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문제 정의
- 본 연구에서는 단회투여독성평가에 따른 사망률, 임상증상, 음수량, 사료섭취량, 체중 및 장기 중량 변화, 혈액학적 검사 및 혈액생화학적 검사, 해부병리학적 조직검사 등을 암수별 시험군으로 나누어 수행하였다. 시험에 사용한 동물은 암수 각 3마리로, 급성독성에 따른 장기의 이상과 혈액학적 이상을 판단하는데 유의성 있는 시험군의 구성으로 볼 수 있으며, 이러한 시험의 구성을 통하여 연구결과에 대한 근거를 명확하게 제시하고자 하였다.
- 이에 본 연구에서는 현호색의 안전성에 대하여 과학적 근거를 확보하고, 식품소재 및 기능성 천연물 원료로서의 가능성을 확인하기 위해 식품의약품안전청 ‘비임상시험관리기준(식약청고시 제2012-61)’ 및 ‘의약품 등의 독성시험기준(식약청고시 제2012-86)’에 따라 단회투여독성시험을 수행하였다.
제안 방법
- 1) 본 시험물질은 임상 적용 시 경구를 통하여 섭취하고 있으므로, 시험물질과 용매대조물질을 존데를 이용하여 경구로 투여하였다.
- 2) 시험물질 및 용매대조물질은 투여 전 체중을 측정하여 투여량(10㎖/㎏)을 환산하여, 1일 1회, 단회 투여 후 일주일동안 관찰하였다.
- 3) 시험물질을 투여한 모든 동물에 대하여 1일 2회(오전 10:00 이전, 오후 14:00 이후) 빈사동물 및 사망여부를 확인하였고, 외관적 이상 및 임상증상, 이상 징후의 발생여부와 그 정도를 관찰하였다.
- 계획도살 동물에 대하여 혈액학적 검사를 실시하였다. 동물을 하룻밤 절식시킨 후 동물전용 마취제(Zoletil50, (주)버박코리아)로 마취 후 개복하여, 복대동맥을 방혈 및 치사시켜 장기조직을 육안으로 검사하였다.
- 계획도살 동물에 대하여 혈액학적 검사를 실시하였다. 동물을 하룻밤 절식시킨 후 동물전용 마취제(Zoletil50, (주)버박코리아)로 마취 후 개복하여, 복대동맥으로부터 채혈한 혈액을 이용하여 다음의 항목을 측정하였다.
- 계획도살 동물에 대하여 혈액학적 검사를 실시하였다. 동물을 하룻밤 절식시킨 후 동물전용 마취제(Zoletil50, (주)버박코리아)로 마취 후 개복하여, 복대동맥을 방혈 및 치사시켜 장기조직을 육안으로 검사하였다.
- 부검 후 다음의 장기를 적출하여 전자저울을 이용하여 측정하였으며, 실측치(절대중량)를 측정하고, 체중에 대한 비(상대중량)도 계산하였다. 또한, 양쪽 대칭 장기는 모두 측정하였다.
- 혈액학적 검사를 실시한 동물에 대하여 혈청생화학적 검사를 실시하였다. 복대동맥으로부터 채혈된 혈액을 3,000 rpm, 15분간 원심분리하여 얻은 혈청을 이용하여 다음과 같은 항목에 대해 측정하였다.
- 본 연구에서는 단회투여독성평가에 따른 사망률, 임상증상, 음수량, 사료섭취량, 체중 및 장기 중량 변화, 혈액학적 검사 및 혈액생화학적 검사, 해부병리학적 조직검사 등을 암수별 시험군으로 나누어 수행하였다. 시험에 사용한 동물은 암수 각 3마리로, 급성독성에 따른 장기의 이상과 혈액학적 이상을 판단하는데 유의성 있는 시험군의 구성으로 볼 수 있으며, 이러한 시험의 구성을 통하여 연구결과에 대한 근거를 명확하게 제시하고자 하였다.
- 본 연구에서는 현호색의 일반적인 경구투여에서 가장 빈번하게 나타나는 열수 추출물에 대한 실험을 진행하였으며, 이를 위하여 현호색 500g을 추출기에 넣고 증류수를 4ℓ를 넣은 후, 약110℃로 4시간동안 추출하고 나온 추출액을 병에 담았다. 열이 적당히 식으면 여과지로 여과하여 냉동으로 보관하고 추출액을 감압농축기로 농축을 실시하였다.
