소나무재선충에 대한 방선균 균주의 살선충 및 증식억제 효과 Nematicidal and Reproduction Supression Activity of Actinomyces Isolates against Pine Wood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus원문보기
우리나라의 소나무림에 만연되어 있는 소나무재선충에 대한 살선충 및 증식억제 활성을 우리나라 산림토양으로부터 분리 한 방선균을 이용하여 수행하였다. 우리나라 산림토양에서 분리 된 32개의 방선균 균주들 중 21개 균주의 2배 배양여액에서 소나무재선충에 대한 보정사충율이 90% 이상을 나타내었다. 방선균들 중 AM210, SG16, YD116, YD315 균주의 병원성이 가장 높았으며 YD116 균주는 분자생물학적, 형태적 특성 조사결과 Streptomyces atratus로 동정되었다. S. atratus로부터 몇 가지 활성 물질들이 알려져 있으며 그들 중 세포독성을 가지는 hydrazidomycin과 유사한 hydrazine hydrate를 이용하여 소나무재선충에 대한 살선충 활성을 검정하였다. 10 ppm 농도의 hydrazine hydrate는 소나무재선충에 대하여 60.8%의 보정사충율을 보였다. S. atratus YD116 균주의 실용화를 위한 부가적인 연구가 필요할 것이다.
우리나라의 소나무림에 만연되어 있는 소나무재선충에 대한 살선충 및 증식억제 활성을 우리나라 산림토양으로부터 분리 한 방선균을 이용하여 수행하였다. 우리나라 산림토양에서 분리 된 32개의 방선균 균주들 중 21개 균주의 2배 배양여액에서 소나무재선충에 대한 보정사충율이 90% 이상을 나타내었다. 방선균들 중 AM210, SG16, YD116, YD315 균주의 병원성이 가장 높았으며 YD116 균주는 분자생물학적, 형태적 특성 조사결과 Streptomyces atratus로 동정되었다. S. atratus로부터 몇 가지 활성 물질들이 알려져 있으며 그들 중 세포독성을 가지는 hydrazidomycin과 유사한 hydrazine hydrate를 이용하여 소나무재선충에 대한 살선충 활성을 검정하였다. 10 ppm 농도의 hydrazine hydrate는 소나무재선충에 대하여 60.8%의 보정사충율을 보였다. S. atratus YD116 균주의 실용화를 위한 부가적인 연구가 필요할 것이다.
Thirty-two actinomycetes isolates from Korean forest soil were screened for their nematicidal and reproduction suppression activity against pine wood nematode (PWN) which is widely spread in Korea. Culture filterates of 21 isolates showed more than 90% mortality at 2-fold concentration. Among them, ...
Thirty-two actinomycetes isolates from Korean forest soil were screened for their nematicidal and reproduction suppression activity against pine wood nematode (PWN) which is widely spread in Korea. Culture filterates of 21 isolates showed more than 90% mortality at 2-fold concentration. Among them, AM210, SG16, YD116 and YD315 were more effective than others on reproduction of PWN. The YD116 isolate was identified as Streptomyces atratus by morphological and 16S rDNA analyses. Hydrazine hydrate, similar to hydrazidomycin which has cytotoxicity among substances from S. atratus against PWN, was tested for its nematicidal activity. Ten ppm of the hydrate showed 60.8% mortality. Additional studies are needed for practical use of the S. atratus YD116 isolate.
Thirty-two actinomycetes isolates from Korean forest soil were screened for their nematicidal and reproduction suppression activity against pine wood nematode (PWN) which is widely spread in Korea. Culture filterates of 21 isolates showed more than 90% mortality at 2-fold concentration. Among them, AM210, SG16, YD116 and YD315 were more effective than others on reproduction of PWN. The YD116 isolate was identified as Streptomyces atratus by morphological and 16S rDNA analyses. Hydrazine hydrate, similar to hydrazidomycin which has cytotoxicity among substances from S. atratus against PWN, was tested for its nematicidal activity. Ten ppm of the hydrate showed 60.8% mortality. Additional studies are needed for practical use of the S. atratus YD116 isolate.
