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문제 정의
- 따라서 본 실험에서는 항균효능이 있다고 알려진 벌꿀의 프로폴리스를 대상으로 하여 주요 어병 세균에 대한 항균력을 측정함으로써 프로폴리스를 이용한 수산용 천연약재의 개발을 위한 자료를 얻고자 하였다.
제안 방법
- Propolis를 Muller-Hinton broth에 5∼2560 μg/mL까지 단계별로 희석한 후, 균 현탁액을 각각 접종하고 48시간 배양한 후 최소억제농도를 측정하였다.
- Propolis를 증류수에 5∼2560 μg/mL까지 단계별로 희석하여 A. hydrophila 외 5종의 어류 질병 세균에 대해 최소억제농도와 최소살균농도 값을 측정하였다.
- Tryptic soy agar (Difco, USA) 평판배지에서 20℃로 24시간 배양한 신선한 colony를 0.85% 멸균생리식염수에 MacFarland 0.5의 탁도로 현탁시켜, 약 1∼5x106 CFU/mL의 균 현탁액을 만들었다.
- 또한 시판되고 있는 항생제 disk를 사용하여 공시 약제와의 항균력을 비교하였다. 항생제는 계열별로 한가지 씩 선택하여 사용하였는데 β-lactam계로는 amoxicillin (30 μg/disc), tetracycline계로는 tetracycline (30 μg/disc), macrolide계로는 erythromycin (15 μg/disc), sulfa계로는 trimethoprim-sulfamethoxazole (1.
- 멸균된 paper disk (ø10 mm, Advantec Toyo, Japan)에 propolis (80%) (Sigma Chem co, USA)를 10, 20, 30 mg씩 흡습시켜 충분히 건조시킨 후에, 각각의 disk를 시험균 현탁액이 도말된 Muller-Hinton agar 배지에 밀착시켜 올려놓은 후, 20℃에서 48시간 배양한 후에 disk 주변에 생긴 저지대의 직경을 측정하여 항균력 유무를 판정하였다.
- 최소살균농도(minimum bacteriocidal concentration)는 균이 증식하지 않은 최소억제농도 이상의 배양액을 한천배지에 도말하여 균주를 접종시킨 후 배양하여 측정하였다. 최소살균농도는 최초의 접종균수의 99.
- 항생제는 계열별로 한가지 씩 선택하여 사용하였는데 β-lactam계로는 amoxicillin (30 μg/disc), tetracycline계로는 tetracycline (30 μg/disc), macrolide계로는 erythromycin (15 μg/disc), sulfa계로는 trimethoprim-sulfamethoxazole (1.25∼23.75 μg/disc), ansamycin계로는 lincomycin (15 μg/ disc), quinolone계로는 nalidixic acid (30 μg/disc), 그리고 phenicol계로는 chloramphenicol (30 μg/disc)의 총 7종류를 사용하여 propolis와 동일한 방법으로 어병 세균에 대한 항균력을 측정하였다.
대상 데이터
- salmonicida subsp. salmonicida (ATCC 33658), 그리고 Pirarucu에서 분리된 E. tarda (Korea, 2009)의 그람음성균의 총 6균주로 서울대학교 수의과대학 수생동물 질병학 연구실로부터 분양받아 실험에 사용하였다.
- 75 μg/disc), ansamycin계로는 lincomycin (15 μg/ disc), quinolone계로는 nalidixic acid (30 μg/disc), 그리고 phenicol계로는 chloramphenicol (30 μg/disc)의 총 7종류를 사용하여 propolis와 동일한 방법으로 어병 세균에 대한 항균력을 측정하였다. 항생제 disk 가운데 trimethoprim-sulfamethoxazole은 Biolab (Hungary)에서 구입하였으며 나머지는 모두 Liofilcam (Italy)에서 구입하였다.
이론/모형
- 각 실험 균주에 대한 propolis의 최소억제농도(minimum inhibitory concentration)는 broth micro dilution 방법을 사용하여 측정하였다(Hisae 등, 1993; Lorian, 1986). 모든 균주는 tryptic soy agar 배지에 20℃에서 24시간 배양한 후, MacFarland 0.
성능/효과
- Aeromonas속 균주의 경우 최소살균농도는 최소억제농도의 2∼4배 농도인 2048 ppm과 4096 ppm에서 관찰되었고 vibrio속 균주는 1024∼2048 ppm 사이에서 관찰되었으며, vibrio속 균주 중 V. paraheamolyticus는 최소살균농도가 1024 ppm으로 V. vulnificus보다 더 낮은 농도에서 균의 사멸 효과를 나타내었다.
- tarda 균주는 2048 ppm으로 역시 약간의 유의성이 있는 억제정도를 나타냈다. Propolis를 4096 ppm 이상의 농도로 투여하였을 때 모든 균에서 완전한 억제 효과를 나타내었고, 8192 ppm 이상의 농도로 투여하였을 때 모든 균에 대해서 살균효과를 보였다.
- Propolis와의 항균력을 비교하기 위하여 실시한 시판용 항생제의 경우, trimethoprim-sulfamethoxazole, nalidixic acid, tetracycline 및 chloramphenicol은 모든 시험균주에 대해 저지대를 나타내었고, amoxicillin과 lincomycin은 저지대가 나타나지 않거나 저지대가 좁게 나타났다(Table 1). 같은 항생제에 대한 저지대는 균의 genus에 따라 비슷하게 관찰되었다.
- paraheamolyticus가 다른 균주들에 비해 큰 감수성을 나타내었다. V. vulnificus와 E. tarda를 제외한 균의 경우도 최소억제농도가 640 ppm으로 유의할 만한 억제정도를 나타내었다. 최소살균농도 측정시험에서는 모든 균에서 대체적으로 비슷한 정도의 결과치를 나타내었는데 그 중 Vibrio속 균주가 Aeromonas속 균주와 Edwardsiella속 균주에 비해 비교적 높은 감수성을 나타내었다.
