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문제 정의
- 본 연구는 경남지역의 주남저수지와 동판저수지에 우점하고 있는 2종의 수생식물에서 내생균류를 분리하여 습지에 따른 내생균류의 분포상 및 다양성을 비교 및 분석하였다
가설 설정
- 이로 미루어 볼 때 같은 식물종이라도 자생하는 환경에 따라 분리되는 균주가 다르게 나타나며, 이는 특정한 육상 지형구조에 담수가 고여있는 내륙습지라는 생태환경에 자생하는 내생균류가 차별화되어 적응한 결과로 생각된다. 둘째, 담수식물 마다 뿌리 표피 층의 두께와 근관이 다르기 때문에 수생식물 종 별로 상호작용하는 내생균류 분포상이 식물 종마다 다르다고 할 수 있을 것이다. 수생식물의 종은 다양하지 않으나 수생태계에서 독립적인 형태학적 특징을 가지고 발달 되었으며, 식물뿌리 형태와 구조 등에 따라 분포하는 미생물의 다양성과 분포상 및 내생균류도 다를 것으로 생각된다[7, 12, 13, 15].
제안 방법
- 2종의 수생식물 뿌리에서 분리된 내생균류를 각각 potato dextrose broth (PDB) 배지에 접종하여 25℃에서 120 rpm으로 7일간 진탕 배양하였고, 생장한 균체를 취하여 여과한 후에 2일간 동결 건조하였다. 건조된 균체로부터genomic DNA의 추출은 DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Germantown, MD, USA)를 이용하였고, internal transcribed spacer (ITS) 영역의 증폭을 위한 프라이머는 ITS1과 ITS4를 사용하였다[16].
- 2종의 수생식물 뿌리에서 분리된 내생균류를 각각 potato dextrose broth (PDB) 배지에 접종하여 25℃에서 120 rpm으로 7일간 진탕 배양하였고, 생장한 균체를 취하여 여과한 후에 2일간 동결 건조하였다. 건조된 균체로부터genomic DNA의 추출은 DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Germantown, MD, USA)를 이용하였고, internal transcribed spacer (ITS) 영역의 증폭을 위한 프라이머는 ITS1과 ITS4를 사용하였다[16]. 증폭된 PCR product는 purification kit (AccuPrep PCR & Gel Extraction Kit; Bioneer, Daejeon, Korea)를 사용하여 정제한 후 ABI 3730XL DNA analyzer (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA)로 ITS 영역 염기서열을 해독하였다[7, 11].
- 두 지역의 담수습지에서 분리된 내생균류의 ITS 염기서열은 NCBI GenBank에 등록하였고, 주남저수지에서 채집된 자라풀(KT037414~KT037419), 생이가래(KT037420~KT037432)와 동판저수지에서 채집된 자라풀(KT037433~KT037437), 생이가래(KT037438~KT037441)의 내생균류에 대한 accession number를 부여 받았다(Table 1). 그리고 두 지역의 담수습지에서 분리된 내생균류들의 유연관계를 확인하기 위하여, 각 습지마다 분리된 내생균류의 ITS 염기서열을 이용하여 계통수를 작성하였다(Fig. 2). 주남저수지와 동판저수지에서 분리된 내생균류에 대한 종 풍부도(species richness)는 Margalef's richness와 Mehinick’s index를 적용하여 분석하였다.
- Louis, MO, USA) 80 ppm이 함유된 Hagem minimal medium에 접종하여 25℃ 항온 조건하에서 7일간 배양하였다[14, 15]. 내생균류의 순수분리를 위해 동일 배지 및 동일 배양 환경에서 계대배양과 potato dextrose agar (PDA; Difco, Detroit, MI, USA)배지를 사용하여 동일한 배양조건하에서 계대배양하여 형태학적으로 상이한 균류들을 선발하였다.
- 다양성 분석은 내생균류의 속을 대상으로 하였고 Margalef's richness (Dmg)[18], Mehinick’s index (Dmn)[19]를 사용하였다.
- 생이가래의 중요한 환경적 기능과 높은 다양성을 보인 이들의 내생균류 응용에 대한 연구가 필요한 것으로 생각된다. 두 지역의 담수환경에 자생하는 수생식물들에서 각 식물종에 따라 어떠한 내생균류가 분포하고 있는지 비교 분석 하였으며, 유용미생물 자원 및 다양성 확보 연구의 일환으로서 수행되었다. 또한 담수습지에 자생하는 수생식물에 대한 균류자원 연구에 기초 자료가 될 것으로 생각한다.