- 부검 후 다음의 장기를 적출하여 전자저울을 이용하여 측정하였으며, 실측치(절대중량)를 측정하고, 체중에 대한 비(상대중량)도 계산하였다. 또한, 양쪽 대칭 장기는 모두 측정하였다.
- 0g/㎏의 현호색 물 추출물을 각각 단회 경구투여한 후, 일주일 뒤 부검을 실시하였다. 부검 후 복대동맥으로부터 채혈한 혈액을 원심분리하여 얻은 혈청을 이용하여 아스파테이트 아미노기전이효소(AST), 알라닌 아미노기전이효소(ALT), 젖산탈수효소(LDH) 등을 측정하였다. 그 결과 대조군과 시험물질 투여군 간의 통계적인 유의성을 관찰 할 수 없었다[Table 5].
- 0g/㎏의 현호색 물 추출물을 각각 단회 경구투여한 후, 일주일 뒤 부검을 실시하였다. 부검 후 복대동맥으로부터 채혈한 혈액을 원심분리하여 얻은 혈청을 이용하여 아스파테이트 아미노기전이효소(AST), 알라닌 아미노기전이효소(ALT), 젖산탈수효소(LDH) 등을 측정하였다. 그 결과 대조군과 시험물질 투여군 간의 통계적인 유의성을 관찰 할 수 없었다[Table 5].
- 0g/㎏의 현호색 물 추출물을 각각 단회 경구투여한 후, 일주일 뒤 부검을 실시하였다. 부검 후 복대동맥으로부터 채혈한 혈액을 이용하여 백혈구수(WBC), 적혈구수(RBC), 혈색소량(HGB) 등을 측정하였다. 그 결과 대조군과 시험물질 투여군 간의 통계적인 유의성을 관찰 할 수 없었다[Table 3].
- 사료(실험동물용 고형사료)와 물은 자유롭게 먹도록 유지하며, 사육장의 온도는 21∼24℃, 상대습도는 30∼40%로 유지하고, 12시간마다 낮과 밤이 반복되도록 사육장 내 빛을 조절하여 사육하였다.
- 이에 따르면 강제경구 투여 시 기술적으로 투여하는 용량은 1,000∼2,000㎎/㎏이나, 예외적인 경우에는 5,000㎎/㎏까지 투약이 가능하다. 생약재의 경우 양약과 다르게 다량으로 오랫동안 섭취하기 때문에 최고용량을 2,000㎎/㎏의 배수인 3,000㎎/㎏으로 설정하였고, 용량결정시험에서는 3,000㎎/㎏을 포함하여, 저용량 1,000㎎/㎏과 중용량 2,000㎎/㎏으로 설정하여, 총 3단계의 용량을 처리하기로 하였다.
- 수컷 Rat에 0, 1.0, 2.0, 3.0g/㎏의 현호색 물 추출물을 각각 단회 경구투여한 후, 일주일 뒤 부검을 실시하였다. 부검 후 복대동맥으로부터 채혈한 혈액을 이용하여 백혈구수(WBC), 적혈구수(RBC), 혈색소량(HGB) 등을 측정하였다.
- 암컷 Rat에 0, 1.0, 2.0, 3.0g/㎏의 현호색 물 추출물을 각각 단회 경구투여한 후, 일주일 뒤 부검을 실시하였다. 부검 후 복대동맥으로부터 채혈한 혈액을 이용하여 백혈구수(WBC), 적혈구수(RBC), 혈색소량(HGB) 등을 측정하였다.
- 본 연구에서는 현호색의 일반적인 경구투여에서 가장 빈번하게 나타나는 열수 추출물에 대한 실험을 진행하였으며, 이를 위하여 현호색 500g을 추출기에 넣고 증류수를 4ℓ를 넣은 후, 약110℃로 4시간동안 추출하고 나온 추출액을 병에 담았다. 열이 적당히 식으면 여과지로 여과하여 냉동으로 보관하고 추출액을 감압농축기로 농축을 실시하였다. 농축된 시료를 동결건조기로 약 3일 동안 동결건조 하여 수득률 23.