- 그 결과, 모든 균주에서 최소억제농도가 512∼2048 ppm로 어느 정도 유의성 있는 억제 정도를 나타내었는데, 그 중 V. paraheamolytica는 512 ppm으로 모든 시험균 중 가장 낮은 최소억제농도 값, 즉 가장 강한 억제정도를 나타내었고 V. vulnificus의 경우 최소억제 농도는 1024 ppm으로 두 번째로 강한 억제정도를 나타내었다(Table 2).
- 특히 고용량(30 mg)에서는 대조물질인 항생제와 비슷한 정도의 매우 효과적인 항균력을 나타내었다. 그러나 시판용 항생제의 항균 효과 시험에서 A. hydrophila 외 5종의 어류 질병 세균은 amoxicillin과 lincomycin에 비교적 높은 내성을 나타내었다. 최소억제농도 측정시험의 경우 V.
- 멸균된 paper disk에 propolis를 흡습시켜 균 현탁액이 도말된 Muller-Hinton agar 배지에 올려놓은 후, 20℃에서 48시간 배양한 후에 disk 주변에 생긴 저지대의 직경을 측정한 결과, propolis는 모든 시험균주에 대해 저용량(10 mg)에서 고용량(30 mg)으로 갈수록, 즉 용량에 비례하여 발육억제대가 넓게 나타났고 고용량(30 mg)의 경우 대조군으로 사용한 항생제와 유사한 유의할 만한 항균력을 나타내었다(Table 1).
- 본 실험에서 A. hydrophila 외 5종의 모든 어류 시험 균주에 대해 디스크확산법과 최소억제농도 및 최소살균농도 측정시험을 통해 꿀벌의 성분인 propolis 의 주요 어류 질병 세균들에 대한 항균 효과를 알아본 결과, 고용량(30 mg)의 propolis를 이용한 디스크 시험에서 시판되는 항생제와 비슷한 정도의 항균력을 나타내었고, 저용량에서 고용량으로 갈수록 용량에 비례하여 항균력이 증가하는 경향을 나타내었다. 최소억제농도 및 최소살균농도 측정시험에서는 균마다 약간의 차이는 있지만 유의성 있는 억제정도를 나타내었다.
- 본 실험에서 flavonoid 류의 성분 중 하나인 propolis를 디스크에 10 mg, 20 mg, 30 mg의 용량으로 흡습시켜 A. hydrophila 외 5종의 어류 질병 세균에 대한 항균 효과를 살펴보았을 때, 저용량(10 mg)에서는 거의 항균력을 나타내지 않았으나 용량을 높일수록 그에 비례하여 유의할 만한 항균력을 나타내었다. 특히 고용량(30 mg)에서는 대조물질인 항생제와 비슷한 정도의 매우 효과적인 항균력을 나타내었다.
- 이상의 결과를 요약하면, flavonoid류의 성분 중 하나인 propolis는 A. hydrophila 외 6종의 어류 질병 세균에 대해 고용량(30 mg)에서 시중에 시판되는 항생제가 지닌 정도의 항균력을 나타냄을 알 수 있었고 최소억제농도, 최소살균농도 측정시험을 통해 세균의 종류에 따라 약간의 차이는 있지만 유의할 만한 항균력을 나타냄을 알 수 있었다.
- tarda를 제외한 균의 경우도 최소억제농도가 640 ppm으로 유의할 만한 억제정도를 나타내었다. 최소살균농도 측정시험에서는 모든 균에서 대체적으로 비슷한 정도의 결과치를 나타내었는데 그 중 Vibrio속 균주가 Aeromonas속 균주와 Edwardsiella속 균주에 비해 비교적 높은 감수성을 나타내었다.
- hydrophila 외 5종의 모든 어류 시험 균주에 대해 디스크확산법과 최소억제농도 및 최소살균농도 측정시험을 통해 꿀벌의 성분인 propolis 의 주요 어류 질병 세균들에 대한 항균 효과를 알아본 결과, 고용량(30 mg)의 propolis를 이용한 디스크 시험에서 시판되는 항생제와 비슷한 정도의 항균력을 나타내었고, 저용량에서 고용량으로 갈수록 용량에 비례하여 항균력이 증가하는 경향을 나타내었다. 최소억제농도 및 최소살균농도 측정시험에서는 균마다 약간의 차이는 있지만 유의성 있는 억제정도를 나타내었다. 최소억제농도의 경우 가장 감수성이 크게 나타난 V.
- hydrophila 외 5종의 어류 질병 세균은 amoxicillin과 lincomycin에 비교적 높은 내성을 나타내었다. 최소억제농도 측정시험의 경우 V. vulnificus와 V. paraheamolyticus가 다른 균주들에 비해 큰 감수성을 나타내었다. V.
후속연구
- 이러한 결과는 수산용 의약품으로서 propolis의 활용가능성을 시사한다고 사료되고 안전성 측면에서의 연구와 더 많은 어류 질병 세균에 대한 연구가 이루어 져야 할 것으로 생각된다. 또한 항생제 내성의 문제점을 보완할 수산용 의약품으로서 천연 항균물질의 연구가 더 시행되어야 할 것으로 보인다.
- 이러한 결과는 수산용 의약품으로서 propolis의 활용가능성을 시사한다고 사료되고 안전성 측면에서의 연구와 더 많은 어류 질병 세균에 대한 연구가 이루어 져야 할 것으로 생각된다. 또한 항생제 내성의 문제점을 보완할 수산용 의약품으로서 천연 항균물질의 연구가 더 시행되어야 할 것으로 보인다.
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