- 수생식물의 뿌리에서 분리된 내생균류들은 다양성 분석을 통하여 각 숙주 식물체마다 균류의 다양성 지수의 변화패턴을 분석하였다. 다양성 분석은 내생균류의 속을 대상으로 하였고 Margalef's richness (Dmg)[18], Mehinick’s index (Dmn)[19]를 사용하였다.
- 채집한 식물시료의 생리적 변화를 방지하기 위해 채집장소의 담수와 함께 채취하여 4℃를 유지하며 이동하였다. 식물시료의 뿌리에 멸균수를 분무하여 이물질을 제거하였으며, 식물체 표면의 정주균 및 수생 미생물을 배제하기 위하여 멸균된 0.1% Tween 80을 표면에 10분간 처리한 후에 멸균수로 세척하였으며, 1.0% 과염소산(perchloric acid)을 10분씩 2회 처리한 후 SDW로 세척하였다[12, 13]. 이후에 멸균 건조된 거즈를 사용하여 뿌리 시료의 수분을 제거하고, 시료를 2~4 cm의 길이로 절단하였다.
- 대표적인 담수습지인 경상남도 창원시 주남저수지와 동판저수지에서 우점하는 수생식물종인 자라풀 및 생이가래를 채집하였다. 주남저수지의 자생식물 뿌리에서 19균주와 동판저수지의 자생식물 뿌리에서 9균주를 순수분리 하였다. 이들 내생균류들의 internal transcribed spacer (ITS) 영역 염기서열을 분석하여 계통수를 작성한 결과 분리된 28균주는 주남저수지의 경우 11속, 동판저수지의 경우 5속에 속하는 것으로 확인되었으며, 두 습지에서 모두 13속의 내생균류가 분리되었다.
- 증폭된 PCR product는 purification kit (AccuPrep PCR & Gel Extraction Kit; Bioneer, Daejeon, Korea)를 사용하여 정제한 후 ABI 3730XL DNA analyzer (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA)로 ITS 영역 염기서열을 해독하였다[7, 11].
- 해독된 ITS 염기서열은 NCBI의 GenBank database에서 Blast 검색을 통해 상동성이 높은 근연종의 서열들과 비교분석하였다. 계통학적 유연관계 분석은 MEGA 프로그램 (Version 6.
대상 데이터
- 경상남도 창원시에 분포하고 있는 주남저수지에서 수생식물인 소생식물목 자라풀(Hydrocharis dubia Backer; 35°18'25.46"N, 128°40'28.73"E)과 양치식물 고사리목에 속하는 생이가래(Salvinia natans All.; 35°18' 25.46"N, 128°40'28.73"E)를 각각 10개체씩 채집하였고, 동판저수지에서도 2종의 우점종인 자라풀과 생이가래를 채집하였다.
- 대표적인 담수습지인 경상남도 창원시 주남저수지와 동판저수지에서 우점하는 수생식물종인 자라풀 및 생이가래를 채집하였다. 주남저수지의 자생식물 뿌리에서 19균주와 동판저수지의 자생식물 뿌리에서 9균주를 순수분리 하였다.
이론/모형
- Phylogenetic analysis of endophytic fungi isolated from the hydrophytes in Junam and Dongpan wetlands. This phylogenetic tree was constructed by using the neighbor-joining method (1,000 bootstrap replications). Bootstrap values (70%) are indicated at relevant nodes.
- 해독된 ITS 염기서열은 NCBI의 GenBank database에서 Blast 검색을 통해 상동성이 높은 근연종의 서열들과 비교분석하였다. 계통학적 유연관계 분석은 MEGA 프로그램 (Version 6.0)을 사용하였으며[17], 염기서열들을 maximum likelihood 방법으로 Kimura 2-parameter 상수모델 알고리즘(1,000 bootstrap replications)을 이용하여 phylogenetic tree를 작성하였다.
- 주남저수지와 동판저수지에서 분리된 내생균류에 대한 종 풍부도(species richness)는 Margalef's richness와 Mehinick’s index를 적용하여 분석하였다.
성능/효과
- Margalef's richness를 적용한 경우, 주남저수지에서 분리된 내생균류의 다양성지수는 각각 자라풀(2.232), 생이가래(2.339)로 분석되었고, 동판저수지에서 분리된 자라풀(1.864), 생이가래(2.164)로 분석되었다.
- Margalef's richness을 적용한 분석에서는 주남저수지의 생이가래에서 분리된 내생균류가 가장 높은 종 풍부도를 나타내었고, Mehinick’s index를 적용한 분석에서 주남저수지의 자라풀에서 분리된 내생균류가 가장 높은 지수의 결과값이 도출되었다.
- Mehinick’s index를 적용한 경우 주남저수지에서 분리된 내생균류의 지수는 각각 자라풀(2.041), 생이가래(1.941)로 분석되었고, 동판저수지에서 분리된 자라풀(1.789), 생이가래(2.000)로 분석되었다(Table 3).
