선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- Pinene은 소나무의 송진에 다량 함유되어 있는 성분으로 자연계에서는 α-pinene과 β-pinene의 이성질체로 존재하며 두송(Juniperis communis) 열매와 로즈마리(Rosmarinus officinalis) 정유에 많이 함유되어 있는 성분이다(Jäger, 2000). 본 연구에서는 솔껍질깍지벌레에 대한 살충 활성이 우수한 사군자의 메탄올 추출물을 이용하여 다양한 깍지벌레류에 대한 살충 활성 검정과 용매분획과 chromatography로 분리, 정제하여 활성 화합물을 얻어 활용 가능성을 검토하였는데 사군자 추출물은 깍지벌레류의 대체 방제제로 활용할 수 있을 것으로 생각된다. 앞으로는 이러한 살충 활성을 증대시킬 수 있는 방안 및 향후 야외 실험을 통하여 살충효과를 재확인하고 활성 화합물이 빠르게 분해되어 살충효과가 감소할 수 있으므로 보조제를 사용하는 등 다양한 방법에 대해 추가적인 연구가 진행되어야 하겠다.
- 식물체 유래 활성물질 연구들 중 사군자(Quisquali indica)는 솔껍질깍지벌레에 대한 살충 효과가 우수한 한약재로 선발된 바 있는데(Song et al., 2013), 본 연구는 후속연구로써 사군자로부터 깍지벌레류[귤가루깍지벌레(Planococcus citri)와 주머니깍지벌레(Eriococcus lagerstroemiae), 거북밀깍지벌레(Ceroplastes japonicus), 소나무가루깍지벌레(Crisicoccus pini)]에 대한 활성물질을 탐색하기 위하여 수행하였다.
제안 방법
- Hexane 분획을 silica gel chromatography로 분리 정제하여 각 소분획물을 대상으로 깍지벌레에 대한 살충활성을 검정하였다. 1 mg 당 1 ml의 메탄올을 첨가하여 glass vial에 1,000 ppm의 검정시료를 만들고, vortex mixer로 균질화하여 생물검정에 이용하였다. 생물검정은 피라칸타의 귤가루깍지벌레 부화약충을 대상으로 하였는데 처리는 전술한 살충활성 검정과 동일한 방법으로 수행하였다.
- Hexane 분획을 silica gel chromatography로 분리 정제하여 각 소분획물을 대상으로 깍지벌레에 대한 살충활성을 검정하였다. 1 mg 당 1 ml의 메탄올을 첨가하여 glass vial에 1,000 ppm의 검정시료를 만들고, vortex mixer로 균질화하여 생물검정에 이용하였다.
- nhexane-chloroform (CHCl3)의 용매계로 순차용출(step-wise)시켜 얻은 1,024개의 활성분획을 silica gel TLC (Thin Layer Chromatography) plate에 hexane-EtOAc (8 : 2, v/v)를 전개용매로 전개하였다. UV spectrum을 통해 TLC plate상에서 색제로 H2SO4을 분무하여 태웠을 때 발색 spot 발생유무를 조사하였다. 이에 따라 총 10개의 그룹으로 활성분획으로 나누어 500 라운드 플라스크에 옮기고 회전감압 농축기로 농축 건조시켰다.
- 활성이 우수한 사군자 핵산 분획물의 활성물질을 탐색하기 위해 실리카겔(Merck 7734, 200 g)을 glass column(3 cm × 98 cm)에 충진 시킨 후 n-hexane 분획을 n-hexane에 용해시켜서 column chromatograph에 loading하였다. nhexane-chloroform (CHCl3)의 용매계로 순차용출(step-wise)시켜 얻은 1,024개의 활성분획을 silica gel TLC (Thin Layer Chromatography) plate에 hexane-EtOAc (8 : 2, v/v)를 전개용매로 전개하였다. UV spectrum을 통해 TLC plate상에서 색제로 H2SO4을 분무하여 태웠을 때 발색 spot 발생유무를 조사하였다.
- 각 시기에 채집 된 깍지벌레류는 피해가 심한 가지를 전정가위로 잘라 지퍼팩에 넣은 다음 실험실로 가져와 살충활성 검정에 이용하였다.
