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문제 정의
- 따라서 본 연구는 다양한 추출방법으로 미선나무의 잎과 줄기의 유효성분을 추출하고 추출물의 생리활성을 측정하여 부위별로 유효성분을 추출할 수 있는 최적의 추출조건을 확립하고 미선나무 잎의 추출성분을 다양한 용매를 사용하여 분획한 후 분획별로 효능을 평가함으로써 미선나무의 새로운 천연물 소재로써의 활용가치를 판단하고자 진행하였다.
제안 방법
- DPPH를 에탄올에 녹여 200mm로 농도로 하였으며 미선나무 추출물은 각각 10, 50, 100, 250, 500mg/L 농도로 제조하였으며 대조구로는 증류수로 하였다. 200mm DPPH 75μL와 각 농도별 추출물 1μL를 잘 섞어주었다.
- 각 well에 5mg/mL 농도의 MTT 용액을 50μL 씩 넣은 후 4시간 동안 배양한 후 배지를 제거하고 생성된 Formazan 결정을 100μL의 DMSO 용액에 완전히 용해시킨다. Microplate reader를 이용하여 550nm에서 흡광도를 측정하여 발색 정도를 측정하였으며, 세포독성은 세포만 배양한 무처리 군의 생존율 100%를 기준으로 약물처리군의 상대적인 세포 생존율을 계산하였다.
- RAW 264.7 세포(5×104 cells/well)를 96-Well culture plate에 100μL의 DMEM 배지와 함께 하룻밤 배양한 다음, 미선나무 줄기 추출물을 5, 10, 50, 100, 500, 1000μg/mL의 농도로 처리하여 37℃, 5% CO2조건에서 24시간 배양하였다.
- 남은 농축액에 동일한 양의 메틸렌클로라이드(Burdick & Jackson, Ulsan, Korea)를 가하여 2회 분획한 후 상기와 동일한 방법으로 메틸렌클로라이드 층의 분획물을 얻었으며 남은 농축액에 동일한 양의 에틸아세테이트(Burdick & Jackson, Ulsan, Korea)를 첨가하여 상기의 방법으로 에틸아세테이트 분획물을 얻었으며 동일한 방법으로 부탄올(Burdick & Jackson, Ulsan, Korea) 분획물을 회수하였으며 남은 농축액을 처리하여 최종적으로 물층 분획물을 획득하였다.
- 농축액에 헥산(Burdick & Jackson, Ulsan, Korea)을 1:1(v/v)로 가하여 헥산층을 2회 반복하여 분획한 후 분획된 헥산층을 합하여 회전식 감압농축기를 이용하여 40℃에서 농축한 후 동결건조 하여 헥산층 분획물을 얻었다.
- 총 플라보노이드 함량은 Colorimetric 방법을 응용하여 측정하였다[17]. 다양한 방법으로 추출한 미선나무 추출물 0.25mL와 (+)-Catechin (M.W. 290.27, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) 표준물질 용액에 1.25mL의 증류수를 첨가한 후 0.075mL의 5% 아질산나트륨 (NaNO2, Daejung chemical, Ansan, Korea)용액을 혼합하였다. 6분 경과 후 0.
- 미선나무 1g을 취한 후 Volumetric flask 에 넣고 물과 에탄올이 다양한 농도로 혼합된 추출용액을 사용하여 환류냉각 추출, 초음파 추출, 침지에 의한 추출을 진행하였다. 에탄올 농도에 따르는 추출물의 조성변화를 확인하기 위하여 1g의 미선나무 시료에 0, 20, 40, 60, 80, 100%(v/v) 농도의 에탄올을 100mL 첨가한 후 초음파발생기(WUC-D06H, DAIHAN Scientific Co.
- 미선나무 잎 5.3kg에 10배수의 60% 에탄올을 첨가한 후 상온에서 72시간 동안 침지 추출한 후 추출액은 여과지(Whatman No.2, GE, Pittsburgh, PA, USA)로 여과한 다음 회전식 감압농축기(N-100, EYELA, Tokyo, Japan)를 사용하여 40℃에서 감압농축하였다. 농축액에 헥산(Burdick & Jackson, Ulsan, Korea)을 1:1(v/v)로 가하여 헥산층을 2회 반복하여 분획한 후 분획된 헥산층을 합하여 회전식 감압농축기를 이용하여 40℃에서 농축한 후 동결건조 하여 헥산층 분획물을 얻었다.
