신바로 약침의 한약재 확인시험 및 HPLC-DAD를 통한 표준화 연구 A Study on Standardization of Shinbaro Pharmacopuncture Using Herbal Medicines Identification Test and HPLC-DAD원문보기
Objectives : The present study was an evaluation and standardization of herbal components in order to establish the efficacy and safety of Shinbaro pharmacopuncture. Methods : Among the raw materials of Shinbaro pharmacopuncture, the components Cibotii Rhizoma, Eucommiae Cortex, and Ledebouriellae R...
Objectives : The present study was an evaluation and standardization of herbal components in order to establish the efficacy and safety of Shinbaro pharmacopuncture. Methods : Among the raw materials of Shinbaro pharmacopuncture, the components Cibotii Rhizoma, Eucommiae Cortex, and Ledebouriellae Radix were assessed through ingredient verification experiments using thin-layer chromatography(TLC) and ultraviolet rays(UV) lamps. In addition, we standardized Acanthopanacis Cortex and Achyranthis Radix through validation using high performance liquid chromatograph-diode array detector(HPLC-DAD). Results : As result appeared a blue-white fluorescence under ultraviolet rays; changed to dark green after adding 1 % ferric chloride solution(due to Cibotii Rhizoma), and presented a yellow-green fluorescence when mixed with an ethyl ether under UV lamps by way of the ethyl ether layer, confirming Eucommiae Cortex. Ledebouriellae Radix was confirmed as dark brown spots at Rf values of 0.56 and 0.71 using TLC. Additionally, Acanthopanacis Cortex and Achyranthis Radix HPLC test results showed that linearity was $R^2{\geq}0.99$, and detection limit and quantitation limit were 0.23 to $1.29{\mu}g/mL$, and 0.71 to $3.90{\mu}g/mL$, respectively. Furthermore, precision and accuracy were confirmed to have relative standard deviation(RSD) values of 0.10 to 1.89 % and 96.19 to 103.72 %, respectively. Shinbaro pharmacopuncture did not have any overlapping or interference from other peaks in detection under the abovementioned analysis conditions. Conclusions : In conclusion, we confirmed that maintenance of Shinbaro pharmacopuncture validity was possible by means of quality control of Cibotii Rhizoma, Eucommiae Cortex, and Ledebouriellae Radix through ingredient identification and Acanthopanacis Cortex and Achyranthis Radix through high performance liquid chromatograph(HPLC) analysis. Further, we hope to contribute to the development strategy of herbal industry acupuncture.
Objectives : The present study was an evaluation and standardization of herbal components in order to establish the efficacy and safety of Shinbaro pharmacopuncture. Methods : Among the raw materials of Shinbaro pharmacopuncture, the components Cibotii Rhizoma, Eucommiae Cortex, and Ledebouriellae Radix were assessed through ingredient verification experiments using thin-layer chromatography(TLC) and ultraviolet rays(UV) lamps. In addition, we standardized Acanthopanacis Cortex and Achyranthis Radix through validation using high performance liquid chromatograph-diode array detector(HPLC-DAD). Results : As result appeared a blue-white fluorescence under ultraviolet rays; changed to dark green after adding 1 % ferric chloride solution(due to Cibotii Rhizoma), and presented a yellow-green fluorescence when mixed with an ethyl ether under UV lamps by way of the ethyl ether layer, confirming Eucommiae Cortex. Ledebouriellae Radix was confirmed as dark brown spots at Rf values of 0.56 and 0.71 using TLC. Additionally, Acanthopanacis Cortex and Achyranthis Radix HPLC test results showed that linearity was $R^2{\geq}0.99$, and detection limit and quantitation limit were 0.23 to $1.29{\mu}g/mL$, and 0.71 to $3.90{\mu}g/mL$, respectively. Furthermore, precision and accuracy were confirmed to have relative standard deviation(RSD) values of 0.10 to 1.89 % and 96.19 to 103.72 %, respectively. Shinbaro pharmacopuncture did not have any overlapping or interference from other peaks in detection under the abovementioned analysis conditions. Conclusions : In conclusion, we confirmed that maintenance of Shinbaro pharmacopuncture validity was possible by means of quality control of Cibotii Rhizoma, Eucommiae Cortex, and Ledebouriellae Radix through ingredient identification and Acanthopanacis Cortex and Achyranthis Radix through high performance liquid chromatograph(HPLC) analysis. Further, we hope to contribute to the development strategy of herbal industry acupuncture.