- 반송의 소나무가루깍지벌레는 1령 부화약충과 2령 부화약충을 대상으로 15마리씩을 접종하였으며 회양목의 거북밀깍지벌레는 부화약충의 밀도가 높은 가지를 선정하여 처리하였다. 각각의 깍지벌레에 대하여 500 ml 가정원예용 분무기를 이용하여 사군자 추출물 분획별로 각각 100 ppm 농도로 처리하였다. 분무는 2회 처리 하였으며, 페트리디쉬 뚜껑은 통풍 가능한 것을 사용하였다.
- 건조한 메탄올 추출물(402.8 g)을 증류수(1000 ml)로 현탁시켜 단계적으로 용매의 극성을 높여가면서 용매 분획하였다. 현탁액을 분리깔때기(separation funnel)에 옮기고 1,000 ml n-hexane을 가하여 충분히 혼합하고 정치시킨 후, 상등액의 n-hexane층을 분리하였고, 이 같은 분획을 2회 더 실시하였다.
- 곤충사육용기(Ø90 × 40 mm)에 90 mm 여지(Advantec No 2, Japan) 2장씩을 깔고 검정 시료 1 ml을 처리하였는데 무처리는 살균수에 EtOH 100 ppm을 혼합한 처리를 하였다.
- 무처리는 살균수만 처리하였으며 용매에 의한 영향을 알아보기 위하여 살균수에 메탄올 100 ppm을 혼합하여 처리 하였다. 대조약제로는 methidathion 40% EC를 처리하였다. 처리 후 실험실에 4시간 동안 둔 뒤 생장상(25℃, D : L = 12 : 12, 60% 습도; JEIO TECK, GC-1000, Korea)에 보관하였다.
- 생사유무는 붓으로 각 개체에 자극을 주어 반응이 없는 것은 죽은 것으로 간주하였는데, 거북밀깍지벌레는 핀으로 찔러 체액이 나오는 것은 살아있는 것으로 판정하였으며 딱딱하게 굳거나 체액이 나오지 않는 것은 죽은 것으로 판정하였다. 모든 처리는 4반복으로 수행하였다.
- 분무는 2회 처리 하였으며, 페트리디쉬 뚜껑은 통풍 가능한 것을 사용하였다. 무처리는 살균수만 처리하였으며 용매에 의한 영향을 알아보기 위하여 살균수에 메탄올 100 ppm을 혼합하여 처리 하였다. 대조약제로는 methidathion 40% EC를 처리하였다.
- 야외에서 채집한 피라칸타의 귤가루깍지벌레와 배롱나무의 주머니깍지벌레는 곤충사육용기(Ø90 × 40 mm)에 여지(90 mm, Advantec filter paper No 2, Japan) 2장을 깔고, 증류수 2 ml를 처리한 후 미세한 붓으로 부화약충 15마리씩을 접종하였다. 반송의 소나무가루깍지벌레는 1령 부화약충과 2령 부화약충을 대상으로 15마리씩을 접종하였으며 회양목의 거북밀깍지벌레는 부화약충의 밀도가 높은 가지를 선정하여 처리하였다. 각각의 깍지벌레에 대하여 500 ml 가정원예용 분무기를 이용하여 사군자 추출물 분획별로 각각 100 ppm 농도로 처리하였다.
- 살충활성이 가장 높은 hexane층을 대상으로 농도별 효과를 검토 한 결과 100 ppm처리가 200 ppm보다 치사율이 다소 높았으나 전체적으로 25-200 ppm 처리 농도 간에 통계적 차이가 없어 100 ppm이하의 처리로도 방제효과를 기대할 수 있을 것으로 추정되었다. 본 연구에서는 살충활성 물질의 탐색에 주안점을 두고 연구를 수행하여 25 ppm이하의 농도단계에서 추가적인 실험을 수행하지 않고, hexane층의 소분획별 살충효과를 추가로 검정하였다.