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문제 정의
, 2009) 다양한 방법으로 살선충 활성 검정이 필요하다. 따라서 본 연구에서는 산림토양으로부터 분리된 방선균을 이용하여 살선충 활성을 검정하여 소나무재선충 방제에 활용할 수 있는 환경친화적 대체 물질 탐색을 위하여 수행하였다.
제안 방법
Hydrazine hydrate가 소나무재선충의 증식에 미치는 영향을 알아보기 위하여 농도별로 실내 스크리닝 실험에 이용하고 남은 5 ml 중 각각 1 ml 씩 취하여 B. cineria가 충분히 자란 PDA (potato dextrose agar, DifcoTM)평판 배지에 접종 후 20일 동안 24°C의 배양기(HB-303DH-0, Hanbaek Scientific Co.)에 보관하였다.
소나무재선충의 증식 수를 알아보기 위하여 밀도를 조사하였는데 깔때기법을 이용하여 소나무재선충을 배지로부터 분리하여 해부현미경으로 조사하였다. 각 처리구 모두 4 반복씩 수행하였다.
살선충 활성은 상기의 실험들과 동일하게 수행하였다. 각각의 conical tube (50 ml, SPL)에 소나무재선충 현탁액(200마리/1 ml)을 5 ml씩 분주한 후 hydrazine hydrate를 2, 20, 200, 2000ppm 농도로 5 ml씩 처리하였다. 무처리는 소나무재선충 현탁액 5 ml와 멸균 증류수 5 ml를 처리하였다.
방선균 배양 여액을 이용한 소나무재선충 증식 억제 실험에서 효과가 우수한 균주들 중 YD116 방선균 균주를 이용하여 농도별로 소나무재선충 증식억제 효과를 검토하였다. 살선충 활성 실험은 각각의 conical tube (50 ml, SPL)에 소나무재선충 현탁액(200마리/1 ml)을 5 ml씩 분주한 후 방선균 균주 YD116 배양 여액을 농도별(원액, 5, 10, 50, 500배 희석액)로 5 ml씩 처리하였다.
방선균의 살선충 활성을 검정하기 위하여 12 well cell culture plate (85.4 × 127.6 mm, SPL)에 소나무재선충 현탁액(100마리/0.5 ml)을 0.5 ml씩 분주한 후 방선균 배양 여액 원액을 0.5 ml씩 처리하였다.
방선균이 증식에 미치는 영향을 알아보기 위하여 각각의 conical tube (50 ml, SPL)에 소나무재선충 현탁액(200마리/1 ml)을 5 ml씩 분주한 후 방선균 배양 여액 10배 희석액을 5 ml (방선균 배양 여액 0.5 ml + 멸균 증류수 4.5 ml)씩 처리하였다. 무처리는 소나무재선충 현탁액 5 ml와 멸균 증류수 5 ml를 처리하였다.
소나무재선충의 증식 수를 알아보기 위하여 깔때기법으로 소나무재선충을 배지로부터 분리하여 해부현미경으로 조사하였다. 본 실험은 3회 반복 실시하였다.
방선균 배양 여액을 이용한 소나무재선충 증식 억제 실험에서 효과가 우수한 균주들 중 YD116 방선균 균주를 이용하여 농도별로 소나무재선충 증식억제 효과를 검토하였다. 살선충 활성 실험은 각각의 conical tube (50 ml, SPL)에 소나무재선충 현탁액(200마리/1 ml)을 5 ml씩 분주한 후 방선균 균주 YD116 배양 여액을 농도별(원액, 5, 10, 50, 500배 희석액)로 5 ml씩 처리하였다. 무처리는 소나무재선충 현탁액 5 ml와 멸균 증류수 5 ml를 처리하였다.
선발 균주의 chromosomal DNA를 분리한 후 primer 518F (5'-CCAGCA GCCGCGGTAATACG-3')와 800R (5'-TACCAGGGTATCTAATCC-3') primer를 사용하여 94°C에서 1분간 denaturation, 60℃에서 1분간 annealing, 72℃에서 1분 30초 동안 polymerization시키는 조건에서 PCR로 증폭하였다.
처리 후 상온에서 48시간 방치 후 해부현미경(SMZ800, Nikon)으로 선충의 치사 여부를 조사하였다. 선충의 치사 여부는 핀으로 자극하였을 때 반응이 없는 것은 죽은 것으로 간주하였으며, 본 실험은 4회 반복 실시하였다.