- 미선나무 잎과 줄기 중 유효성분의 최적추출조건을 평가하기 위해 다양한 농도의 에탄올을 추출용매로 사용하여 환류냉각, 초음파 및 침지법 등을 적용하여 추출을 진행하였다. 추출물의 총 폴리페놀과 플라보노이드 함량을 분석한 결과 에탄올의 농도와 상관없이 환류냉각법으로 추출한 경우 전반적으로 높은 값을 나타내었으며 80% 에탄올로 2시간 동안 환류냉각 추출하였을 때 실험군 중 가장 높은 값을 나타내었다.
- 미선나무 잎을 60% 에탄올로 24시간 침지추출한 조추출물을 각 용매별로 분획한 후 세포증식효과 및 전자공여능을 측정하였다. 용매별 분획층의 무게와 비율은 Table 3에 나타내었다.
- 미선나무 줄기 추출물에 대한 세포독성을 알아보기 위해 세포 생존율을 측정하였다. RAW 264.
- 미선나무 줄기 추출물의 MTT assay를 통하여 세포독성 및 증식효과를 확인하였다. Fig.
- 본 실험구간의 최고 농도인 500mg/L의 농도에서도 미선나무 줄기 추출물은 세포독성이 없는 것을 확인함으로써 향 후 실험은 최고 농도를 500mg/L까지 진행하였다.
- 체내에서 발생하는 산화반응은 노화의 원인이 되는 세포의 변이를 유발한다고 알려져 있으며 항산화 작용은 이러한 반응을 억제하는 기능으로 관심 받고 있다. 산화반응의 주원인이 되는 Free radical을 제거하는 항산화 능을 간접적으로 측정하기 위하여 DPPH radical 소거 활성을 측정하였다.
- 미선나무 1g을 취한 후 Volumetric flask 에 넣고 물과 에탄올이 다양한 농도로 혼합된 추출용액을 사용하여 환류냉각 추출, 초음파 추출, 침지에 의한 추출을 진행하였다. 에탄올 농도에 따르는 추출물의 조성변화를 확인하기 위하여 1g의 미선나무 시료에 0, 20, 40, 60, 80, 100%(v/v) 농도의 에탄올을 100mL 첨가한 후 초음파발생기(WUC-D06H, DAIHAN Scientific Co., Ltd, Wonju, Korea)를 이용하여 30분간 50kHz에서 추출을 진행하였으며 환류냉각기 (C-WB, Chang shin science, Seoul, Korea)를 이용하여 80℃에서 2시간 동안 진행하였으며 침지추출은 25℃에서 진행하였다.
- 총 플라보노이드 함량은 Colorimetric 방법을 응용하여 측정하였다[17]. 다양한 방법으로 추출한 미선나무 추출물 0.
- 추출 방법별 미선나무 줄기 추출물의 DPPH free radical 소거활성을 비교하였다. 60% 에탄올에 24시간 침지 추출, 80% 에탄올로 2시간 초음파 추출과 80% 에탄올로 환류냉각 추출한 추출물의 DPPH 전자공여능을 Fig.
- 표준물질로 Gallic acid(M.W. 170.12, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)를 사용하여 1,000ppm의 Stock solution을 제조하여 단계별(0, 100, 200, 500, 1,000ppm)로 희석하여 작성한 검량선으로부터 총 페놀함량을 구하였으며 함량은 %(시료 100 g 중의 g) Gallic acid로 나타내었다.
대상 데이터
- 미선나무는 충청북도 괴산의 푸른농원에서 재배된 3년생의 줄기와 잎을 음건한 후 분쇄하여 분석용 시료로 사용하였다.
- 미선나무의 시료 추출에 사용된 용매는 HPLC급 용매(Burdick & Jackson, Ulsan, Korea)를 사용하였고 Microplate reader(EPOCH, Bio Tek Instruments Inc, VT, USA)를 사용하여 흡광도를 측정 하였다.
