위하여 GenBank accession number AB188088의 핵산 염기서열을 근거로 특이적인 primers를 (주)바이오니아에 의뢰하여 제작하였다. 접합전달에 의한 방선균의 형질전환 유무는 pSET152의 전체 염기서열 중 apramycin 저항성 유전자를 PCR로 증폭할 수 있는 약 1 kb 정도의 유전자를 토대로 primers를 (주)바이오니아에서 제작하여 확인하였고 seaR 유전자의 발현유무는 seaR 염기서열을 참조하여 SphI site를 포함하는 primers를 (주)바이오니아에서 제작하여 확인하였다(Table 1).
- coelicolor A3(2)의 일차대사(primary metabolism)에는 큰 역할을 하지 않는 것을 나타내는 것으로 이차대사에 영향이 있을 것으로 예상되었다. 또한 S. coelicolor A3(2)의 경우 방선균 연구에 있어서 모델균으로써 분자유전학적으로 많은 연구가 진행되어 왔으며 게놈 프로젝트를 통한 염기서열도 활용이 가능하므로 좀 더 자세한 표현형의 변화를 확인하고자 표현형 microarray를 수행하였다. PM은 1,920여 가지의 기질에 대한 wild type 및 transformant 의 성장 차이를 비교하는 실험으로써 빨간색으로 표시된 기질에서는 transformant 의 성장이 wild type 보다 빠른 것을 나타내는 것으로써 사용된 기질에서는 seaR 유전자의 발현으로 인하여 transformant의 성장이 빨라졌다는 것을 나타낸다.
- 본 연구에서는 이러한 제한 효소 인식 부위에 따른 발현 벡터 구축의 어려움을 해결하고자 gateway system (Invitrogen) 을 이용한 발현 벡터 구축 시스템을 확립하고자 하였다. 또한, 연구에서는 새롭게 구축한 gateway system을 사용하여 희소방선균 Saccharopolyspora erythraea의 receptor gene (seaR) 을 Streptomyces 속 Streptomyces coelicolor A3(2)에 삽입시킨 후 Streptomyces coelicolor A3(2) (transformant)과 wild type 균과의 표현형의 변화 관찰을 통하여 Streptomyces coelicolor A3(2) (transformant)의 seaR 단백질의 기능에 관하여 조사하였다.
- 목적 유전자인 seaR 유전자의 발현 벡터인 pEV615를 포함하는 공여균주 E. coli ET12567/pUZ8002는 apramycin (50 μg/ml;Am), chloramphenicol (25 μg/ml;Cm), kanamycin (50 μg/ml;Km)이 첨가된 LB 액체배지에 접종하여 600 nm에서 흡광도가 0.2–0.4가 될 때까지 37℃에서 배양한 후, 동량의 새로운 LB 액체 배지로 두 번 세척하고 최종적으로 0.1배의 새로운 LB 액체배지로 재현탁하여 S. coelicolor A3(2)를 접합전달을 위한 공여 균주로 사용하였다.
- 본 실험을 통하여 획득한 표현형 microarray 결과의 신뢰성을 확인하기 위하여 S. coelicolor A3(2)가 대표적으로 생산하는 tetracycline에 대한 감수성 검사를 수행하였다. 표현형 microarray에서 실험한 S.
- 2 배지에 계대배양하였으며 다시 Am (25 μg/ml)이 함유된 10 ml TSB 액체배지에 접종하고 배양하여 균체를 회수한 후 각각의 균체로부터 chromosomal DNA를 분리하였다. 분리된 chromosomal DNA는 통합 확인을 위해 pEV615 vector에 존재하는 apramycin 내성유전자와 특이적으로 결합하는 primer를 이용하여 PCR을 수행하였다. 1% agarose gel에 전기영동 한 결과 Fig.