소나무재선충에 대한 살선충 효과가 높았던 YD116 균주의 16S rDNA의 염기서열을 분석하였다. 선발 균주의 chromosomal DNA를 분리한 후 primer 518F (5'-CCAGCA GCCGCGGTAATACG-3')와 800R (5'-TACCAGGGTATCTAATCC-3') primer를 사용하여 94°C에서 1분간 denaturation, 60℃에서 1분간 annealing, 72℃에서 1분 30초 동안 polymerization시키는 조건에서 PCR로 증폭하였다.
)에 보관하였다. 소나무재선충의 증식 수를 알아보기 위하여 깔때기법으로 소나무재선충을 배지로부터 분리하여 해부현미경으로 조사하였다. 본 실험은 3회 반복 실시하였다.
)에 보관하였다. 소나무재선충의 증식 수를 알아보기 위하여 밀도를 조사하였는데 깔때기법을 이용하여 소나무재선충을 배지로부터 분리하여 해부현미경으로 조사하였다. 각 처리구 모두 4 반복씩 수행하였다.
원액 처리구에서 효과가 좋았던 균주 15개를 선발하여 2, 3차 실험을 진행하였다. 실험은 1차와 동일하게 진행하였으며 방선균 배양 여액의 농도를 2차에서는 2배액, 3차에서는 5배액으로 희석한 후 각각 0.5 ml씩 처리하였다. 소나무재선충 현탁액은 0.
처리 후 상온에서 48시간 방치 후 1 ml를 취하여 해부현미경(SMZ800, Nikon)하에서 선충의 치사 여부를 조사하였다. 실험은 5 반복으로 수행하였다.
원액 처리구에서 효과가 좋았던 균주 15개를 선발하여 2, 3차 실험을 진행하였다. 실험은 1차와 동일하게 진행하였으며 방선균 배양 여액의 농도를 2차에서는 2배액, 3차에서는 5배액으로 희석한 후 각각 0.
0001). 이들 균주들 중 효과가 높은 15개의 균주를 선발하여 2차와 3차 살선충 활성을 검정하였다(Table 3).
, 1994)가 분리되었다. 이들 물질 중 세포 독성을 가지고 있는 hydrazidomycin과 유사한 물질이면서 구매가 용이한 hydrazine hydrate를 이용하여 소나무재선충에 대한 살선충 활성을 검정하였다. 살선충 활성은 상기의 실험들과 동일하게 수행하였다.
증식에 미치는 영향은 방선균이 소나무재선충의 증식에 미치는 영향 실험과 동일한 방법으로 수행하였으며 배양 여액의 농도는 원액과 5, 10, 50, 500배액으로 하여 수행하였고, 5회 반복으로 실험하였다.
선발 균주의 chromosomal DNA를 분리한 후 primer 518F (5'-CCAGCA GCCGCGGTAATACG-3')와 800R (5'-TACCAGGGTATCTAATCC-3') primer를 사용하여 94°C에서 1분간 denaturation, 60℃에서 1분간 annealing, 72℃에서 1분 30초 동안 polymerization시키는 조건에서 PCR로 증폭하였다. 증폭된 PCR 결과물을 0.8% agarose gel electrophoresis를 수행한 후 분리 정제하여 ABI PRISM 3700 DNA Analyzer를 이용하여 염기서열을 분석하였다. 분석된 염기서열은 BLASTN 프로그램을 이용하여 GENEBANK의 RDP (RNA database project)를 활용하여 분석하였다.
채집한 토양은 상온에서 24시간 건조 후 토양 10 g을 멸균 증류수 90 ml가 들어있는 삼각플라스크에 넣고, 30분 동안 20℃에서 진탕 배양 후 시료를 10−3까지 10배 단위로 단계적으로 멸균 증류수를 이용하여 희석한 후 희석액 50 µl를 취하여 방선균 분리용 배지(Actinomycete Isolation Agar, DifcoTM)에 분주하여 도말 후 20℃의 배양기(HB-303DH-0, Hanbaek Scientific Co.)에 배양하면서 전형적인 방선균 균총을 형성하는 균을 분리하여 사용하였다.