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문제 정의
또한, HPLC-UV를 이용하여 우슬의 부위별 20E의 정량을 확인하는 연구도 진행되고 있다32). 따라서 본 연구에서는 신바로약침에서 우슬의 지표물질인 20E의 최적 분리능을 설정하여 실험을 진행하였다.
본 연구에서는 신바로약침 중 GCSB-5(청파전)에 근간이 되는 대표적인 약재인 구척아ㆍ식방풍ㆍ두충에 대한 한약재 확인시험법과 high performance liquid chromatographdiode array detector(HPLC-DAD)를 통한 오가피와 우슬에 대해 표준화 작업에 대한 연구를 하여 품질관리의 기초자료로 사용하고자 하였다.
제안 방법
20 mg 신바로약침 분말을 2 mL 물에 녹이고 syringe filter를 한 후 HPLC 실험에 사용하였다.
구척은 두 가지 방법으로 확인실험을 진행하였다. Fig. 1a와 같이 신바로약침액과 구척 표준 생약을 여과지 위에 떨어뜨린 후 자외선(365 nm)을 조사하였을 때 두 용액 모두에서 청백색의 형광을 확인하였다. 또 다른 실험법에서는 Fig.
HPLC 분석 조건에 의하여 5개의 농도(1, 5, 10, 50, 100 μg/mL)별로 3회 반복시험을 하였다.
두충은 TLC법으로 확인시험을 진행하였다. TLC판을 105 ℃에서 10분간 가열하여 신바로약침액에서 얻은 여러 개의 반점은 두충 표준 생약 표준액에서 얻은 색상 및 Rf값이 같고 암갈색 반점을 확인하였다.
각 농도별 면적 값의 비율을 계산하여 표준품 농도(x, μg/mL)와 피크 면적비(y)에 대한 검량선(calibration curve, y=ax+b)을 구하였다.
각 표준 물질의 피크 면적(y)에 대한 검량선 표준 농도(x, μg/mL)와 비교하였다.
각 표준품의 3(5, 10, 50 μg/mL)가지 농도로, withinrun(inter-day)은 1일 동안에 4회 반복해서 수행 하였으며(n=4 반복/1일), Between-run(intra-day)은 1일에 4회 반복을 3일간(1, 3, 7일) 반복 수행하였다(n=3일, 4 반복/1일).
구척은 두 가지 방법으로 확인실험을 진행하였다. Fig.
추출액 여과 후 여액을 감압 농축하였다. 농축된 추출물을 80 % 및 90 % 주정을 이용하여 알코올 수침을 통해 정제하였으며 정제된 추출물은 여과 후 동결 건조하여 약침의 원료로 사용하였다. 정제된 약침 원료를 정제수에 녹이고 121 ℃에서 15분 멸균하여 사용하였다.
1c와 같이 ethyl ether층이 자외선 등 아래에서 황록색의 형광을 확인하였다. 두충은 TLC 방법을 이용하여 실험하였다. TLC판을 105 ℃에서 10분간 가열하면 신바로약침액에서 얻은 여러 개의 반점은 두충 표준 생약액에서 얻은 색상 및 Rf값이 같고, 그 중 Rf값 0.
둘째, 구척 1 g을 물 10 mL에 넣고 수욕에서 15분간 가열한 다음 여과하고 여액 2 mL에 1 % 염화철(Ⅲ)(Iron(Ⅲ)chloride)용액을 떨어뜨려 어두운 녹색으로 변함을 관찰하였다.
최근에 생약복합제 GCSB-5의 품질 표준화를 위한 구척의 지표성분을 탐색하는 연구 등 구척의 지표물질 설정에 대한 연구가 진행되고 있지만, 표준화 작업을 하기 위해서는 아직 미비한 상태이다20,21). 따라서 본 연구에서는 ≪대한약전외한약(생약)규격집≫에 나온 방법을 사용하여 2가지 실험을 진행하였다. 첫 번째 실험에서는 신바로약침액과 구척 표준 생약을 여과지 위에 떨어뜨린 다음 자외선(365 nm)을 쪼일 때 두 용액 모두에서 청백색의 형광이 나타남을 확인하였다.