- 두 습지 지역의 자라풀에서 분리된 공통 균류는 Talaromyces속이 유일하였고, 생이가래의 경우 Fusarium 및 Phoma속이 공통적으로 분리가 되었으며 나머지 균류는 모두 다른 경향을 보였다. 그리고 자라풀에서 분리된 내생균류의 경우 주남저수지에서 Cladosporium, Pestalotiopsis, Stagonosporopsis, Trichoderma속이 차별화되어 특이적으로 분리되었고, 동판저수지에서는 Fusarium, Penicillium, Phoma속이 특이적으로 분리되었다. 생이가래에서 분리된 내생균류는 주남저수지에서 Alternaria, Cladosporium, Epicoccum, Paraconiothyrium, Phaeosphaeriopsis속이 차별화되어 특이적으로 분리되었고, 동판저수지에서는 Rhizomucor, Talaromyces속이 특이적인 것을 확인하였다(Table 2).
- 이들 중 담수습지별로 공통적으로 분리된 균주는 Fusarium, Phoma 및 Talaromyces속으로 확인되었다. 담수습지 및 식물종별 내생균류의 다양성을 분석하였을 때 각각 상이한 지수를 보였으며, 그들 중 환경생태학적으로 중요한 위치를 차지하는 생이가래가 높은 지수를 나타내었다.
- 수생식물 별로 내생균류의 분리패턴을 보면 주남저수지에서 우점하고 있던 자라풀의 경우 총 6균주가 분리되었으며 이들은 각각 5개의 속(Cladosporium, Pestalotiopsis, Talaromyces, Trichoderma, Stagonosporopsis)에 속하는 것으로 확인되었고, 생이가래의 경우 총 13균주가 분리되었으며 이들은 각각 7개의 속(Alternaria, Cladosporium, Epicoccum, Fusarium, Paraconiothyrium, Phaeosphaeriopsis, Phoma)에 속하는 것으로 확인되었다. 동판저수지에서 우점하고 있던 자라풀의 경우 5균주가 분리되었으며, 이들은 총 4개의 속(Fusarium, Penicillium, Phoma, Talaromyces)에 속하는 것으로 확인되었고, 생이가래의 경우 총 4균주가 분리되었으며 각각4개의 속(Fusarium, Phoma, Rhizomucor, Talaromyces)에 속하는 것으로 확인되었다(Table 1, Fig. 1).
- 두 습지 지역의 자라풀에서 분리된 공통 균류는 Talaromyces속이 유일하였고, 생이가래의 경우 Fusarium 및 Phoma속이 공통적으로 분리가 되었으며 나머지 균류는 모두 다른 경향을 보였다. 그리고 자라풀에서 분리된 내생균류의 경우 주남저수지에서 Cladosporium, Pestalotiopsis, Stagonosporopsis, Trichoderma속이 차별화되어 특이적으로 분리되었고, 동판저수지에서는 Fusarium, Penicillium, Phoma속이 특이적으로 분리되었다.
- 두 담수습지에서 수생식물별로 차별화된 내생균류의 분포를 보이고 있는데 이러한 현상의 원인으로는 첫째, 두 지역의 습지가 아주 가깝게 있지만 두 지역의 환경이 상이한데에서 기인된 것으로 생각되며, 각 환경 조건에 독자적으로 적응한 결과로 보인다. 물론 본 연구의 결과만으로 주남저수지와 동판저수지에 자생하는 내생균류의 다양성에 대하여 명확하게 논하기 어려울 수 있으나, 전체 13속 가운데 공통되는 3속을 제외하면 각 10속이 상이하다는 결과를 나타내었다. 이로 미루어 볼 때 같은 식물종이라도 자생하는 환경에 따라 분리되는 균주가 다르게 나타나며, 이는 특정한 육상 지형구조에 담수가 고여있는 내륙습지라는 생태환경에 자생하는 내생균류가 차별화되어 적응한 결과로 생각된다.
- 본 연구에서는 다른 식물종과 차별화되는 특성을 가진 양치식물인 생이가래에서 내생균류의 다양성이 높게 나타났는데(Table 3), 이는 양치식물이 원시적인 관다발 식물 진화의 초기에 나타난 식물로서 미생물과의 공생이 오랜 기간 이루어진 점에 기인된 것으로 생각된다. 생이가래의 중요한 환경적 기능과 높은 다양성을 보인 이들의 내생균류 응용에 대한 연구가 필요한 것으로 생각된다.