무처리는 소나무재선충 현탁액 5 ml와 멸균 증류수 5 ml를 처리하였다. 처리 후 상온에서 48시간 방치 후 1 ml를 취하여 해부 현미경(SMZ800, Nikon)으로 선충의 치사 여부를 조사하였다. 실험은 5 반복으로 수행하였다.
무처리는 소나무재선충 현탁액 5 ml와 멸균 증류수 5 ml를 처리하였다. 처리 후 상온에서 48시간 방치 후 1 ml를 취하여 해부현미경(SMZ800, Nikon)하에서 선충의 치사 여부를 조사하였다. 실험은 5 반복으로 수행하였다.
5 ml를 처리하였다. 처리 후 상온에서 48시간 방치 후 해부현미경(SMZ800, Nikon)으로 선충의 치사 여부를 조사하였다. 선충의 치사 여부는 핀으로 자극하였을 때 반응이 없는 것은 죽은 것으로 간주하였으며, 본 실험은 4회 반복 실시하였다.
5 ml를 처리하였다. 처리 후 상온에서 48시간 방치 후 해부현미경으로 선충의 치사 여부를 조사하였으며, 2, 3차 실험 모두 4회 반복 실험하였다.
형태적 동정을 위하여 YM agar (YM broth 21 g + agar powder 15 g + 증류수 1 l)에 24℃ 배양기(HB-303DH-0, Hanbaek Scientific Co.)에서 1주일간 배양한 YD116 균주를 전처리 한 후 전계방출형주사전자현미경(FE-SEM, XL30S FEG, Philips)으로 사진을 촬영하였다.
대상 데이터
고체 배지에서 배양하던 방선균의 균총을 yeast mold broth (YM broth 21 g/l) 200 ml가 들어있는 삼각플라스크에 접종한 후 진탕배양기(23℃, 130 rpm)에서 약 10일간 진탕 배양 후 멸균한 filter paper (150 mm, Advantec No.2)를 이용하여 배양액을 여과하여 실험에 이용하였다. 배양 여액은 4℃ 냉장고에 보관하면서 사용하였다.
방선균 분리를 위한 토양 채집은 충북 영동, 충남 태안군 안면도, 경북 문경과 상주의 산림에서 채집하였다. 채집한 토양은 상온에서 24시간 건조 후 토양 10 g을 멸균 증류수 90 ml가 들어있는 삼각플라스크에 넣고, 30분 동안 20℃에서 진탕 배양 후 시료를 10−3까지 10배 단위로 단계적으로 멸균 증류수를 이용하여 희석한 후 희석액 50 µl를 취하여 방선균 분리용 배지(Actinomycete Isolation Agar, DifcoTM)에 분주하여 도말 후 20℃의 배양기(HB-303DH-0, Hanbaek Scientific Co.
배양 여액은 4℃ 냉장고에 보관하면서 사용하였다. 실험에 이용한 방선균의 균주는 총 32균주로서 Table 1과 같다.
실험에 이용한 소나무재선충은 경남 진주의 소나무재선충 감염목으로부터 깔때기법으로 분리해 직접 사용하거나 분리 후 소나무재선충의 먹이인 잿빛곰팡이병균(Botrytis cineria)을 이용하여 실내에서 배양 후 깔때기법으로 분리하여 사용하였다(Kishi, 1995; Lee et al., 2006).
데이터처리
결과는 평균±표준편차로 표기하였다.
8% agarose gel electrophoresis를 수행한 후 분리 정제하여 ABI PRISM 3700 DNA Analyzer를 이용하여 염기서열을 분석하였다. 분석된 염기서열은 BLASTN 프로그램을 이용하여 GENEBANK의 RDP (RNA database project)를 활용하여 분석하였다.
실험 결과는 Tukey's HSD test로 처리평균간 차이를 분산 분석하였다(Analytic software, 2003).
성능/효과
2배액에서 효과가 높았던 15개 방선균 균주를 이용하여 4배액에서 소나무재선충에 대한 살선충 활성을 검정한 결과, SG16 균주의 보정사충률이 81.3%로 가장 높았으며 YD419 균주를 비롯한 10개 균주가 70% 이상의 보정사충률을 보였다(Table 3; df=15, 48, F=61.1, P<0.0001).