또한, Hong19)은 약침 제제 및 약침의 효과를 설문조사를 통해 살펴보았을 때 임상에서 효과적이며 근골격계 질환에 다용되는 치료기술임을 알 수 있었으나, 과학적인 검증을 통한 치료기술제시의 필요성을 시사하였다. 따라서, 본 연구에서는 신바로약침의 표준화 방안 확립을 위해 구척ㆍ식방풍 및 두충은 ≪대한약전외한약(생약)규격집≫에 명시된 방법을 사용하여 빠르고 간편한 확인실험을 실행하였으며, 오가피와 우슬에 대해서는 지표물질을 선정하여 HPLC를 이용해 정량 분석을 하였다.
따라서, 정밀성 검사는 3가지 농도를 설정을 하여(5, 10, 50 μg/mL) 하루 내에 실험을 하여 within-run(intra-assay precision, n=4반복/1일)은 4회 반복하여 실험하였으며, 3일에 걸쳐(1, 3, 7일) 각 4회씩 실험을 하여 etween-run(intermediate precision, n=3일, 4반복/1일)를 실행했다.
식방풍 1.0 g에 ethyl ether 10 mL를 넣어 5분간 흔들어 섞은 다음 여과한 ethyl ether층을 자외선 등 아래에서 색을 관찰하였다.
신바로약침 및 두충 표준액 각각 10 μL씩을 TLC용 실리카겔을 써서 만든 박층판에 점적한 후 chloroform · methanol · water 혼합액(10 : 5 : 1)을 전개용매로하여 약 10 cm 전개하였다.
신바로약침의 약재 중 구척ㆍ두충ㆍ식방풍에 대한 확인시험은 ≪대한약전외한약(생약)규격집≫의 각 항목별 확인시험법을 응용하여 시행하였다5).
신바로약침의 약재인 구척ㆍ식방풍ㆍ두충ㆍ오가피ㆍ우슬 등 총 9가지 약재 총 150 g을 넣고 70 % 주정을 이용하여 3시간 동안 환류 추출하였다. 이때, 추출에 사용된 물은 water purification system(Model: ABBOTA NEO)을 이용하여 제조된 3차 증류수를 사용하였다.
신바로약침의 주요 활성 성분들 중 AD 및 20E를 정량 분석하였다. 신바로약침에서 AD와 20E는 다른 피크의 중첩이나 간섭 없이 검출됨을 확인하였다(Fig.
첫째, 구척 1 g을 methanol 10 mL에 넣고 수욕에서 15분간 가열한 다음 여과하였다. 여액을 여과지 위에 떨어뜨린 다음 자외선(365 nm)을 쪼여 색을 관찰하였다.
99 이상이 되면 적합한 직선성이 있는 것으로 판별하였다. 오가피 및 우슬의 지표물질인 AD와 20E 분석을 위한 최적 HPLC 분석 조건의 최소 검출한계(LOD)를 확인하기 위해 signal 대비 noise 비율(S/N ratio)이 3.3이 되는 조건과 정량한계(LOQ)는 10이 되는 조건에서 분석을 하였다.
‘GCSB-5’는 자생한방병원의 골관절질환 치료한약인 ‘청파전’에 포함된 6가지 약재(구척ㆍ방풍ㆍ두충ㆍ가피ㆍ우슬ㆍ대두황권) 혼합물이 정제된 추출물로서 항염증, 신경재생, 연골보호 등의 효과를 보인다고 알려져 있다1-4). 이를 바탕으로 신바로약침은 구척(狗脊, Cibotii Rhizoma)ㆍ식방풍(植防風, Ledebouriellae Radix)ㆍ두충(杜沖, Eucommiae Cortex)ㆍ오가피(五加皮, Acanthopanacis Cortex)ㆍ우슬(牛膝, Achyranthis Radix)ㆍ오공(蜈蚣, Scolopendra subspinipes mutilans)ㆍ강활(羌活, Ostericum koraenum(Max) Kitagawa)ㆍ독활(獨活, Aralia contientalis), 그리고 작약(芍藥, Paeonia lactiflora) 등으로 총 9가지 약재로 만들어 졌으며, 이중 GCSB-5(청파전)에서 효능이 있었던 약재들을 이용해 연구를 하였다.