- 방선균 염색체에 존재하는 attB site로 삽입된 seaR 유전자의 발현유무는 RT-PCR의 수행으로 알 수 있다. 선택된 각각의 transformant 배양액은 원심분리하여 균체를 회수하고 전체 RNA를 추출하였다. 전체 RNA와 함께 추출되는 chromosomal DNA는 DNase I을 처리하여 제거하였으며 전체 RNA로부터 cDNA를 합성한 후 seaR 유전자와 특이적으로 결합하는 primer를 이용하여 PCR을 수행하고 1% agarose gel에 전기영동 한 결과 Fig.
- erythreae 유래 seaR 유전자는 PCR을 통한 증폭을 위하여 GenBank accession number AB188088의 핵산 염기서열을 근거로 특이적인 primers를 (주)바이오니아에 의뢰하여 제작하였다. 접합전달에 의한 방선균의 형질전환 유무는 pSET152의 전체 염기서열 중 apramycin 저항성 유전자를 PCR로 증폭할 수 있는 약 1 kb 정도의 유전자를 토대로 primers를 (주)바이오니아에서 제작하여 확인하였고 seaR 유전자의 발현유무는 seaR 염기서열을 참조하여 SphI site를 포함하는 primers를 (주)바이오니아에서 제작하여 확인하였다(Table 1). PCR (GeneAmp PCR System 2400, Applied Biosystems)은 Prime STAR HS DNA Polymerase (TaKaRa)와 Go Taq Master Mix (Promega)를 이용하여 수행하였다.
- 접합전달을 통한 방선균의 형질전환 실험으로 S. coelicolor A3(2)를 숙주균으로 사용한 경우는 4개의 transformant를 선택하였으며 각각의 transformant에 대한 pEV615 vector의 정상적인 염색체내 통합을 확인하기 위해 Am (25 μg/ml)이 함유된 ISP No. 2 배지에 계대배양하였으며 다시 Am (25 μg/ml)이 함유된 10 ml TSB 액체배지에 접종하고 배양하여 균체를 회수한 후 각각의 균체로부터 chromosomal DNA를 분리하였다.
- DNase I으로 처리한 전체 RNA는 Superscript Ⅲ reverse transcriptase kit (Invitrogen)와 Random primers (Invitrogen)를 이용하여 cDNA로 합성하였다. 최종적으로 형질전환된 seaR 유전자의 발현 유무를 확인하기 위하여 cDNA를 주형으로 이용하여 PCR을 수행하였다.
- coelicolor A3(2)가 대표적으로 생산하는 tetracycline에 대한 감수성 검사를 수행하였다. 표현형 microarray에서 실험한 S. coelicolor A3(2)와 transformant의 항균제 감수성 결과 확인을 위하여 MIC 검사와 평판배지 디스크 확산법을 시행하였다. MIC 검사결과 Table 2에서 나타낸 것처럼 tetracycline에 대한 MIC의 농도가 wild type보다 50% 낮아진 것을 보였으며(Table 2), 이는 transformant의 tetracycline에 대한 감수성이 높아진 것을 확인하였다.
- 항균제 존재에 의해 세균의 성장이 저해되면서 생기는 탁도의 변화를 Transmittance Optical System이 15분마다 카드를 읽어 탁도를 측정하고 측정된 수치는 Vitek II 전용 프로그램의 알고리즘에 의해 분석되어 항균제 존재 시의 세균 성장여부를 판정한다. 프로그램상의 판정 기준에 따라 균이 검사한 항생제에 감수성이 있는지 여부를 판정하고 MIC를 검사하였다. Disk diffusion test는 각각의 균액을 MacFaland 탁도 1.
- 0에 맞추어 초미량의 각종 건조 항균제가 들어있는 microwell로 구성된 플라스틱 카드 (AST-P601 card)에 접종한 후 28℃에 24시간 배양하여 장비에 장착하였다. 항균제 존재에 의해 세균의 성장이 저해되면서 생기는 탁도의 변화를 Transmittance Optical System이 15분마다 카드를 읽어 탁도를 측정하고 측정된 수치는 Vitek II 전용 프로그램의 알고리즘에 의해 분석되어 항균제 존재 시의 세균 성장여부를 판정한다. 프로그램상의 판정 기준에 따라 균이 검사한 항생제에 감수성이 있는지 여부를 판정하고 MIC를 검사하였다.
