[논문]RNAi 기법으로 담배가루이 방제를 위해 선발된 유전자의 식물체내 발현

김정희; 서은영; 김정규; 임현섭; 유용만; 윤영남

doi:10.7744/cnujas.2015.42.2.081

RNAi 기법으로 담배가루이 방제를 위해 선발된 유전자의 식물체내 발현
Gene expression in plant according to RNAi treatment of the tobacco whitefly 원문보기

농업과학연구 = CNU Journal of agricultural science, v.42 no.2, 2015년, pp.81 - 86

김정희 (충남대학교 농업생명과학대학 응용생물학과) , 서은영 (충남대학교 농업생명과학대학 응용생물학과) , 김정규 (충남대학교 농업생명과학대학 응용생물학과) , 임현섭 (충남대학교 농업생명과학대학 응용생물학과) , 유용만 (충남대학교 농업생명과학대학 응용생물학과) , 윤영남 (충남대학교 농업생명과학대학 응용생물학과)

Abstract ▼ AI-Helper

Three genes selected from cDNA library of tobacco whitefly, Bemisia tabaci, were checked whether these genes expressed in plant or not, and confirmed the change of gene expression using qRT-PCR in the tobacco whitefly. First of all, three genes were inserted in Tobacco rattle virus (TRV) RNA2 vector using Sac I and Xho I restriction enzymes, and conducted agro-infiltration in tobacco plants (Nicotiana benthamianana). And then, it was confirmed that TRV RNA2 vector and genes inserted in TRV RNA2 vector were expressed in plant. So, after feeding the tobacco whitefly the plants inoculated the genes and induced RNAi of the genes, we plan to confirm the RNAi in the whitefly and investigate the changes of gene expression through the qRT-PCR.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

일반적으로 살충제를 이용한 화학적 방제를 하지만 저항성 문제로 인해 어려움을 겪고있다. 따라서 본 연구에서는 RNAi를 통해 담배가루이를 방제하기 위해 이전 실험에서 선발한 target gene에 대한 식물체내에서의 RNAi 발현 효과를 알아보았다. 먼저, 식물체 내에서의 유전자 발현 유무를 확인하고자 유전자를 cloning한 TRV vector를 담배에 접종하여 TRV의 CP를 detection하였다.
본 연구에서는 선발된 유전자를 이용하여 방제대상 해충인 담배가루이의 체내에서 RNA interference가 발현되는 여부를 확인하기 위해, 제한효소를 이용한 일반적인 cloning 방법을 통해 유전자를 TRV VIGS vector에 cloning하여 식물에 Agro-infiltration시킨 후, qRT-PCR를 이용해 이 식물체를 흡즙한 담배가루이의 유전자 발현량 변화를 확인하여 TRV VIGS vector의 식물체 접종 및 증식 여부와 선발된 유전자의 식물체내 발현을 검증하고자 한다.

제안 방법

Agro-infiltration을 통해 목적 유전자가 삽입된 TRV를 식물에 접종하고자, Agrobacterium tumefaciens EHA 105 competent cell에 plasmid DNA를 transformation하였다. 목적 유전자가 삽입된 TRV RNA2 vector 3 ㎕와Agrobacterium tumefaciens EHA 105 competent cell을 섞어 액체질소에 얼린 뒤, 37℃ water bath에서 녹였다.
Ko 등(2015)의 생물검정을 통해 선발된 유전자들은 효과검정을 위해, att site가 아닌 multi-cloning site를 가지는 TRV RNA2 vector에 cloning하였다. 유전자의 sequence를 토대로 5′과 3′ 말단에 제한효소 Sac I과 Xho I (NEW ENGLAND BioLabs)을 추가하여 제작한 primer (product size 250bp)(Table 1)와 담배가루이 total RNA를 template로 one step PCR(GeNet Bio)을 이용하여 목표로 하는 유전자를 증폭하였다.
따라서 본 연구에서는 RNAi를 통해 담배가루이를 방제하기 위해 이전 실험에서 선발한 target gene에 대한 식물체내에서의 RNAi 발현 효과를 알아보았다. 먼저, 식물체 내에서의 유전자 발현 유무를 확인하고자 유전자를 cloning한 TRV vector를 담배에 접종하여 TRV의 CP를 detection하였다. 그 결과, TRV의 CP size인 624 bp와 유사한 600bp의 위치에서 band가 확인되었고, 이를 통해 식물체 내에서 TRV가 발현되고 있음을 알 수 있었다.
바이러스 접종을 위해, TRV RNA1, TRV RNA2, TRV RNA2: tobacco whitefly cDNA가 들어있는 Agrobacterium을 Kanamycin(1 ㎍/㎖)과 Rifampicin(1 ㎕/㎖)이 포함된 LB plate 배지에 streaking하여 30℃에서 1~2일간 배양하고, 접종할 기주식물인 담배(Nicotiana benthamianana)는 25℃, 16/8(L/D) 조건에서 4주간 생육하였다. Infiltration buffer(10 mM MES, 10 mM MgCl₂)에 접종할 Agrobacterium cell을 OD₆₀₀=0.
Ko 등(2015)의 생물검정을 통해 선발된 유전자들은 효과검정을 위해, att site가 아닌 multi-cloning site를 가지는 TRV RNA2 vector에 cloning하였다. 유전자의 sequence를 토대로 5′과 3′ 말단에 제한효소 Sac I과 Xho I (NEW ENGLAND BioLabs)을 추가하여 제작한 primer (product size 250bp)(Table 1)와 담배가루이 total RNA를 template로 one step PCR(GeNet Bio)을 이용하여 목표로 하는 유전자를 증폭하였다. 정제된 PCR 산물과 TRV RNA2 vector는 각각 SacI과 XhoI으로 37℃에서 digestion한 후, 정제하여 T4 DNA ligase (Promega)를 이용하여 ligation을 수행하였다.