(2) 정밀성(precision) 측정
정밀성 측정은 실험 환경의 변화에 따라 동일한 샘플에 대한 분석 결과의 변화 정도를 확인하기 위하여 상대 표준 편차(relative standard deviation, RSD)를 조사 하였다. 이는 반복성(intra-assay precision), 실험실 내 정밀성(intermediate precision)으로 검토될 수 있다.
표준액 3가지 농도(5, 10, 50 μg/mL)를 각 3회 주입하여 얻은 결과를 검량선에 대입하여 얻은 결과와 참값의 오차 정도(recovery, %)로서 정확성을 평가 하였다.
오가피에 대한 AD의 함량을 연구한 논문에서 분석시간이 25분이 채 되지 않았다30). 하지만 본 연구에서 사용된 약침은 복합한약재이기 때문에 분리된 AD의 peak을 얻기 위하여 100분대의 retention time을 설정하고 실험을 진행하였다. 우슬의 지표물질인 20E는 분자구조에 α, β-unsaturated ketone group이 있어 UV detector에 검출이 용이하다31).
대상 데이터
이동상의 용매인 water(JT Baker, USA)와 acetonitrile(JT Baker, USA) 그리고 methanol(JT Baker, USA)은 모두 HPLC급 용매를 사용하였다. HPLC는 waters사의 waters 600s controller, watersTM 626 pump, waters temperature control module, waters In-Line degasser, watersTM 717plus autosampler, watersTM 996 photodiode array detector(PDA)를 사용하였다.
본 연구에서 사용된 methanol, water, ethyl ether, chloroform은 모두 JT Baker(USA)사의 제품을 사용하였다. 또한, sulfuric acid, iron(Ⅲ) chloride은 Sigma(USA)사의 제품을 구입하였다. 박층크로마토그래프(thinlayer chromatography, TLC)는 TLC silicagel 60 F254(Merck, Germany)를 구입하였으며, 자외선 등(ultraviolet rays(UV) lamp)은 VL- 4.
또한, sulfuric acid, iron(Ⅲ) chloride은 Sigma(USA)사의 제품을 구입하였다. 박층크로마토그래프(thinlayer chromatography, TLC)는 TLC silicagel 60 F254(Merck, Germany)를 구입하였으며, 자외선 등(ultraviolet rays(UV) lamp)은 VL- 4.LC(Vilber Lourmat, France)을 구입하여 사용하였다.
본 연구에서 사용된 methanol, water, ethyl ether, chloroform은 모두 JT Baker(USA)사의 제품을 사용하였다. 또한, sulfuric acid, iron(Ⅲ) chloride은 Sigma(USA)사의 제품을 구입하였다.
본 연구에서 사용된 표준품 acanthoside D(AD)는 APLS(Japan)사, 20-hydroxyecdysone(20E)은 Sigma사(USA)에서 구입하였다. 이들 표준품의 순도는 HPLC 분석급으로 93 % 순도 이상인 것을 사용하였다.
데이터처리
각 표준품의 3(5, 10, 50 μg/mL)가지 농도로, withinrun(inter-day)은 1일 동안에 4회 반복해서 수행 하였으며(n=4 반복/1일), Between-run(intra-day)은 1일에 4회 반복을 3일간(1, 3, 7일) 반복 수행하였다(n=3일, 4 반복/1일). 그리고 그 결과는 relative standard deviation(RSD, %) 값을 통하여 평가하였다. 따라서, AD와 20E의 within-run은 각각 0.
이론/모형
두충은 TLC법으로 확인시험을 진행하였다. TLC판을 105 ℃에서 10분간 가열하여 신바로약침액에서 얻은 여러 개의 반점은 두충 표준 생약 표준액에서 얻은 색상 및 Rf값이 같고 암갈색 반점을 확인하였다.
본 실험의 HPLC 분석방법은 유럽 의약청(European Medicines Agency, EMA) guideline에 따라 직선성(linearity), 검출한계(limit of detection, LOD), 정량한계(limit of quantification, LOQ), 반복실험을 통한 정밀성(precision)확인, 회수율(recovery)실험을 통한 정확성(accuracy)평가를 통해 검증하였다16).
본 연구에서 사용한 HPLC 분석방법은 유럽 의약청 (European Medicines Agency, EMA) guideline에 따라 검증하였다16).
