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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 국내의 소형견 장관으로부터 생균제용 유산균인 Lactobacillus, Enterococcus, Bifidobacterium 속 균주를 분리하고, 생균제가 갖추어야 할 특성 조사와 함께, 면역활성 검증을 통해 개 생균제로 사용하기에 가장 적합한 유산균을 선발, 평가하는 것을 연구의 목적으로 하였다.
제안 방법
- Caco-2 cell monolayer가 형성된 4- well chamber slide에 유산균(0.5 mL; 1.0 × 109CFU/mL in PBS)을 접종하고, 5개의 Caco-2 cell 당 부착한 유산균 수의 평균값을 계산하였다.
- IL-1β와 TNF-α 생산량은 ELISA kit(eBioscience, USA)를 이용하여 측정하였다.
- InvivoGen(USA)의 RAW BLUE cell은 nuclear factor-κB (NF-κB)를 측정하기 위한 세포로 위의 RAW 264.7 cell과 동일한 조건에서 배양하였고, 4~5회 계대 후 Zeocin (InvivoGen) 항생제를 처리 후 사용하였다.
- Lactobacillus 선택 배지인 LBS와 MRS, Enterococcus 선택 배지인 TATAC, Bifidobacterium 선택 배지인 BS와 비선택 배지인 BL 배지에 멸균된 diluent A(KH2PO4 4.5 g, Na2HPO4 6.0 g, L-cystein·HCl·H2O 0.5 g, Tween 80 0.5 g, Agar 1.0 g/1,000 mL DW)를 사용하여 각각 10배 단계 희석하여 도말하였다.
- 0 × 109CFU/mL in PBS)을 접종하고, 5개의 Caco-2 cell 당 부착한 유산균 수의 평균값을 계산하였다. Lactococcus lactis NIAI 527 (Meiji, Japan)과 Lactobacillus acidophilus KCTC 3111을 각각 양성 및 음성 대조군 균주로 사용하여, 부착능 음성 및 양성으로 판정하였다 [17, 25].
- NF-κB 생성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 RAW BLUE cells을 96 well plate의 각 well당 5.0 × 105 cell/mL 가 되도록 분주하여 2시간 안정화한 후, 새로운 DMEM 배지로 교체하였다.
- NO의 농도는 Griess reagent system(Promega, USA) 을 사용하여 측정하였다. 96-well plate에 배양액 50 µL를 넣고 Griess reagent I(NED solution)과 Griess reagent II (Sulfanilamide solution)를 동량으로 혼합한 후, 암실에서 10분간 반응하고 30분 이내에 microplate reader(Tecan, Austria)를 이용하여 540 nm에서 측정하였다.
- NO의 농도는 아질산나트륨의 표준곡선(0~100 μM)을 이용하여 계산하였다 [8].
- 내산성 균주로 판정된 유산균을 대상으로 0.3%, 0.5%, 1.0% Oxgall(pH 7.0; Difco, USA)이 첨가된 BHI broth에 유산균 배양액을 1%씩 접종하고 2시간 동안 배양한 후, BL medium에 도말하고 배양하여 생존한 균주를 내담즙성 균주로 판정하였다 [25, 27].
- 내산성 유산균을 선발하기 위하여 분리된 Lactobacillus, Enterococcus 및 Bifidobacterium을 L-cysteine(Junsei Chemical, Japan)이 0.05% 첨가된 BHI broth(pH 7.0)에 접종하여 37°C에서 24시간 배양하였다.
- 내산성과 내담즙성 균주 중에서 선발한 유산균을 L-cysteine(Junsei Chemical)이 0.05% 첨가된 BHI broth(pH 7.0)에 접종, 배양 후, 배양액을 50°C, 60°C, 70°C에 각각 5분간 노출시킨 후, BL medium에 도말하여 37°C에서 48시간 배양 후 집락이 형성된 균주는 내열성 균주로 판정하였다 [5, 25].
- 병원균 억제능을 검사하기 위하여 Flemming 등 [12]에 의해 언급된 agar spot assay를 변형하여 사용하였다. Agar spot assay의 병원균으로는 Escherichia coli KCTC 1682, Salmonella Enteritidis KCCM 12021, Staphylococcus aureus KCTC 1621, Listeria monocytogenes KCTC 3569균주의 4종류를 사용하였다.