데이터처리
- 1)Means with different letters within a row are significantly different from each other determined by Duncan's multiple range test.
- 실험결과에 대한 통계처리는 SPSS Software package(Version 22.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하여 분산분석을 하고 Duncan의 다중범위검정(p<0.05) 방법으로 사후 검정하였다.
- 총 폴리페놀의 함량 및 플라보노이드 함량은 3회 이상 반복실험에 대한 평균±표준편차로 나타내었다.
이론/모형
- Folin-Ciocalteu 방법을 이용하여 미선나무 잎과 줄기 추출물의 페놀성 화합물의 함량을 측정하였다. 2.
성능/효과
- 100∼250mg/L의 농도 범위에서는 60% 에탄올 침지 추출물의 효과가 높으며 50mg/L농도에서는 80% 에탄올 초음파 추출물이 높은 효과를 나타내었으나 차이는 크지 않았다.
- 미선나무 줄기 추출물의 MTT assay를 통하여 세포독성 및 증식효과를 확인하였다. Fig. 1에서 알 수 있듯이 60% 에탄올로 24시간 침지 추출한 추출물과 80% 에탄올로 2시간 동안 초음파 추출한 미선나무줄기 추출물의 세포독성을 살펴본 결과 추출물의 농도가 10mg/L에서 500mg/L까지 증가할수록 세포 생존율이 증가하는 것으로 나타났다.
- 1%의 활성을 보였다. Fig. 3에서 알 수 있듯이 500mg/L 농도에서는 부탄올 층이 가장 높은 활성을 보여 Ascorbic acid 대비 103.3%의 활성을 보였으며 에틸아세테이트층에서도 96.8%의 활성을 보였다.
- 미선나무 잎 추출물 및 용매별 분획물의 DPPH free radical 소거 활성을 평가한 결과 50mg/L의 저농도에서 부탄올, 에틸아세테이트 층의 추출물이 높은 활성을 나타내어 대조군인 Ascorbic acid 대비 각각 94.1%의 활성을 보였다. Fig.
- 용매별 분획층의 무게와 비율은 Table 3에 나타내었다. 미선나무 잎 추출물은 부탄올 분획층이 47.5%로 가장 높았으며 에틸아세테이트 층이 29.6%, 메틸렌클로라이드 분획물이 3.8%로 가장 낮은 비율을 보였다.
- 7mg/g의 함량을 나타내었다. 미선나무 잎 추출물의 플라보노이드 화합물 함량은 60% 에탄올에서 44.2mg/g으로 가장 높은 값을 나타내었다.
- 3%로 가장 높았다. 미선나무 잎의 DPPH 자유라디칼 소거능은 용매별로 분획하여 측정한 결과 용매별로 다른 값을 나타내었으며 부탄올 층에서 103.3%로 가장 높게 나타났다. 이러한 결과로써 미선나무의 잎과 줄기를 생리활성을 보유한 천연물 소재로써 활용이 가능하다는 것을 확인하였다.
- 2에 나타내었다. 미선나무 줄기 추출물의 농도에 비례하여 DPPH free radical 소거활성이 증가하는 경향을 나타내었으며 추출물 농도 500mg/L에서는 침지, 초음파, 환류냉각 추출물에서 각각 69.1, 71.3, 62.3%의 DPPH free radical 소거활성을 보여 대조군인 Ascorbic acid의 80.1%와 거의 유사한 효과를 나타내었다. 100∼250mg/L의 농도 범위에서는 60% 에탄올 침지 추출물의 효과가 높으며 50mg/L농도에서는 80% 에탄올 초음파 추출물이 높은 효과를 나타내었으나 차이는 크지 않았다.
- 미선나무 줄기를 72시간 동안 침지 추출한 추출물의 총 폴리페놀은 60% 에탄올에서 136.2mg/g으로 가장 높게 나타났으며 80% 에탄올과 40% 에탄올에서 각각 134.4, 124.3mg/g의 함량을 보였다. 잎 추출물의 경우는 60% 에탄올에서 가장 높은 함량을 보여 121.