성능/효과
정확도 평가는 AD와 20E의 검량선을 통해 3(5, 10, 50 μg/mL)가지 농도에서 표준 성분을 검출하고 회수율(recovery) 확인을 위해 3회 반복하였다. AD의 회수율은 97.90 ~ 103.72 %(RSD% : 0.50 ~ 1.86 %)였으며, 20E의 회수율은 96.19 ~ 100.55 %(RSD% : 0.87 ~ 0.97 %)였음을 확인하였다. 회수율 실험을 통해 설정된 분석조건이 정확성(accuracy)이 있음을 확인 할 수 있었다(Table 3).
두충은 TLC 방법을 이용하여 실험하였다. TLC판을 105 ℃에서 10분간 가열하면 신바로약침액에서 얻은 여러 개의 반점은 두충 표준 생약액에서 얻은 색상 및 Rf값이 같고, 그 중 Rf값 0.56(Rf=5/9) 및 0.71(Rf=6.4/9) 부근에서 각각 암갈색 반점을 확인하였다(Fig. 2).
42 %였음을 확인하였다. Within-run과 between-run의 RSD %가 3% 미만의 정밀성으로 정당한 분석 조건임을 확인하였다(Table 2).
각 농도별 면적 값의 비율을 계산하여 표준품 농도(x, μg/mL)와 피크 면적비(y)에 대한 검량선(calibration curve, y=ax+b)을 구하였다. 검량선으로부터 직선성의 상관계수(correlation coefficient, R2)가 0.99 이상이 되면 적합한 직선성이 있는 것으로 판별하였다. 오가피 및 우슬의 지표물질인 AD와 20E 분석을 위한 최적 HPLC 분석 조건의 최소 검출한계(LOD)를 확인하기 위해 signal 대비 noise 비율(S/N ratio)이 3.
첫 번째 실험에서는 신바로약침액과 구척 표준 생약을 여과지 위에 떨어뜨린 다음 자외선(365 nm)을 쪼일 때 두 용액 모두에서 청백색의 형광이 나타남을 확인하였다. 두 번째 실험에서는 구척에 1 % 염화철(Ⅲ)(iron(Ⅲ) chloride) 용액을 첨가하면 어두운 녹색으로 변하는 것을 확인하였다. 이는 금속이온인 철(Fe3+)이온과 페놀류가 착화물(chelate)을 형성해 발색이 되는 것으로 알려졌으며, 색은 페놀류의 구조에 따라 다르다22).
이는 금속이온인 철(Fe3+)이온과 페놀류가 착화물(chelate)을 형성해 발색이 되는 것으로 알려졌으며, 색은 페놀류의 구조에 따라 다르다22). 따라서 신바로약침 중 광화학 반응과 1 % 염화철(Ⅲ)(iron(Ⅲ) chloride) 용액 확인을 함으로써 다른 생약 성분들과 구별할 빠르고 간편한 방법임을 확인할 수 있었다.
그리고 그 결과는 relative standard deviation(RSD, %) 값을 통하여 평가하였다. 따라서, AD와 20E의 within-run은 각각 0.90 ~ 1.32 %, 0.79 ~ 0.89 %였으며, betweenrun은 각각 0.10~0.46 %, 0.25~1.42 %였음을 확인하였다. Within-run과 between-run의 RSD %가 3% 미만의 정밀성으로 정당한 분석 조건임을 확인하였다(Table 2).
각 표준 물질의 피크 면적(y)에 대한 검량선 표준 농도(x, μg/mL)와 비교하였다. 분석 실험 결과 Fig. 3a와 b처럼 AD와 20E는 각 표준물질을 정량하기 위해 분석 피크의 간섭과 중첩 없이 각각 205 nm, 246 nm 파장에서 검출이 가능하였다. 또한, 검량선 양호한 상관 계수(R2)는 0.
신바로약침의 주요 활성 성분들 중 AD 및 20E를 정량 분석하였다. 신바로약침에서 AD와 20E는 다른 피크의 중첩이나 간섭 없이 검출됨을 확인하였다(Fig. 3c, d).
오가피와 우슬은 HPLC로 약침에서 분석 가능성을 확인하였다. 오가피는 항산화, 항암, 항염증, 멜라닌색소저해 등 여러 약리효능이 있으며 지표성분은 acanthoside D(AD)이다.
정확도 평가는 AD와 20E의 검량선을 통해 3(5, 10, 50 μg/mL)가지 농도에서 표준 성분을 검출하고 회수율(recovery) 확인을 위해 3회 반복하였다.