- 그리고 자라풀에서 분리된 내생균류의 경우 주남저수지에서 Cladosporium, Pestalotiopsis, Stagonosporopsis, Trichoderma속이 차별화되어 특이적으로 분리되었고, 동판저수지에서는 Fusarium, Penicillium, Phoma속이 특이적으로 분리되었다. 생이가래에서 분리된 내생균류는 주남저수지에서 Alternaria, Cladosporium, Epicoccum, Paraconiothyrium, Phaeosphaeriopsis속이 차별화되어 특이적으로 분리되었고, 동판저수지에서는 Rhizomucor, Talaromyces속이 특이적인 것을 확인하였다(Table 2).
- 수생식물 별로 내생균류의 분리패턴을 보면 주남저수지에서 우점하고 있던 자라풀의 경우 총 6균주가 분리되었으며 이들은 각각 5개의 속(Cladosporium, Pestalotiopsis, Talaromyces, Trichoderma, Stagonosporopsis)에 속하는 것으로 확인되었고, 생이가래의 경우 총 13균주가 분리되었으며 이들은 각각 7개의 속(Alternaria, Cladosporium, Epicoccum, Fusarium, Paraconiothyrium, Phaeosphaeriopsis, Phoma)에 속하는 것으로 확인되었다. 동판저수지에서 우점하고 있던 자라풀의 경우 5균주가 분리되었으며, 이들은 총 4개의 속(Fusarium, Penicillium, Phoma, Talaromyces)에 속하는 것으로 확인되었고, 생이가래의 경우 총 4균주가 분리되었으며 각각4개의 속(Fusarium, Phoma, Rhizomucor, Talaromyces)에 속하는 것으로 확인되었다(Table 1, Fig.
- 주남저수지의 자생식물 뿌리에서 19균주와 동판저수지의 자생식물 뿌리에서 9균주를 순수분리 하였다. 이들 내생균류들의 internal transcribed spacer (ITS) 영역 염기서열을 분석하여 계통수를 작성한 결과 분리된 28균주는 주남저수지의 경우 11속, 동판저수지의 경우 5속에 속하는 것으로 확인되었으며, 두 습지에서 모두 13속의 내생균류가 분리되었다. 이들 중 담수습지별로 공통적으로 분리된 균주는 Fusarium, Phoma 및 Talaromyces속으로 확인되었다.
- 이들 내생균류들의 internal transcribed spacer (ITS) 영역 염기서열을 분석하여 계통수를 작성한 결과 분리된 28균주는 주남저수지의 경우 11속, 동판저수지의 경우 5속에 속하는 것으로 확인되었으며, 두 습지에서 모두 13속의 내생균류가 분리되었다. 이들 중 담수습지별로 공통적으로 분리된 균주는 Fusarium, Phoma 및 Talaromyces속으로 확인되었다. 담수습지 및 식물종별 내생균류의 다양성을 분석하였을 때 각각 상이한 지수를 보였으며, 그들 중 환경생태학적으로 중요한 위치를 차지하는 생이가래가 높은 지수를 나타내었다.
- 전체적으로 분리되는 균류를 확인해보면, 식물병원성을 가지는 종들이 많이 분포하고 있는 Alternaria, Cladosporium, Fusarium, Rhizomucor, Pestalotiopsis와 지금까지 연구가 많이 이루어지지 않은 Epicoccum, Paraconiothyrium, Stagonosporopsis도 확인되었다.
후속연구
- 그러나 이들은 순식간에 담수 표면을 덮어 태양광을 차단해 수중 산소 농도를 감소시킨다. 결론적으로 가장 뛰어난 부영양화 제어수단인 동시에 적절한 생장 조절이 필요하며, 식물생장에 영향을 미치는 내생미생물의 역할이 중요할 것으로 생각된다. 이러한 양치식물의 내생 미생물 및 타 식물 내생 미생물과의 비교 분석학적 연구는 국내외적으로 그 수가 매우 적으며[20], 본 연구에서 분리된 Alternaria sp.
- 두 지역의 담수환경에 자생하는 수생식물들에서 각 식물종에 따라 어떠한 내생균류가 분포하고 있는지 비교 분석 하였으며, 유용미생물 자원 및 다양성 확보 연구의 일환으로서 수행되었다. 또한 담수습지에 자생하는 수생식물에 대한 균류자원 연구에 기초 자료가 될 것으로 생각한다.
- 수생식물의 종은 다양하지 않으나 수생태계에서 독립적인 형태학적 특징을 가지고 발달 되었으며, 식물뿌리 형태와 구조 등에 따라 분포하는 미생물의 다양성과 분포상 및 내생균류도 다를 것으로 생각된다[7, 12, 13, 15]. 현재까지 국내외적으로 담수습지에 자생하는 수생식물과 내생균류에 대한 연구는 많이 이루어지지 않아 보다 확대된 연구가 필요할 것이다.
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