- 본 실험에서는 개에서 분리된 Lactobacillus, Enterococcus, Bifidobacterium 속 균주 중에서 내산성, 내담즙성, 내열성, 병원성 억제능 등 생균제로서의 특성이 가장 우수한 상위 4개 균주씩, 합계 12개 균주를 대상으로 NO, TNF-α, IL-1β, NF-κB와 같은 면역활성 지표를 측정하고, 면역활성이 뛰어난 것으로 잘 알려진 상업용 균주인 LGG균주와 비교하였다.
- 분리된 Lactobacillus, Enterococcus, Bifidobacterium 속 균주 중에서 내산성, 내담즙성, 내열성, 병원성 억제능, 장관부착능 등이 가장 우수한 상위 균주를 각각 4개씩 선발하여 합계 12개 균주를 대상으로 면역활성능을 측정하였다.
- 선택 및 비선택 배지에서 유산균의 전형적인 집락을 선발하여 BL medium에 계대한 후, 37°C, 48시간 배양하였다.
- 유산균주가 NF-κB pathway를 활성화시키는지 확인하기 위하여 secreted alkaline phosphatase reporter gene이 안정적으로 transfection된 RAW BLUE cells(InvivoGen)을 사용하였다.
- 5의 BHI broth에 1% 접종하고, 37°C에서 2시간 동안 배양하였다. 이후 균주의 생존여부를 확인하기 위하여 배양균주를 BL medium에 도말하여 배양한 후, 생존한 균주를 내산성 균주로 판정하였다 [25].
- 최종 선발 균주는 16s rRNA sequencing 분석(SolGent, Korea)을 통해 동정하였다.
대상 데이터
- 병원균 억제능을 검사하기 위하여 Flemming 등 [12]에 의해 언급된 agar spot assay를 변형하여 사용하였다. Agar spot assay의 병원균으로는 Escherichia coli KCTC 1682, Salmonella Enteritidis KCCM 12021, Staphylococcus aureus KCTC 1621, Listeria monocytogenes KCTC 3569균주의 4종류를 사용하였다. 각 병원균과 유산균은 BBL BHI broth (Becton, Dickinson and Company)에서 37°C, 24시간 배양하여 접종액으로 사용하였다.
- 05%(w/v)로 첨가한 MRS broth (Difco) 5 mL에 접종하여 혐기적으로 37°C, 24시간 배양하였다. Caco-2 cell(한국세포주은행, 대한민국)은 20% inactivated fecal calf serum(Gibco-BRL, USA)과 0.2% penicillin/streptomycin(10,000 U/mL, Gibco-BRL)을 첨가한 DMEM(Gibco-BRL)에서 CO2 incubator(95% air, 5% CO2)를 사용하여 37oC에서 배양하였다. Caco-2 cell monolayer가 형성된 4- well chamber slide에 유산균(0.
- 충북 청주시 근교 가정집과 애견센터에서 사육하는 건강한 포유자견(2~4주령) 7마리, 이유자견(2~3개월령) 7마리, 성견(1~6세) 6마리의 합계 20마리를 유산균 분리용 공시 동물로 사용하였다. 품종은 Pomeranian, Maltese, Shih Tzu, 잡종견 등을 사용하였다.
- 충북 청주시 근교 가정집과 애견센터에서 사육하는 건강한 포유자견(2~4주령) 7마리, 이유자견(2~3개월령) 7마리, 성견(1~6세) 6마리의 합계 20마리를 유산균 분리용 공시 동물로 사용하였다. 품종은 Pomeranian, Maltese, Shih Tzu, 잡종견 등을 사용하였다.
- 한국세포주은행으로부터 분양받은 murine macrophage 세포인 RAW 264.7 cell을 10% fetal bovine serum과, 100 unit/mL의 streptomycin과 penicillin이 첨가된 DMEM 배지를 사용하여 37°C, 5% CO2 조건에서 배양하고 NO 및 cytokine 생성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 사용하였다.
데이터처리
- 일원배치 분산분석(ANOVA)으로 평균과 표준편차를 분석하였으며, 사후 검정을 위해 Duncan test (p < 0.05)를 실시하였다.
이론/모형
- IL-1β와 TNF-α 생산량은 ELISA kit(eBioscience, USA)를 이용하여 측정하였다. Sandwich ELISA 방법을 사용하였으며, 측정 방법은 제조사의 지침에 따라 진행하였다. 측정 시료는 microplate reader(Tecan)를 이용하여 450 nm 파장에서 3회 반복 측정하였다 [1, 8].