- 항생물질 생산 실험은 20 ml의 YEME, TSB, 또는 SV 배지를 사용하여 각각의 포자현탁액을 1×106 CFU/ml가 되도록 접종하고 28℃, 120 rpm에서 36–48시간 진탕 배양한 균체를 -70℃에서 보존하여 전배양균으로 사용하였다.
- 형질전환을 통하여 선발된 각각의 형질전환체(transformant) 는 20 ml의 TSB 배지에 포자현탁액(1×106 CFU/ml)을 접종하여, 28℃, 120 rpm에서 10, 12, 14시간 진탕배양 후 배양액을 시험관에 넣어 원심분리하여 균체를 회수하였다.
- 1). 회수된 단편은 entry vector에 삽입하였으며, seaR 유전자가 삽입된 entry vector의 attL site와 destination vector의 attR site를 이용한 LR reaction으로 seaR 발현 벡터 (pEV615)를 제조(Fig. 2)한 다음, 이를 E. coli ET12567/pUZ800에 형질전환 하였다. 형질전환된 균으로부터 plasmid DNA를 분리하여 전기영동 한 결과 Fig.
- CFU/ml)을 접종하여, 28℃, 120 rpm에서 10, 12, 14시간 진탕배양 후 배양액을 시험관에 넣어 원심분리하여 균체를 회수하였다. 회수한 균체로부터 전체 RNA (RNeasy mini purification kit, Qiagen)를 추출하고 DNase I (TaKaRa)을 처리하여 chromosomal DNA를 제거하였다. cDNA를 합성하기에 앞서 DNase I을 처리한 전체 RNA내의 chromosomal DNA의 존재유무는 전체 RNA를 주형으로 사용하여 SeaR2 primers를 이용하여 PCR을 수행하여 확인하였다.
- 그러므로 non-host에 autoregulator receptor 혹은 pleiotropic regulator의 발현은 이차대사산물 혹은 새로운 대사화합물의 효율적인 생산을 유도할 것으로 기대된다. 희소방선균 Saccharopolyspora erythreae 으로부터 receptor (seaR) 유전자의 기능을 연구하기 위해 다른 속의 균주인 Streptomyces coelicolor A3(2)로 seaR 유전자를 삽입하여 형질전환하였다. S.
대상 데이터
- 전배양 및 항생물질 생산배지로는 YEME (Yeast Extract-malt Extract), TSB (Tryptic Soy Broth) 또는 SV 배지를 사용하였고, 실험에서 이용한 모든 방선균의 chromosomal DNA 추출을 위한 액체배양은 TSB 배지를 사용하였다. E. coli 및 공여균주의 일반 배양 및 형질전환에는 LB (Luria Bertani) 배지를 사용하였다. 항생물질 생산 실험은 20 ml의 YEME, TSB, 또는 SV 배지를 사용하여 각각의 포자현탁액을 1×106 CFU/ml가 되도록 접종하고 28℃, 120 rpm에서 36–48시간 진탕 배양한 균체를 -70℃에서 보존하여 전배양균으로 사용하였다.
- coelicolor A3(2)의 접합전달용 공여균주로 사용하였다. Entry vector (pENTR/D-TOPO Cloning Kit, Invitrogen)는 목적 유전자의 클로닝을 위하여 사용되었으며, destination vector는 Choi 등(2004)에 의해 제조된 pSET152 (Bierman et al., 1992) 유래의 vector를 사용하였다. 최종적으로 LR reaction을 통한 seaR 발현벡터를 제조하기 위하여 gateway LR clonase enzyme mixture (Invitrogen)가 사용되었다.