- 현호색 물 추출물을 단회투여한 후, 부검을 실시하였다. 부검 후 적출한 모든 장기를 조직병리로 판독한 결과, 암컷의 일부 간세포에서 지방의 변성이 나타났다.
- 혈액학적 검사를 실시한 동물에 대하여 혈청생화학적 검사를 실시하였다. 복대동맥으로부터 채혈된 혈액을 3,000 rpm, 15분간 원심분리하여 얻은 혈청을 이용하여 다음과 같은 항목에 대해 측정하였다.
대상 데이터
- 열이 적당히 식으면 여과지로 여과하여 냉동으로 보관하고 추출액을 감압농축기로 농축을 실시하였다. 농축된 시료를 동결건조기로 약 3일 동안 동결건조 하여 수득률 23.7%로 현호색 추출물 23.5㎎을 얻었으며 이를 실험에 사용하였다.
- 동물은 생후 7주된 150∼180g의 SD(Sprague-Dawley) Rat를 (주)오리엔트바이오에서 구입하여 2주간 안정시킨 뒤 실험동물로 사용하였다.
- 본 연구에 사용된 현호색(Corydalis turtschaninovii BESS.)은 (주)퓨어마인드 (yongchoen, Korea)에서 구입하였으며, 대한약전 및 생약규격집을 근거로 중앙약사심의위원회 한약분과 감별위원의 감별을 받아 사용하였다.
- 순화기간 중 건강한 것으로 판정된 동물들의 체중을 측정하고, 평균체중에 가까운 동물들을 암수 각각 48마리씩 선택하였다. 선택한 동물들은 순위화한 체중에 따라 ‘시험군의 구성’표에 명시된 동물수가 되도록 하였다.
데이터처리
- 본 시험에서 얻은 측정치들은 ANOVA 분석을 실시한 후, 유의성이 인정될 경우 Dunnett's t-test를 실행하여 대조군과 각 용량군 간의 통계학적 유의성을 검정하였다(p < 0.05).
이론/모형
- 본 시험은 ‘비임상시험관리기준(식약청고시 제2012-61)’ 및 ‘의약품등의 독성시험기준(식약청고시 제2012-86)’을 바탕으로 실험을 수행하였다.
- 순화기간 후 Rat를 군 분리하여 0, 1.0, 2.0, 3.0g/㎏의 현호색 물 추출물을 각각 단회 경구투여한 후, 일주일 뒤 부검을 실시하였으며, 체중 및 장기중량 측정용 저울로는 Ohaus Corporation社(USA)의 EPG213 모델을 사용하였다. 수컷 Rat의 부검 시 체중은 대조군은 220.
성능/효과
- 결과에서 알 수 있듯이 시험기간 중 사망한 개체가 없어 LD50의 산출은 불가하였으며, 기본적인 임상증상이나 이상 소견은 관찰되지 않았다. 또한 체중의 변화나 개별 장기의 중량변화는 대조군과 비교하여 유의성이 관찰되지 않았으며, 혈액검사 영역에서도 유의성 있는 변화가 관찰되지는 않았으나, 혈액생화학적검사의 결과 수컷 Rat의 경우 투여군에서 일부 AST의 변화가 나타났으나, 농도 의존적 경향을 보이지 않아 현호색의 투여에 의한 변화로 판단하기에는 무리가 있었다.
- 의 산출은 불가하였으며, 기본적인 임상증상이나 이상 소견은 관찰되지 않았다. 또한 체중의 변화나 개별 장기의 중량변화는 대조군과 비교하여 유의성이 관찰되지 않았으며, 혈액검사 영역에서도 유의성 있는 변화가 관찰되지는 않았으나, 혈액생화학적검사의 결과 수컷 Rat의 경우 투여군에서 일부 AST의 변화가 나타났으나, 농도 의존적 경향을 보이지 않아 현호색의 투여에 의한 변화로 판단하기에는 무리가 있었다. 그러나 암컷 Rat의 경우 대조군에 비하여 농도 의존적으로 AST가 증가하는 경향을 보였으며, 이러한 결과는 현호색이 여성의 간장 기능에 영향을 줄 수 있다는 것을 시사하며, 이와 관련된 후속 연구가 추가적으로 수행되어야 할 것으로 보인다.