AM210, SG16, YD116, YD315 균주에서 소나무재선충의 증식률이 10% 미만으로 다른 처리에 비하여 증식억제 효과가 높았다(df=32, 66, F=16.8, P<0.0001).
16S rDNA sequences of Actinomycetes YD116 isolate. This isolate was identified as Streptomyces atratus based on the 100% similarity to the species.
(2011)에 의해 세포독성을 가지는 hydrazidomycin A와 B, C가 확인된 바 있다. 그러나 이 균의 살선충 활성에 대한 연구는 전혀 수행된 바 없어 본 연구에서는 이 균이 생산하는 물질 중 hydrazidomycin과 유사하면서 구입이 용이한 유사물질인 hydrazine hydrate를 이용하였는데 1,000 ppm에서는 살선충과 선충증식 억제효과가 높았으나 1 ppm 농도에서는 살선충 활성이 현저히 감소하였다.
6%인 21개 균주였다. 또한, 10개 균주에서 통계적으로 유의한 증식억제 효과를 보였다. 살선충 효과가 높으면서 증식억제 효과가 있는 4개의 방선균 균주(AM210 균주와 SG16, YD315, YD116 균주)는 무처리 대비 상대적 소나무재선충 증식률이 10% 이하로 매우 낮았다.
방선균 배양 여액 중 소나무재선충의 증식 억제 효과가 높았던 YD116을 동정한 결과 S. atratus YD116으로 동정되었는데 S. atratus에서는 다양한 물질들이 확인되어 있다. 이들 중 세포독성을 가지는 것으로 알려진 hydrazidomycin과 유사한 hydrazine hydrate를 이용하여 농도별로 소나무재선충의 살선충 활성을 검정한 결과 Table 6과 같이 농도별로 차이를 보였는데 100 ppm 이상에서 87.
방선균 배양액 10배액에 대한 소나무재선충 살선충율은 전체적으로 20~50%대로 낮았는데 MS415 균주와 SG16 균주의 보정사충률이 가장 높았다(Table 3; df=15, 48, F=12.4, P<0.0001)
배양 여액 2배 희석액에서는 모든 소나무재선충이 치사되었으나 10배 액에서는 38.8%의 보정사충률을 보였고, 20배액 이상에서는 치사율이 급격히 낮아졌다(df=5, 24, F=137, P<0.0001).
(2010)에 의하여 보고된 바 있다. 본 연구에서도 3개도 4개시의 다섯 지역 산림토양으로부터 방선균을 분리하여 소나무재선충에 대한 살선충 활성과 증식 억제력을 검정하였는데 2배 농도의 배양 여액에서 소나무재선충을 100% 치사시키는 5개의 균주를 확인할 수 있었으며 90% 이상의 방제가를 보이는 균주는 전체 실험 균주의 65.6%인 21개 균주였다. 또한, 10개 균주에서 통계적으로 유의한 증식억제 효과를 보였다.
또한, 10개 균주에서 통계적으로 유의한 증식억제 효과를 보였다. 살선충 효과가 높으면서 증식억제 효과가 있는 4개의 방선균 균주(AM210 균주와 SG16, YD315, YD116 균주)는 무처리 대비 상대적 소나무재선충 증식률이 10% 이하로 매우 낮았다. 이 균주 중 YD116 균주를 동정한 결과 S.
상주 갑장산 지역에서 분리한 SG4, SG7, SG8, SG16, SG17 균주의 보정사충률이 100%를 나타내었으며 전체적으로 보정사충률이 90% 이상인 처리구는 모두 21개였다(df=33, 102, F=82.1, P<0.0001).
소나무재선충의 증식에 미치는 영향에서 효과가 있었던 방선균 YD116 균주를 동정한 결과, Streptomyces atratus strain NRRL B-16927로 동정 되었다. S atratus에서는 glucose isomerase (Tashpulatova, 1990), hydrazidomycin (Ueberschaar, 2011)과 malate dehydrogenase (Rommel et al.