- 각각의 깍지벌레에 대하여 500 ml 가정원예용 분무기를 이용하여 사군자 추출물 분획별로 각각 100 ppm 농도로 처리하였다. 분무는 2회 처리 하였으며, 페트리디쉬 뚜껑은 통풍 가능한 것을 사용하였다. 무처리는 살균수만 처리하였으며 용매에 의한 영향을 알아보기 위하여 살균수에 메탄올 100 ppm을 혼합하여 처리 하였다.
- 사군자 메탄올추출물의 모든 hexane 소분획에서 확인 된 α-pinene의 살충활성 검정을 위해 주머니깍지벌레를 대상으로 농도별로 실험을 수행하였다.
- 1 mg 당 1 ml의 메탄올을 첨가하여 glass vial에 1,000 ppm의 검정시료를 만들고, vortex mixer로 균질화하여 생물검정에 이용하였다. 생물검정은 피라칸타의 귤가루깍지벌레 부화약충을 대상으로 하였는데 처리는 전술한 살충활성 검정과 동일한 방법으로 수행하였다.
- 솔껍질깍지벌레에 대한 실내와 야외실험에서 살충효과가 높았던 사군자를 이용하여 활성물질을 탐색하기 위한 실험들을 수행하였는데 1차적으로 메탄올 추출물을 용매별로 분획하여 배롱나무의 주머니깍지벌레를 대상으로 처리한 결과는 Table 1과 같았다(df = 7, 24, F = 35.8, P < 0.0001).
- 야외에서 채집한 피라칸타의 귤가루깍지벌레와 배롱나무의 주머니깍지벌레는 곤충사육용기(Ø90 × 40 mm)에 여지(90 mm, Advantec filter paper No 2, Japan) 2장을 깔고, 증류수 2 ml를 처리한 후 미세한 붓으로 부화약충 15마리씩을 접종하였다.
- 이 화합물을 구명하기 위하여 표준품 α-pinene을 비교분석한 결과 동일한 시간대에 나타난 peak가 동일한 패턴의 mass spectrum을 나타내 이 화합물이 α-pinene으로 구명하였다(Fig. 2).
- UV spectrum을 통해 TLC plate상에서 색제로 H2SO4을 분무하여 태웠을 때 발색 spot 발생유무를 조사하였다. 이에 따라 총 10개의 그룹으로 활성분획으로 나누어 500 라운드 플라스크에 옮기고 회전감압 농축기로 농축 건조시켰다. Hexane층(fr.
- n-hexane 분획을 회전감압 농축기로 농축 건조시켰다. 이와 같은 방법으로 chloroform (CHCl3, 1000 ml), ethyl acetate (EtOAc, 1000 ml), n-butanol (BuOH, 1000 ml)로 각각 3회씩 순차적으로 분획한 다음, 각각의 분획물을 1000 ml 라운드 플라스크에 받아 회전감압 농축기(Rotary vacuum evaporator N-1000, Japan)로 농축 건조시켰다. Hexane분획에서는 91.
- 야외에서 채집한 피라칸타의 귤가루깍지벌레와 배롱나무의 주머니깍지벌레는 곤충사육용기(Ø90 × 40 mm)에 여지(90 mm, Advantec filter paper No 2, Japan) 2장을 깔고, 증류수 2 ml를 처리한 후 미세한 붓으로 부화약충 15마리씩을 접종하였다. 반송의 소나무가루깍지벌레는 1령 부화약충과 2령 부화약충을 대상으로 15마리씩을 접종하였으며 회양목의 거북밀깍지벌레는 부화약충의 밀도가 높은 가지를 선정하여 처리하였다.
- 처리 후 미세한 붓으로 부화약충 15마리씩을 접종하였다. 처리 후 실험실에 4시간 동안 둔 뒤 생장상(25℃, D : L = 12 : 12, 60% 습도; JEIO TECK, GC-1000, Korea)에 보관하였는데 처리 24, 48, 72시간 후에 주머니깍지벌레 부화약충의 치사유무를 해부현미경하에서 조사하였다. 한 개의 용기를 한 반복으로 4반복 수행하였다.
- 측정 시 시료는 HPLC용 hexane에 희석하여 auto sampler를 사용하여 sample당 1 μl씩 주입하였다.