따라서 본 연구에서는 ≪대한약전외한약(생약)규격집≫에 나온 방법을 사용하여 2가지 실험을 진행하였다. 첫 번째 실험에서는 신바로약침액과 구척 표준 생약을 여과지 위에 떨어뜨린 다음 자외선(365 nm)을 쪼일 때 두 용액 모두에서 청백색의 형광이 나타남을 확인하였다. 두 번째 실험에서는 구척에 1 % 염화철(Ⅲ)(iron(Ⅲ) chloride) 용액을 첨가하면 어두운 녹색으로 변하는 것을 확인하였다.
97 %)였음을 확인하였다. 회수율 실험을 통해 설정된 분석조건이 정확성(accuracy)이 있음을 확인 할 수 있었다(Table 3).
후속연구
결론적으로 신바로약침은 구척 · 식방풍 · 두충의 확인시험과 오가피와 우슬의 HPLC 정량분석실험으로 품질관리 기준 설정이 가능할 것이며, 아울러 한방산업에서의 약침개발 전략에의 기여를 기대한다.
이처럼 약침의 원료는 자연조건에서 자라나는 천연물이며, 다양한 한약재가 복합으로 들어있는 복합제제이기 때문에 약효와 관련되는 성분이 분해되거나 변화가 일어날 가능성도 배제할 수 없을 것이다. 그러므로 약침을 조제할 때는 lot 간 동등성, lot 내 균질성 및 동일처방 유사품과의 유사도(similarity)를 확인하는 것이 매우 중요하며, 체계적이고 효율적인 품질관리를 위해 모니터링을 하기 위한 연구가 필요하다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
식방풍에는 무엇이 함유되어 있는가?
식방풍은 갯기름나물 Peucedanum japonicum THUNBERG(산형과 Umbelliferae)의 뿌리로 특유한 냄새가 있고 맛은 부드럽고 약간 쓰며, 두통, 중풍, 해열, 신경통에 주요한 효능이 있다5). 구성성분은 Coumarin계인 peucedanol-7-Oβ-D-glucopyranoside, hyuganin C, 3',4'-disenecioylkhellactone 등의 성분을 함유하고 있어 물추출물은 알레르기 면역반응 매개물질들의 분비를 감소시키고 폐 조직 내 염증반응을 억제함으로써 기관지 천식을 개선하는 효능이 있다7,8).
신바로약침이란 무엇인가?
신바로약침은 생약복합제인 GCSB-5(청파전)의 근간이 되는 약재들을 바탕으로 개발된 약침이다. ‘GCSB-5’는 자생한방병원의 골관절질환 치료한약인 ‘청파전’에 포함된 6가지 약재(구척ㆍ방풍ㆍ두충ㆍ가피ㆍ우슬ㆍ대두황권) 혼합물이 정제된 추출물로서 항염증, 신경재생, 연골보호 등의 효과를 보인다고 알려져 있다1-4).
청파전에 포함된 6가지 약재는 무엇인가?
신바로약침은 생약복합제인 GCSB-5(청파전)의 근간이 되는 약재들을 바탕으로 개발된 약침이다. ‘GCSB-5’는 자생한방병원의 골관절질환 치료한약인 ‘청파전’에 포함된 6가지 약재(구척ㆍ방풍ㆍ두충ㆍ가피ㆍ우슬ㆍ대두황권) 혼합물이 정제된 추출물로서 항염증, 신경재생, 연골보호 등의 효과를 보인다고 알려져 있다1-4). 이를 바탕으로 신바로약침은 구척(狗脊, Cibotii Rhizoma)ㆍ식방풍(植防風, Ledebouriellae Radix)ㆍ두충(杜沖, Eucommiae Cortex)ㆍ오가피(五加皮, Acanthopanacis Cortex)ㆍ우슬(牛膝, Achyranthis Radix)ㆍ오공(蜈蚣, Scolopendra subspinipes mutilans)ㆍ강활(羌活, Ostericum koraenum(Max) Kitagawa)ㆍ독활(獨活, Aralia contientalis), 그리고 작약(芍藥, Paeonia lactiflora) 등으로 총 9가지 약재로 만들어 졌으며, 이중 GCSB-5(청파전)에서 효능이 있었던 약재들을 이용해 연구를 하였다.
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