살선충 효과가 높으면서 증식억제 효과가 있는 4개의 방선균 균주(AM210 균주와 SG16, YD315, YD116 균주)는 무처리 대비 상대적 소나무재선충 증식률이 10% 이하로 매우 낮았다. 이 균주 중 YD116 균주를 동정한 결과 S. atratus YD116으로 확인되었다. 이 균주는 배양 여액 2배액에서는 소나무재선충에 대한 살선충 활성이 100%를 보였으며 증식억제도 100%를 보였으나 10배액에서는 활성이 떨어졌다.
atratus YD116으로 확인되었다. 이 균주는 배양 여액 2배액에서는 소나무재선충에 대한 살선충 활성이 100%를 보였으며 증식억제도 100%를 보였으나 10배액에서는 활성이 떨어졌다.
증식 억제 효과가 뛰어난 YD116 균주를 16S rDNA의 염기서열을 분석하여 BLASTN 프로그램을 이용하여 GENEBANK와 RDP (RNA database project)의 ribosomal RNA sequencing과 비교한 결과, Streptomyces atratus strain NRRL B-16927과 100%의 상동성을 보였으며 S. sanglieri strain NBRC 100784와는 99%의 상동성을 보였다(Fig. 1). 이에 따라 선발된 균주는 S.
후속연구
본 연구에서는 소나무재선충에 살선충 활성이 있는 새로운 방선균 균주들의 탐색과 이들 중 일부 균주의 활용 가능성을 확인할 수 있었는데 소나무 수체 내에서 이동과 소나무재선충에 대한 활성 여부 및 살선충 활성 물질들에 대한 연구들은 추가로 수행되어야 할 것으로 생각된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
소나무재선충을 방제 대상으로 하는 방법의 단점은?
소나무재선충을 대상으로 하는 방제는 매개충을 대상으로 하는 방제에 비하여 방제 효과가 높고, 사전예방 효과를 거둘 수 있으나 노동력의 집약적 투입이 필요하고, 비용이 많이 들며 산림 내에서 작업의 어려운 점 등이 있어 대규모 산림에 적용하기는 어려운 단점이 있다(Kamata, 2008; Lee et al., 2008b). 특히 대부분의 수간주입용 소나무재선충 방제약제들이 상대적으로 고가여서 방제비용 증가의 주요인이 되고 있다. 또한, 수체 내 주입된 이들 살선충제들이 산림생태계나 인축에 미치는 악영향에 대해 구체적으로 밝혀진 바는 없지만, 솔잎을 식용으로 사용하였을 때 나타날 수 있는 상황이나 송편을 찔 때와 같이 간접적인 식용목적으로 사용하는 것과 같은 상황에 대한 잠재적 위험성을 내포하고 있다. 따라서 이러한 단점을 보완하기 위하여 최근에는 화학 농약을 대체하는 소나무재선충 살선충 물질에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있는데 살선충 활성 물질을 생산하는 미생물 이용도 주요한 방법의 하나이다(Park et al.
무엇을 방제하느냐에 따라 소나무재선충의 방제 방법이 구분됩니까?
소나무재선충의 방제 방법으로는 소나무재선충 자체를 방제 대상으로 하는 방법과 매개충인 하늘소류를 방제하는 방법이 있다. 소나무재선충을 방제 대상으로 하는 방법으로는 아바멕틴이나 에마멕틴벤조에이트와 같은 살선충제의 나무 주사나 포스티아제이트와 같은 지면 살포 등의 방법이 있고, 매개충을 대상으로 하는 방제는 항공약제 살포, 지상약제 살포, 피해목 내 유충을 제거하기 위한 벌채 및 훈증, 파쇄, 소각 등의 방법이 있다(Kishi, 1995; Moon et al.
소나무재선충병이란?
, 1989; Mota and Vieira, 2008). 그로 인해 소나무재선충병은 국내외적으로 소나무에 심각한 피해를 일으키고 있는 국제검역대상 제 1호로 분류되어있는 식물 병으로, 우리나라에서는 1988년 부산 동래구 금정산에서 최초로 발생한 이래 1997년 이후 급격하게 확산되어 피해가 확산되고 있는데 현재까지 알려진 주요 피해 수종은 소나무(Pinus densiflora), 곰솔(P. thunbergii), 잣나무(P.
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