- 처리 후 실험실에 4시간 동안 둔 뒤 생장상(25℃, D : L = 12 : 12, 60% 습도; JEIO TECK, GC-1000, Korea)에 보관하였는데 처리 24, 48, 72시간 후에 주머니깍지벌레 부화약충의 치사유무를 해부현미경하에서 조사하였다. 한 개의 용기를 한 반복으로 4반복 수행하였다.
- 활성이 우수한 사군자 핵산 분획물의 활성물질을 탐색하기 위해 실리카겔(Merck 7734, 200 g)을 glass column(3 cm × 98 cm)에 충진 시킨 후 n-hexane 분획을 n-hexane에 용해시켜서 column chromatograph에 loading하였다.
- 처리 후 실험실에 4시간 동안 둔 뒤 생장상(25℃, D : L = 12 : 12, 60% 습도; JEIO TECK, GC-1000, Korea)에 보관하였다. 회양목의 거북밀깍지벌레는 처리 7일 후에 치사유무를 조사하였으며 귤가루깍지벌레, 주머니깍지벌레, 소나무가루깍지벌레는 처리 72시간 후 치사유무를 해부현미경상에서 확인하였다. 생사유무는 붓으로 각 개체에 자극을 주어 반응이 없는 것은 죽은 것으로 간주하였는데, 거북밀깍지벌레는 핀으로 찔러 체액이 나오는 것은 살아있는 것으로 판정하였으며 딱딱하게 굳거나 체액이 나오지 않는 것은 죽은 것으로 판정하였다.
대상 데이터
- Column은 Agilent HP-5MS capillary (30 m × 250um × 0.25 um)를 사용하였으며 Library는 Wiley DB (W9NO8. L)를 사용하였다.
- 거북밀깍지벌레는 경남 진주의 경상대학교 교내 회양목(Buxus microphylla var. insularis Nakai)에서 7월에 1령충을 채집하여 실험에 사용하였다.
- 검정 시료는 98% α-pinene(Sigma-Aldrich, USA)을 EtOH에 희석하여 100 ppm을 만든 후 증류수에 희석하여 10 ppm, 5 ppm, 1 ppm, 0.5 ppm, 0.1 ppm을 제조하여 생물검정에 이용하였다.
- 귤가루깍지벌레는 경상남도 남해군 이동면의 피라칸타[Pyracantha angustifoila (Franch.)] 재배 하우스에서 8월에 채집하여 실험에 사용하였는데 부화 직 후의 1령 약충을 이용하였다.
- (2013)의 방법으로 MeOH 추출을 하였다. 부산광역시 동구 수정동의 운곡한약재상에서 사군자 열매를 구입하여 음건 건조시킨 뒤, 고성능 분쇄기를 사용하여 고운 분말이 될 때까지 분쇄하였다. 3.
- 소나무가루깍지벌레는 경남 진주의 경상대학교 교내 반송(Pinus densiflora Siebold & Zuccarini)에서 8월에 1-2령충을 채집하여 실험에 사용하였다.
- 실험에 이용한 깍지벌레류는 야외의 기주식물에 피해를 주고 있는 개체군을 채집하여 사용하였는데 귤가루깍지벌레와 주머니깍지벌레, 거북밀깍지벌레, 소나무가루깍지벌레를 사용하였다.
- 주머니깍지벌레는 경상남도 진주의 경상대학교 캠퍼스 주변 배롱나무(Lagerstroemia indica)에 서식하는 1령충을 7월에 채집하여 이용하였다.
데이터처리
- 각각의 실험결과들 중 백분율 자료는 arcsine % 변환하여 Tukey’s HSD test로 처리평균간 차이를 분산 분석하였다(Analytic software, 2003).
- 결과는 변환전의 값으로 표현하였으며 평균 ±표준오차로 표기하였다.
- 보정 사충율은 [(처리구의 치사율 −무처리구의 치사율) / (100 −무처리구의 치사율)] × 100으로 산정하였다. 반수치사농도(LC50)는 SAS program (PROC PROBIT)을 이용하여 probit분석하였다(SAS Institute, 1999).