- 본 연구의 결과로 볼 때 현호색이 경구투여에 있어 비교적 안전한 물질인 것으로 판단할 수 있다. 그러나 단회 경구투여 급성독성시험만으로 천연물 유래 식품 소재에 대한 독성 유무를 판단하기에는 일정부분 제약이 있으나[18], 식품첨가물의 원료나 부재료로 활용이 가능할 것으로 판단되며, 기능성식품개발이 순차적으로 수행된다면 현호색에 대한 식품소재로서의 안전한 자료가 확보될 수 있을 것으로 기대한다.
- 현호색 물 추출물을 단회투여한 후, 부검을 실시하였다. 부검 후 적출한 모든 장기를 조직병리로 판독한 결과, 암컷의 일부 간세포에서 지방의 변성이 나타났다. 그러나 대조군과 시험물질 투여군 사이에 유의성이 있다고 보기에는 매우 미약한 변성인 것으로 판단된다[Figure 1].
- 시험 전 기간 동안 대조군과 비교하여 시험물질 투여로 인한 유의성 있는 음수량 및 사료섭취량 변화는 관찰되지 않았다.
- 현호색 열수 추출물을 이용한 단회투여 독성시험에서, 단회 투여 후 일주일 동안 관찰한 결과 시험물질로 인한 폐사 및 특이적인 임상증상이 관찰되지 않았다.
후속연구
- 본 연구의 결과로 볼 때 현호색이 경구투여에 있어 비교적 안전한 물질인 것으로 판단할 수 있다. 그러나 단회 경구투여 급성독성시험만으로 천연물 유래 식품 소재에 대한 독성 유무를 판단하기에는 일정부분 제약이 있으나[18], 식품첨가물의 원료나 부재료로 활용이 가능할 것으로 판단되며, 기능성식품개발이 순차적으로 수행된다면 현호색에 대한 식품소재로서의 안전한 자료가 확보될 수 있을 것으로 기대한다.
- 또한 체중의 변화나 개별 장기의 중량변화는 대조군과 비교하여 유의성이 관찰되지 않았으며, 혈액검사 영역에서도 유의성 있는 변화가 관찰되지는 않았으나, 혈액생화학적검사의 결과 수컷 Rat의 경우 투여군에서 일부 AST의 변화가 나타났으나, 농도 의존적 경향을 보이지 않아 현호색의 투여에 의한 변화로 판단하기에는 무리가 있었다. 그러나 암컷 Rat의 경우 대조군에 비하여 농도 의존적으로 AST가 증가하는 경향을 보였으며, 이러한 결과는 현호색이 여성의 간장 기능에 영향을 줄 수 있다는 것을 시사하며, 이와 관련된 후속 연구가 추가적으로 수행되어야 할 것으로 보인다.
- 그러나 이와 같은 천연물 유래 식품소재는 지금까지 경험적인 사용법과 용량에 의존하여 왔을 뿐, 사용방법과 용도에 대한 과학적인 근거를 제시하지 못하고 있다. 따라서 천연물 유래 기능성 식품원료의 안전성에 대한 지속적이고 체계적인 연구가 이루어져야 할 것으로 사료된다.
- 또한 천연물 유래의 생약 및 식품소재는 오랜 기간 사용되어 왔기에 안전할 것이라는 인식이 지배적이며, 그 독성과 부작용 등이 국민 건강을 위협하는 요소로 작용하기도 하는 것이 사실이다[4]. 따라서 천연물 유래 식품원료에 대한 과학적 검증을 통해 안전성을 확보할 필요가 있으며 체계적인 관리 시스템을 도입함으로써 천연물 식품시장 확대를 위한 중장기적 추진 동력을 확보할 수 있을 것으로 판단된다[5].
- 특히 최근에는 현호색이 가지고 있는 다양한 효능, 효과가 과학적으로 입증되고 새로운 효능이 발견되는 추세에 있어 더욱 관심의 대상이 되고 있다. 따라서 현호색의 안전성에 대한 과학적 검증이 반드시 필요한 상황이며, 이를 토대로 현호색의 다양한 활용분야를 개발할 수 있을 것으로 기대한다.
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