- S. coelicolor A3(2)와 transformant (seaR-integrated S. coelicolor A3(2))의 배양에는 SFM (Soy Flour Mannitol) 배지 또는 ISP No. 2 (BD Science) 배지를 사용하였고, 계대배양을 위해 ISP No. 2 배지를 사용하였다(Kieser et al., 2000). 전배양 및 항생물질 생산배지로는 YEME (Yeast Extract-malt Extract), TSB (Tryptic Soy Broth) 또는 SV 배지를 사용하였고, 실험에서 이용한 모든 방선균의 chromosomal DNA 추출을 위한 액체배양은 TSB 배지를 사용하였다.
- 본 연구는 방선균 유전자 연구의 모텔 미생물인 Streptomyces coelicolor A3(2)를 숙주균으로 사용하였다. 목적 유전자인 seaR 유전자는 Saccharopolyspora erythreae IFO 13426의 chromosomal DNA를 이용하여 PCR방법으로 증폭 후 회수하였고, E. coli ET12567/pUZ8002 (Kieser et al., 2000)는 S. coelicolor A3(2)의 접합전달용 공여균주로 사용하였다. Entry vector (pENTR/D-TOPO Cloning Kit, Invitrogen)는 목적 유전자의 클로닝을 위하여 사용되었으며, destination vector는 Choi 등(2004)에 의해 제조된 pSET152 (Bierman et al.
- 본 연구는 방선균 유전자 연구의 모텔 미생물인 Streptomyces coelicolor A3(2)를 숙주균으로 사용하였다. 목적 유전자인 seaR 유전자는 Saccharopolyspora erythreae IFO 13426의 chromosomal DNA를 이용하여 PCR방법으로 증폭 후 회수하였고, E.
- , 2000). 전배양 및 항생물질 생산배지로는 YEME (Yeast Extract-malt Extract), TSB (Tryptic Soy Broth) 또는 SV 배지를 사용하였고, 실험에서 이용한 모든 방선균의 chromosomal DNA 추출을 위한 액체배양은 TSB 배지를 사용하였다. E.
- 제조된 pEV615는 oriT, attP, ermEp과 seaR 유전자 단편을 가지고 있는 bacteriophage ΦC31 유래의 integration vector이다.
- 항생물질 생산 실험은 20 ml의 YEME, TSB, 또는 SV 배지를 사용하여 각각의 포자현탁액을 1×106 CFU/ml가 되도록 접종하고 28℃, 120 rpm에서 36–48시간 진탕 배양한 균체를 -70℃에서 보존하여 전배양균으로 사용하였다. 항생물질 생산 검정균으로는 Bacillus subtilis PCI 219를 사용하였고 검정균의 생육배지로 NA (Nutrient Agar) 배지를 사용하였다. 실험에 사용한 모든 시약은 Difco Laboratories Co.
이론/모형
- Disk diffusion test는 각각의 균액을 MacFaland 탁도 1.0에 맞추어 Mueller Hinton Agar (BD Science)에 접종하여 tetracycline disc (30 μg, BD Science)를 사용하여 CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) 지침에 따라 검사 하였다.
- E. coli에서 S. coelicolor A3(2)로 plasmid의 접합전달은 Kieser 등(2000)이 확립한 방법에 따라 수행하였다. 목적 유전자인 seaR 유전자의 발현 벡터인 pEV615를 포함하는 공여균주 E.
- , 1989)으로 제조하였다. Plasmid DNA의 분리는 FlexiPrep kit (GE Lifescience) 및 alkaline-SDS 추출법(Sambrook et al., 1989)을 사용하였으며, 모든 제한효소, 수식효소 및 전기영동용 DNA 마커는 TaKaRa 제품을 사용하였다.
- S. coelicolor A3(2)의 형질전환은 oriT, attP, ermEp*과 seaR gene 단편을 가지고 있는 ΦC31 유래의 integration vector인 pEV615 (6.6 kb)를 이용하여 Escherichia coli ET12567/pUZ8002를 DNA 공여체로 이용한 접합전달법을 사용하여 확립하였다.
- 6 kb)를 이용하여 Escherichia coli ET12567/pUZ8002를 DNA 공여체로 이용한 접합전달법을 사용하여 확립하였다. seaR 유전자의 삽입 유무는 PCR방법으로 확인하였고, seaR 유전자의 전사 발현은 RT-PCR방법으로 확인하였다. S.