이론/모형
- Hexane층의 성분을 분석하기 위하여 Agilent 7890A Gas chromatography-Mass spectrometry (GC-MS)를 사용하였다. Column은 Agilent HP-5MS capillary (30 m × 250um × 0.
- 솔껍질깍지벌레를 대상으로 한 한약재 추출물 실험에서 살충활성이 가장 높게 나타난 사군자(Song et al., 2013)를 선정하여 Song et al. (2013)의 방법으로 MeOH 추출을 하였다. 부산광역시 동구 수정동의 운곡한약재상에서 사군자 열매를 구입하여 음건 건조시킨 뒤, 고성능 분쇄기를 사용하여 고운 분말이 될 때까지 분쇄하였다.
성능/효과
- Hexane fraction을 silica gel chromatography로 1차 정제하여 각각의 소분획(HS-1~10)들을 피라칸타의 귤가루깍지벌레를 대상으로 생물검정을 수행 한 결과(Fig. 1), 10개의 소분획에서 모두 활성이 높았으며 소분획간에 통계적 유의성은 없었다(df = 10, 33, F = 8.92, P < 0.0001).
- Hexane층의 소분획별 살충효과 검정에서는 10개 층 모두에서 살충활성이 나타났는데 이들 분획 내에서 다양한 물질들이 확인 되었는데 공통적으로 함유되어 있는 물질의 하나인 pinene을 이용하여 살충활성을 검정한바 LC90값이 7.26ppm으로 높은 활성을 보였다. 그러나 이들 분획 내에는 다른 물질들도 포함되어 있기 때문에 살충활성이 높은 유효성분 분석에 대한 추가적인 연구들은 지속되어야 할 것으로 생각된다.
- 본 실험은 깍지벌레를 실내에서 사육하면서 지속적으로 이용할 수 있는 공시충 확보가 어려웠기 때문에 실험의 진행에 따라 야외에서 자연 발생하는 깍지벌레를 대상으로 실험을 수행하여 무처리구의 치사율을 낮은 수준으로 유지하기가 어려웠다. 그러나 전체적인 결과들은 통계적인 유의성이 인정되어 깍지벌레류에 대한 효과를 확인할 수 있었다.
- 깍지벌레에 살충활성을 나타낸 hexane 분획을 silica gel column chromatography로 분리하여 각 분획들로부터 살충활성물질로 추정되는 화합물을 탐색하기 위하여 기기분석으로 검색한 결과, 10개의 모든 소분획(HS-1~10)에서 공통적으로 Rt 3.61 min peak에서 α-pinene으로 추정되는 화합물이 검출되었다.
- 5). 다른 peak들의 mass spectrum을 Wiley library와 비교한 결과 HS-3 분획에서 phthalic acid mono (2-ethylhexyl)ester (Fig. 6)와 HS-4 분획에서 Palmitic acid (Fig. 7)로 추정되는 화합물이 각각 검출되었다.
- 따라서 Hexane fraction을 silica gel chromatography로 1차 정제하여 각각의 소분획들을 생물검정한 결과 모든 소분획들에서 살충활성을 나타내었으며 이들로부터 살충활성 물질로 추정되는 물질을 탐색한 결과 모든 소분획에서 검출된 essential oil 성분인 α-pinene이 주요 살충활성 물질로 추정되었으며 HS-2 분획에서 나타난 eugenol도 주요 살충활성물질도 추정되었다.
- 2). 또한 HS-2 분획을 분석한 결과 Rt 9.56 min에서 eugenol로 추정되는 화합물이 검출되어 표준품 eugenol과 비교분석한 결과 동일한 시간대에서 동일한 패턴의 mass spectrum을 나타내 이 화합물을 eugenol로 구명하였다(Fig. 3). 그 외에도 HS-1 분획에서 지방산으로 추정되는 methyl palmitate으로 추정되는 물질이 검출되어 표준품과 비교분석하여 이 화합물이 methyl palmitate로 구명하였으며(Fig.
- 0001). 메탄올 추출물의 용매 분획에 따라 57.4-94.9%의 상이한 보정사충율을 나타내었는데 hexane층의 활성이 가장 높았다.