- 선택 및 비선택 배지에서 유산균의 전형적인 집락을 선발하여 BL medium에 계대한 후, 37°C, 48시간 배양하였다. 배양된 집락은 Mitsuoka 방법에 의해 Lactobacillus, Enterococcus, Bifidobacterium으로 분리, 동정하였다. 분리된 유산균은 혐기 상태에서 BL medium에 계대하여 37°C에 보관하며, 다음 실험에 사용하였다 [18, 20, 25].
성능/효과
- 7%)가 부착능을 보여 가장 높은 결과를 나타내었다. Bifidobacterium 속 4개 균주는 50%, Lactobacillus 속 8개 균주는 3개 균주만이 부착능 결과를 나타내었다.
- Caco-2 cell을 사용한 유산균주의 부착능 검사를 시행한결과 Table 1에서와같이 Enterococcus 12개 균주 중 8개 균주(66.7%)가 부착능을 보여 가장 높은 결과를 나타내었다. Bifidobacterium 속 4개 균주는 50%, Lactobacillus 속 8개 균주는 3개 균주만이 부착능 결과를 나타내었다.
- 5%의 높은 항균활성을 나타내었다. Enterococcus 12개 균주는 Salmonella Enteritidis KCCM 12021, Staphylococcus aureus KCTC 1916균주에 대해 100% 항균활성을 나타내었고 나머지 2종류 병원균에 대해서도 91.7%의 매우 높은 항균활성을 나타내었다. 그러나 Bifidobacterium 속 4개 균주는 4종류 병원균에 대해 25.
- IL-1β 측정 결과는 Enterococcus균주 중에서 S33, S17균주의 생성량이 많았지만, LGG균에 유의적인 증가는 나타내지 않았다.
- 6 pg/mL보다 유의적으로 증가 하였다. Lactobacillus도 4개 균주 모두 유의적인 증가세를 보였으며, 그중에서 L10균주가 101 pg/mL의 가장 높은 결과를 보였다. 그러나 Bifidobacterium균주는 B3와 B6균주만이 LGG에 비해 유의적인 증가를 나타내었으며, B3가 100.
- NF-κB 흡광도 측정결과, 면역활성을 측정한 12개 균주 중에서 S36, B1, B9의 3개 균주를 제외한 모든 균주가 LGG 균주에 비해 유의적인 증가결과를 나타내었다.
- NO 생성량의 경우 Enterococcus S33균주(6.3 μM/mL), Lactobacillus L10균주(11.6 μM/mL), L31균주(82.8 μM/mL), Bifidobacterium B3균주(5.9 μM/mL)의 NO 생성량이 면역증진 효과가 입증된 상업용 균주인 Lactobacillus rhamnosus GG(LGG)의 2.5 μM/mL보다 유의적인 증가 결과를 나타내었다(Fig. 1).
- TNF-α 측정결과 Enterococcus S33, S17, S45, S36 4개 균주 모두 LGG의 24.6 pg/mL보다 유의적으로 증가 하였다.
- 개의 분변으로부터 분리된 총 101개 균주를 대상으로 내산성 시험을 실시한 결과 Table 1에서와 같이 Enterococcus 47개 균주 중 32개 균주(68.1%)가 pH 2.5, 2시간에서 내산성을 나타내었다. 그러나 Lactobacillus 속 45개 균주 중 8개 균주(17.
- 본 실험에서는 개에서 분리된 Lactobacillus, Enterococcus, Bifidobacterium 속 균주 중에서 내산성, 내담즙성, 내열성, 병원성 억제능 등 생균제로서의 특성이 가장 우수한 상위 4개 균주씩, 합계 12개 균주를 대상으로 NO, TNF-α, IL-1β, NF-κB와 같은 면역활성 지표를 측정하고, 면역활성이 뛰어난 것으로 잘 알려진 상업용 균주인 LGG균주와 비교하였다. 그 결과 Lactobacillus L10, Enterococcus S33, Bifidobacterium B3의 3개 균주가 생균제로서의 특성은 물론이고 면역활성까지 모두 갖춘 최적의 개 생균제용 유산균주로 판단되었다.
- 7%의 매우 높은 항균활성을 나타내었다. 그러나 Bifidobacterium 속 4개 균주는 4종류 병원균에 대해 25.0%~50.0%의 비교적 낮은 항균활성만을 나타내었다(Table 1).