- 미선나무 줄기의 DPPH 자유라디칼 소거능을 평가한 결과 침지추출 시 71.3%로 가장 높았다. 미선나무 잎의 DPPH 자유라디칼 소거능은 용매별로 분획하여 측정한 결과 용매별로 다른 값을 나타내었으며 부탄올 층에서 103.
- 에탄올 농도별로 침지 추출한 미선나무 줄기의 플라보노이드의 함량은 60% 에탄올을 추출용매로 사용한 경우 49.2%의 함량을 보였으며 에탄올 농도 80%와 40%에서 각각 47.4mg/g, 40.7mg/g의 함량을 나타내었다. 미선나무 잎 추출물의 플라보노이드 화합물 함량은 60% 에탄올에서 44.
- 3%로 가장 높게 나타났다. 이러한 결과로써 미선나무의 잎과 줄기를 생리활성을 보유한 천연물 소재로써 활용이 가능하다는 것을 확인하였다. 국내에서만 자생하는 미선나무의 특성을 살려 생산 기술의 발달로 점차 생산성이 증가하게 되면, 천연추출물의 생리활성분야에서 경쟁력을 갖출 수 있을 것으로 사료 된다.
- 초음파를 이용하여 에탄올 농도별로 30분간 추출한 미선나무 줄기 추출물의 플라보노이드 화합물은 80% 에탄올에서 42.8mg/g으로 가장 높은 함량을 나타냈으며 잎의 경우에는 60% 에탄올에서 62.5mg/g로 가장 높은 함량을 나타내었다.
- 초음파를 이용하여 에탄올 농도별로 30분간 추출한 미선나무 줄기의 경우 60% 에탄올 추출물에서 총 폴리페놀 함량은 170.9mg/g으로 가장 높게 나타났으며 80% 에탄올과 40% 에탄올에서 164.9, 157.9mg/g의 순으로 나타났다. 잎의 경우는 80% 에탄올에서 가장 높은 추출효율을 보여 124.
- 다양한 농도의 에탄올을 이용하여 두 시간 동안 환류 냉각 추출한 미선나무 줄기 추출물의 총 폴리페놀의 농도를 측정한 결과를 Table 1에 나타내었다. 총 폴리페놀의 함량은 80% 에탄올을 용매로 사용한 경우 가장 높게 나타나 180.2mg/g의 함량을 보였으며 미선나무 잎의 경우도 80% 에탄올 추출물에서 125.5mg/g로 가장 높은 결과를 보였으나 용매 비율별로 유의차는 나타나지 않았다.
- 미선나무 잎과 줄기 중 유효성분의 최적추출조건을 평가하기 위해 다양한 농도의 에탄올을 추출용매로 사용하여 환류냉각, 초음파 및 침지법 등을 적용하여 추출을 진행하였다. 추출물의 총 폴리페놀과 플라보노이드 함량을 분석한 결과 에탄올의 농도와 상관없이 환류냉각법으로 추출한 경우 전반적으로 높은 값을 나타내었으며 80% 에탄올로 2시간 동안 환류냉각 추출하였을 때 실험군 중 가장 높은 값을 나타내었다.
후속연구
- 이러한 결과로써 미선나무의 잎과 줄기를 생리활성을 보유한 천연물 소재로써 활용이 가능하다는 것을 확인하였다. 국내에서만 자생하는 미선나무의 특성을 살려 생산 기술의 발달로 점차 생산성이 증가하게 되면, 천연추출물의 생리활성분야에서 경쟁력을 갖출 수 있을 것으로 사료 된다. 또한, 미선나무를 이용한 화장품 소재 등의 개발뿐만 아니라 미선나무를 이용하여 다른 생리 활성도 확인하여 미선나무자체의 가치를 증대시킬 수 있을 것으로 보인다.
- 국내에서만 자생하는 미선나무의 특성을 살려 생산 기술의 발달로 점차 생산성이 증가하게 되면, 천연추출물의 생리활성분야에서 경쟁력을 갖출 수 있을 것으로 사료 된다. 또한, 미선나무를 이용한 화장품 소재 등의 개발뿐만 아니라 미선나무를 이용하여 다른 생리 활성도 확인하여 미선나무자체의 가치를 증대시킬 수 있을 것으로 보인다.
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