- 모든 처리에서 무처리에 비하여 통계적 유의성이 있었으나 25 ppm에서 2000 ppm 사이 농도 간에는 통계적 차이가 없었다(df = 4, 15, F = 28.5, P < 0.0001).
- 반송의 소나무가루깍지벌레에 대한 사군자 메탄올 추출물의 분획별 효과는 hexane층과 CHCl3에서 살충활성이 가장 높게 나타났으며 2령충(df = 7, 24, F = 14.0, P < 0.0001)에 비하여 1령충(df = 7, 24, F = 29.6, P < 0.0001)에서 효과가 더 높게 나타났다(Table 1).
- 살충활성이 가장 높은 hexane층을 대상으로 농도별 효과를 검토 한 결과 100 ppm처리가 200 ppm보다 치사율이 다소 높았으나 전체적으로 25-200 ppm 처리 농도 간에 통계적 차이가 없어 100 ppm이하의 처리로도 방제효과를 기대할 수 있을 것으로 추정되었다. 본 연구에서는 살충활성 물질의 탐색에 주안점을 두고 연구를 수행하여 25 ppm이하의 농도단계에서 추가적인 실험을 수행하지 않고, hexane층의 소분획별 살충효과를 추가로 검정하였다.
- 솔껍질깍지벌레에 대한 실험결과를 토대로 가장 살충활성이 높은 사군자를 선정하여 메탄올 추출한 것으로 4가지 깍지벌레류 부화약충을 대상으로 살충 활성을 확인한 결과, 깍지벌레류의 종류에 따라 살충력의 차이는 있었지만 hexane 층의 활성이 가장 높았다. 주머니깍지벌레와 귤가루깍지벌레, 소나무가루깍지벌레 1령충에 대해서는 각각 94.
- 피라칸타의 귤가루깍지벌레에 처리한 결과 모든 분획층의 효과가 무처리에 비하여 높게 나타났으며 특히 hexane층의 살충효과가 78.7%의 보정사충율을 보여 상대적으로 높게 나타났다(Table 1. df = 7, 24, F = 40.5, P < 0.0001).
후속연구
- 26ppm으로 높은 활성을 보였다. 그러나 이들 분획 내에는 다른 물질들도 포함되어 있기 때문에 살충활성이 높은 유효성분 분석에 대한 추가적인 연구들은 지속되어야 할 것으로 생각된다.
- 앞으로는 이러한 살충 활성을 증대시킬 수 있는 방안 및 향후 야외 실험을 통하여 살충효과를 재확인하고 활성 화합물이 빠르게 분해되어 살충효과가 감소할 수 있으므로 보조제를 사용하는 등 다양한 방법에 대해 추가적인 연구가 진행되어야 하겠다. 또한 본 연구에서는 사군자 메탄올 추출물의 헥산분획에서 공통적으로 확인 된 pinene만을 대상으로 깍지벌레에 대한 활성검정을 수행하였는데 추후 다른 물질에 대해서도 활성 검정이 이루어져야 할 것으로 생각된다.
- 본 연구에서는 솔껍질깍지벌레에 대한 살충 활성이 우수한 사군자의 메탄올 추출물을 이용하여 다양한 깍지벌레류에 대한 살충 활성 검정과 용매분획과 chromatography로 분리, 정제하여 활성 화합물을 얻어 활용 가능성을 검토하였는데 사군자 추출물은 깍지벌레류의 대체 방제제로 활용할 수 있을 것으로 생각된다. 앞으로는 이러한 살충 활성을 증대시킬 수 있는 방안 및 향후 야외 실험을 통하여 살충효과를 재확인하고 활성 화합물이 빠르게 분해되어 살충효과가 감소할 수 있으므로 보조제를 사용하는 등 다양한 방법에 대해 추가적인 연구가 진행되어야 하겠다. 또한 본 연구에서는 사군자 메탄올 추출물의 헥산분획에서 공통적으로 확인 된 pinene만을 대상으로 깍지벌레에 대한 활성검정을 수행하였는데 추후 다른 물질에 대해서도 활성 검정이 이루어져야 할 것으로 생각된다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.