대상 데이터

담배가루이(Bemisia tabaci)는 25±1℃, 16L:8D, 상대습도 50~60% 조건의 곤충사육실에서 서광 품종의 토마토를 기주식물로 하여 계대사육 하였다. TRV(Tobacco rattle virus)는 RNA1, RNA2의 두 개의 genome을 가지며, Liu등(2002)의 TRV RNA2 VIGS vector를 RNAi 제작에 사용하였다.

성능/효과

그 결과, TRV의 CP size인 624 bp와 유사한 600bp의 위치에서 band가 확인되었고, 이를 통해 식물체 내에서 TRV가 발현되고 있음을 알 수 있었다. CP detection후에는 TRV RNA2 vector에 cloning한 유전자도 안정적으로 발현되고 있는지 확인한 결과, insert를 포함한 증폭시킨 부분의 size와 유사한 300 bp의 위치에서 band가 나타나 삽입된 유전자도 식물체 내에서 발현되고 있는 것을 알 수 있었다. 추후 TRV vector를 통해서 목적 유전자를 접종시킨 담배를 담배가루이에게 섭식시켜 담배가루이 체내에서의 RNAi를 유도한 후 qRT-PCR을 통해 유전자 발현량의 변화를 관찰하고자 한다
먼저, 식물체 내에서의 유전자 발현 유무를 확인하고자 유전자를 cloning한 TRV vector를 담배에 접종하여 TRV의 CP를 detection하였다. 그 결과, TRV의 CP size인 624 bp와 유사한 600bp의 위치에서 band가 확인되었고, 이를 통해 식물체 내에서 TRV가 발현되고 있음을 알 수 있었다. CP detection후에는 TRV RNA2 vector에 cloning한 유전자도 안정적으로 발현되고 있는지 확인한 결과, insert를 포함한 증폭시킨 부분의 size와 유사한 300 bp의 위치에서 band가 나타나 삽입된 유전자도 식물체 내에서 발현되고 있는 것을 알 수 있었다.

후속연구

CP detection후에는 TRV RNA2 vector에 cloning한 유전자도 안정적으로 발현되고 있는지 확인한 결과, insert를 포함한 증폭시킨 부분의 size와 유사한 300 bp의 위치에서 band가 나타나 삽입된 유전자도 식물체 내에서 발현되고 있는 것을 알 수 있었다. 추후 TRV vector를 통해서 목적 유전자를 접종시킨 담배를 담배가루이에게 섭식시켜 담배가루이 체내에서의 RNAi를 유도한 후 qRT-PCR을 통해 유전자 발현량의 변화를 관찰하고자 한다

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	담배가루이는 무엇인가?	담배가루이(Bemisia tabaci)는 전 세계적으로 발생하며, 600여종 이상의 기주를 가해하는 주요 흡즙성 해충으로(Perring, 2001), 기주 선호성이나 매개하는 바이러스 등에 따라 24종의 생태형이 보고되어 있다(Bedford et al., 1994; Burban et al.
	담배가루이에 의해 매개되는 바이러스 중 토마토에 광범위한 피해를 입히는 것은?	, 1994; Jones, 2003). 특히,담배가루이에 의해 매개되는 토마토황화위축바이러스인 TYLCV (tomato yellow leaf curl virus)는 전 세계적으로 토마토에 광범위하게 피해를 입히는 바이러스로써, 우리나라에는 2008년 경상남도 통영에서 처음 발견되었으며, 현재 전국적으로 확산되어 토마토 농가에 큰 피해를 주고 있다. 담배가루이는 TYLCV의 유일한 매개충으로 알려져 있다(Czosnek et al.
	담배가루이는 어떤 살충제에 대한 약제저항성이 있는가?	, 2002). 현재까지는 피레스로이드계, 네오니코티노이드계, 곤충성장조절제(insect growth regulators, IGRs) 계통 등의 살충제에 대한 약제저항성이 알려져 있다(Horowitzet al., 2005; Karatolos et al.

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동의어: Packet Collision Rate

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