- Lactobacillus도 4개 균주 모두 유의적인 증가세를 보였으며, 그중에서 L10균주가 101 pg/mL의 가장 높은 결과를 보였다. 그러나 Bifidobacterium균주는 B3와 B6균주만이 LGG에 비해 유의적인 증가를 나타내었으며, B3가 100.2 pg/mL의 생성량을 나타내었다.
- 현재 국내외적으로 개 생균제용 유산균주에 관한 많은 연구보고는 이루어지지 않았지만, Strompfová 등 [31]이 보고한 Enterococcus faecalis EE4균주와 Enterococcus faecium EF01균주는 본 실험에서 최종 선발된 Enterococcus faecium S33균주에 비해, 박테리오신 생성능, 항생제 감수성 등을 추가로 보고하고 있다. 그러나 내산성(pH 3.0, 3 h), 내담즙성 (1% bile), 장관 부착성, 항균활성 등의 기본 특성은 선발 균주와 비슷한 결과를 나타내었고, 반대로 선발 균주는 내열성, 면역활성 등의 우수한 특성이 있었다. 또한 개 유래의 생균제로 우수성을 보고한 Lactobacillus fermentum AD1균주 [30]와 최종 선발 균주인 Lactobacillus reuteri L10균주의 특성을 비교해보면, 내산성, 내담즙성, 장관 부착성에서는 비슷한 특성 결과를 나타내었지만, 본 실험의 선발 균주는 Lactobacillus fermentum AD1균주에서 없는 매우 우수한 면역활성 능력을 나타내었다는 특징을 갖고 있었다.
- 내산성, 내담즙성, 내열성이 우수한 유산균주를 대상으로 4종류 병원성 세균에 대한 병원성 억제능을 평가한 결과, Lactobacillus 속 8개 균주는 Salmonella Enteritidis KCCM 12021균주에 대해 100% 항균활성을 나타내었으며, 나머지 병원균 3종류에 대해서도 75%~87.5%의 높은 항균활성을 나타내었다. Enterococcus 12개 균주는 Salmonella Enteritidis KCCM 12021, Staphylococcus aureus KCTC 1916균주에 대해 100% 항균활성을 나타내었고 나머지 2종류 병원균에 대해서도 91.
- 내산성과 내담즙성 균주 중에서 선발된 유산균을 대상으로 70℃에서 5분간 내열성을 확인한 결과 Table 1에서와 같이, Lactobacillus, Enterococcus, Bifidobacterium 균주는 각각 4/8(50%), 19/32(59.4%), 2/4(50%)의 내열성을 나타내었다. 그러나 60℃, 5분의 낮은 열처리 조건에서는 각각 5/8(62.
- 따라서 면역활성을 측정한 12개 균주 중에서 가장 우수한 결과를 보인 Lactobacillus L10, Enterococcus S33, Bifidobacterium B3의 3개 균주가 생균제로서의 특성과 면역활성모두 갖춘 최적의 개 생균제용 유산균주로 판단되었다.
- 0, 3 h), 내담즙성 (1% bile), 장관 부착성, 항균활성 등의 기본 특성은 선발 균주와 비슷한 결과를 나타내었고, 반대로 선발 균주는 내열성, 면역활성 등의 우수한 특성이 있었다. 또한 개 유래의 생균제로 우수성을 보고한 Lactobacillus fermentum AD1균주 [30]와 최종 선발 균주인 Lactobacillus reuteri L10균주의 특성을 비교해보면, 내산성, 내담즙성, 장관 부착성에서는 비슷한 특성 결과를 나타내었지만, 본 실험의 선발 균주는 Lactobacillus fermentum AD1균주에서 없는 매우 우수한 면역활성 능력을 나타내었다는 특징을 갖고 있었다. 그러나 본 실험에서는 최종 선발 균주를 사용한 동물 임상 효능 실험을 아직 시행하지 않았기 때문에 추후 개를 대상으로 한 효능 실험이 진행되어야 할 것으로 판단되었다.