- 방선균의 chromosomal DNA 분리는 Hopwood 방법 (Kieser et al., 2000)에 따라 실행하였고, E. coli DH5α competent cell은 Hanahan 방법(Sambrook et al., 1989)으로 제조하였다.
성능/효과
- 분리된 chromosomal DNA는 통합 확인을 위해 pEV615 vector에 존재하는 apramycin 내성유전자와 특이적으로 결합하는 primer를 이용하여 PCR을 수행하였다. 1% agarose gel에 전기영동 한 결과 Fig. 4와 같이 약 1 kb의 apramycin 내성유전자의 증폭이 확인되었다.
- MIC 검사결과 Table 2에서 나타낸 것처럼 tetracycline에 대한 MIC의 농도가 wild type보다 50% 낮아진 것을 보였으며(Table 2), 이는 transformant의 tetracycline에 대한 감수성이 높아진 것을 확인하였다. Fig. 7에서 나타낸 것처럼 평판배지 디스크 확산법의 경우도 transformant의 tetracycline에 대한 억제대가 wild type 보다 상대적으로 큰것을 확인하였다. Wild type과 transformant를 이용한 항균제 감수성 검사 결과는 표현형 microarray 결과와 일치하는 것을 확인하였다.
- coelicolor A3(2)와 transformant의 항균제 감수성 결과 확인을 위하여 MIC 검사와 평판배지 디스크 확산법을 시행하였다. MIC 검사결과 Table 2에서 나타낸 것처럼 tetracycline에 대한 MIC의 농도가 wild type보다 50% 낮아진 것을 보였으며(Table 2), 이는 transformant의 tetracycline에 대한 감수성이 높아진 것을 확인하였다. Fig.
- TSB 액체배지나 YEME 액체배지를 사용한 S. coelicolor A3(2)와 transformant 의 일반적인 성장 패턴 비교 실험에서는 두 균의 차이가 거의 없음을 확인하였다(자료 미제시). 이는 seaR 유전자의 지속적인 발현이 S.
- 7에서 나타낸 것처럼 평판배지 디스크 확산법의 경우도 transformant의 tetracycline에 대한 억제대가 wild type 보다 상대적으로 큰것을 확인하였다. Wild type과 transformant를 이용한 항균제 감수성 검사 결과는 표현형 microarray 결과와 일치하는 것을 확인하였다. 이 결과를 통하여 transformant에서 seaR 유전자의 지속적인 발현이 tetracycline 생성 기작 또는 tetracycline 내성 유전자의 발현 억제를 통한 표현형의 변화라고 생각된다.
- Wild type과 transformant를 이용한 항균제 감수성 검사 결과는 표현형 microarray 결과와 일치하는 것을 확인하였다. 이 결과를 통하여 transformant에서 seaR 유전자의 지속적인 발현이 tetracycline 생성 기작 또는 tetracycline 내성 유전자의 발현 억제를 통한 표현형의 변화라고 생각된다.
- 증폭된 단편이 seaR 유전자 유래의 단편인지 확인을 위하여 10시간째 단편을 각각 아가로즈 겔로부터 회수한 후 클로닝하여 염기서열을 분석한 결과 seaR 유전자 유래의 단편임을 확인하였다. 이러한 결과로부터 transformant 에 삽입된 pEV615 발현 벡터로부터 seaR 유전자가 지속적으로 발현되고 있음을 확인하였다.