- 따라서 우수한 특성을 가진 유산균주를 생균제용 균주로 사용하기 위해서는 먼저 내산성과 내담즙성의 특성을 갖추어야 한다 [22]. 본 실험 결과 Enterococcus 47개 균주는 pH 2.5에서 32개 균주(68.1%)가 강한 내산성을 보였지만, Lactobacillus 45개 균주는 17.8%, Bifidobacterium은 11.1%만이 내산성을 나타내어 비교적 낮은 내산성 균주임을 알 수 있었다. Strompfová 등 [31]의 연구에 의하면 개에서 분리한 Enterococcus 속 세균의 76~87%가 pH 3.
- Bifidobacterium 속 세균은 60℃, 5분간 반응시킨 결과 31개의 균주 중 8개의 균주만이 내열성을 보인 것으로 확인되기도 하였다 [28]. 본 실험에서 Enterococcus는 60℃, 5분에서 87.5%, 70℃, 5분에서 59.4%가 내열성을 보였으며, Lactobacillus와 Bifidobacterium는 시험 균주의 50%가 70℃, 5분에서 내열성을 보였다.
- 유산균의 병원성 억제능에 관한 많은 연구에서 Lactobacillus, Enterococcus, Bifidobacterium 등의 유산균은 Salmonella Typhimurium, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Listeria monocytogenes 등에 대한 억제능이 보고되었다 [32, 35]. 본 실험에서 시행한 병원성 억제능 결과, Enterococcus 의 경우 12개 균주 중 10개 균주가, Lactobacillus는 8개 균주 중 3개의 균주가 4가지 병원균 모두에 대해 억제능을 나타내었지만, Bifidobacterium은 4가지 병원균 모두에 억제능이 있는 균이 존재하지 않았다. 이와 같은 결과는 Enterococcus, Lactobacillus의 산 생성 능력이 Bifidobacterium에 비해 뛰어난 것으로 추측된다.
- 본 연구에서는 총 20마리 개의 분변에서 유산균 101개 균주를 분리하였는데, Enterococcus가 47개 균주(46.5%), Lactobacillus가 45개 균주(44.6%)로 대부분을 차지하였으며 Bifidobacterium 속은 9개 균주로 8.9%에 불과하였다. 이와 같은 결과는 16S rRNA gene pyrosequencing 방법을 사용하여 건강한 개의 장내세균총을 분석하였을 때 Bifidobacterium 속 세균은 우점종으로 항상 검출되지 않는다는 Handl 등 [14]의 연구결과와 일치하고 있다.
- 분리된 총 101개 균주의 내담즙성을 확인한 결과, Bifidobacterium 속 1개 균주만이 1% Oxgall에서 사멸하였고, 나머지 모든 균주는 0.3%, 0.5%, 1.0% Oxgall에서 내담즙성을 나타내었다(Table 1).
- 총 20마리 개의 분변에서 분리된 유산균은 총 101개 균주였으며, 그중에서 Enterococcus 속 균주가 47개 균주 (46.5%)로 가장 많이 분리되었으며, Lactobacillus 속 균주도 45개 균주(44.6%)가 분리되었다. 그러나 편성혐기성 유산균인 Bifidobacterium 속 균주는 9개 균주(8.
- 최종 선발 균주인 Lactobacillus L10, Enterococcus S33, Bifidobacterium B3균주는 16s rRNA sequence 분석 결과 Lactobacillus reuteri L10(99%), Enterococcus faecium S33 (99%), Bifidobacterium longum B3(99%)로 각각 최종 동정되었으며, 그 생균제적 특성은 Table 2에 나타내었다.
후속연구
- 또한 개 유래의 생균제로 우수성을 보고한 Lactobacillus fermentum AD1균주 [30]와 최종 선발 균주인 Lactobacillus reuteri L10균주의 특성을 비교해보면, 내산성, 내담즙성, 장관 부착성에서는 비슷한 특성 결과를 나타내었지만, 본 실험의 선발 균주는 Lactobacillus fermentum AD1균주에서 없는 매우 우수한 면역활성 능력을 나타내었다는 특징을 갖고 있었다. 그러나 본 실험에서는 최종 선발 균주를 사용한 동물 임상 효능 실험을 아직 시행하지 않았기 때문에 추후 개를 대상으로 한 효능 실험이 진행되어야 할 것으로 판단되었다.
- 앞으로 최종 선발 균주를 대상으로 실제 동물실험을 진행하고, 임상 효능 검증 연구가 뒷받침된다면, 다른 산업동물에 비해 많은 연구가 진행되지 않은 개 생균제용 유산균주 개발에 활용 가치가 매우 높을 것으로 생각된다.
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