- 사용된 기질에서 노란색은 두 균주의 성장이 같다는 것을 나타낸다. 이와 같이 표현형 microarray 결과에서 두 균의 성장 차이가 50% 이상인 조건을 확인한 결과 tetracycline 항생제 기질에 대하여 wild type이 transformant에 비해 빠르게 성장하는 것을 확인 할 수 있었다 (Fig. 6) 이러한 결과로 미루어볼때, 기존에 tetracycline의 생산 및 내성활성을 가진 S. coelicolor A3(2)에 seaR 유전자의 삽입으로 tetracycline에 대한 생산 및 내성활성을 억제시키는 것이라 예상할 수 있다. 종합적으로 볼 때 특정 기질에 대한 wild type 또는 transformant 의 표현형의 변화를 설명하는 것으로써 seaR 유전자의 발현으로 인하여 특정 생합성 유전자들의 발현이 억제되거나 또는 상위 레벨 조절 유전자들의 발현 억제를 통한 상위 레벨 조절 유전자의 지배를 받는 유전자들의 활성화에 의한 변화라는 것을 예상할 수 있다.
- 선택된 각각의 transformant 배양액은 원심분리하여 균체를 회수하고 전체 RNA를 추출하였다. 전체 RNA와 함께 추출되는 chromosomal DNA는 DNase I을 처리하여 제거하였으며 전체 RNA로부터 cDNA를 합성한 후 seaR 유전자와 특이적으로 결합하는 primer를 이용하여 PCR을 수행하고 1% agarose gel에 전기영동 한 결과 Fig. 5와 같이 각각의 transformant 로부터 샘플링 시간대별로 일정하게 발현되는 약 450 bp의 DNA 단편을 확인할 수 있었다. 증폭된 단편이 seaR 유전자 유래의 단편인지 확인을 위하여 10시간째 단편을 각각 아가로즈 겔로부터 회수한 후 클로닝하여 염기서열을 분석한 결과 seaR 유전자 유래의 단편임을 확인하였다.
- coelicolor A3(2)에 seaR 유전자의 삽입으로 tetracycline에 대한 생산 및 내성활성을 억제시키는 것이라 예상할 수 있다. 종합적으로 볼 때 특정 기질에 대한 wild type 또는 transformant 의 표현형의 변화를 설명하는 것으로써 seaR 유전자의 발현으로 인하여 특정 생합성 유전자들의 발현이 억제되거나 또는 상위 레벨 조절 유전자들의 발현 억제를 통한 상위 레벨 조절 유전자의 지배를 받는 유전자들의 활성화에 의한 변화라는 것을 예상할 수 있다.
- 5와 같이 각각의 transformant 로부터 샘플링 시간대별로 일정하게 발현되는 약 450 bp의 DNA 단편을 확인할 수 있었다. 증폭된 단편이 seaR 유전자 유래의 단편인지 확인을 위하여 10시간째 단편을 각각 아가로즈 겔로부터 회수한 후 클로닝하여 염기서열을 분석한 결과 seaR 유전자 유래의 단편임을 확인하였다. 이러한 결과로부터 transformant 에 삽입된 pEV615 발현 벡터로부터 seaR 유전자가 지속적으로 발현되고 있음을 확인하였다.
- coli ET12567/pUZ800에 형질전환 하였다. 형질전환된 균으로부터 plasmid DNA를 분리하여 전기영동 한 결과 Fig. 3A에서 보는 바와 같이 4.4 kb 위치에 나타났고, 분리된 plasmid DNA를 ClaI으로 처리한 결과 1.1 kb 및 5.5 kb의 2개의 단편이 확인되었으며, 제조된 seaR 발현 벡터를 pEV615 (6.6 kb)라고 명명하였다(Fig. 3B). 제조된 pEV615는 oriT, attP, ermEp과 seaR 유전자 단편을 가지고 있는 bacteriophage ΦC31 유래의 integration vector이다.
후속연구
- 특히, 표현형 microarray 실험에 나타난 tetracycline 항생제 기질에 대하여 wild type이 transformant 에 비해 빠르게 성장하는 것은 항균제 감수성 검사와 일치하였다. 이는 tetracycline 생합성 유전자 및 내성 유전자의 발현 억제에 따른 변화라고 예상할 수 있으며 이를 위하여 tetracycline 생합성 관련 유전자 및 내성 유전자의 발현 패턴 분석등과 같은 분자 수준에서의 연구가 필요할 것으로 생각된다.
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