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문제 정의
- avenae subsp. citrulli에 대해 항균활성을 갖는 친환경 유기농자재를 개발할 목적으로 오배자(S. chinensis)를 대상으로 수행되었다. 오배자를 MeOH로 추출하여 용매분획을 하였고, 용매분획 중에서 가장 강한 활성을 나타낸 hexane fraction을 column chromatography로 분리하여 활성이 강한 분획들을 GC-MS로 분석하였다.
- avenae subsp. citrulli에 항균활성을 갖는 친환경농자재를 개발할 목적으로 오배자로부터 항균활성을 탐색하였다. 오배자(Schlechtendalia chinensis)는 진딧물과(Aphidae)에 속하는 곤충에 의해 붉나무와 같은 옻나무과(Anacardiaceae)에 형성된 충영으로, 우리나라의 경우 붉나무(Rhus javanica L.
- 본 연구는 오배자에 함유된 활성물질을 구명하여 추후 친환경 농자재 개발에 이용하고자 본 연구를 수행하였다.
제안 방법
- 배양액 9,900 ㎕를 test tube에 넣은 후 10,000 ppm 시료 100 ㎕를 test tube에 첨가하여 생물검정 농도를 100 ppm으로 조정하였다. 30℃에서 24시간 shaking 배양하여 30분간 정치 후 600 nm UV/VIS Spectrophotometer에서 optical density(OD)값을 측정하였다.
- Oven의 온도는 80℃, 170℃, 310℃로 Rate 10 (℃/min), Hold time은 각각 2 min이다. GC-MS에서 얻어진 spectrum들은 Wiley library Data base와 비교하였고 이를 통해 silica gel column chromatography로 얻는 활성 subfraction에 함유된 물질들을 구명하였다.
- Hexane 분획을 silica gel chromatography로 분리 정제하여 얻은 6개의 subfractions을 대상으로 수박 과실썩음병원균에 대한 항균활성을 검정하였다. 각각의 subfraction 시료 1 ㎎ 당1 ㎖의 MeOH를 첨가하여 1,000 ppm의 검정시료를 만들었다.
- n-hexane-chloroform(CHCl3)의 용매계로 순차용출(step-wise)시켜 얻은 127개의 활성분획을 silica gel TLC plate에 얇은 유리관을 이용해 spotting하고 hexane-chloroform (8:2)를 전개용매로 전개하였다. UV spectrum을 통해 TLCplate 상에서 UV 흡수 또는 발색 spot이 생기거나, 염색제 H2SO4을 분무하여 태웠을 때 발색 spot 발생유무를 조사하였다. 이에 따라 총 6개의 그룹으로 활성분획으로 나누어 500 ㎖ 라운드 플라스크에 옮기고 회전감압 농축기로 농축 건조시켰다.
- 6 g)을 n-hexane에 용해시켜 columm chromatography에 loading 하였다. n-hexane-chloroform(CHCl3)의 용매계로 순차용출(step-wise)시켜 얻은 127개의 활성분획을 silica gel TLC plate에 얇은 유리관을 이용해 spotting하고 hexane-chloroform (8:2)를 전개용매로 전개하였다. UV spectrum을 통해 TLCplate 상에서 UV 흡수 또는 발색 spot이 생기거나, 염색제 H2SO4을 분무하여 태웠을 때 발색 spot 발생유무를 조사하였다.
- 각각의 peak가 어떤 물질인지 구명하고자 Wiley library와 각각의 MS spectra를 비교하는 방식으로 profiling하여 구조를 확인하였다.
- 따라서 활성이 가장 강하게 나타난 hexane fraction을 silica gel column chromatography로 분리 정제 하였다. 분획을 300 ㎖씩 받아서 127개의 분획을 얻은 후, 얻은 fractions를 TLC에 loading하여 TLC밴드 형태에 따라서 6개의 fraction으로 grouping 하여 subfractions를 각각 OBJ-H-S1, OBJ-H-S2, OBJ-H-S3, OBJ-H-S4, OBJ-H-S5, OBJ-H-S6라 하였다.
- citrulli 균주를 배양배지에 접종하고 incubator에 30℃에서 12시간 배양하여 배양액을 생물검정에 사용하였다. 배양액 9,900 ㎕를 test tube에 넣은 후 10,000 ppm 시료 100 ㎕를 test tube에 첨가하여 생물검정 농도를 100 ppm으로 조정하였다. 30℃에서 24시간 shaking 배양하여 30분간 정치 후 600 nm UV/VIS Spectrophotometer에서 optical density(OD)값을 측정하였다.
- 따라서 활성이 가장 강하게 나타난 hexane fraction을 silica gel column chromatography로 분리 정제 하였다. 분획을 300 ㎖씩 받아서 127개의 분획을 얻은 후, 얻은 fractions를 TLC에 loading하여 TLC밴드 형태에 따라서 6개의 fraction으로 grouping 하여 subfractions를 각각 OBJ-H-S1, OBJ-H-S2, OBJ-H-S3, OBJ-H-S4, OBJ-H-S5, OBJ-H-S6라 하였다.
- 수박 과실썩음병원균을 대상으로 모든 처리는 각각의 test tube에 12시간 30℃로 진탕배양 한 배양액 9,900 ㎕씩 넣고, 각각의 검정시료를 100 ㎕씩 접종하였다. 처리 후 30℃에서 24시간 shaking 배양한 다음 30분간 상온에서 정치 후 600 nm UV/VIS Spectrophotometer에서 optical density (OD)값을 측정하였으며, 한 개의 용기를 한 반복으로 5 반복으로 수행하였다.
- 수박 과실썩음병원균의 배양 배지는 Beef extract (1 g), Yeast extract (2 g), Peptone (5 g), Nacl (5 g), KH2PO4 (0.45 g), Na2HPO4 (2.39 g), D.W. (1 L), pH (6.8) 조건으로 조성하고 120℃로 15분간 가열하여 조제하였다.
- 여과지(Toyo Rosh Kaisha Ltd, 300 mm × 100 circles, No 2, Japan)를 사용하여 고형물을 걸러내고 MeOH 추출물을 40℃에서 rotary evaporator로 감압농축 건조시켰다.
- chinensis)를 대상으로 수행되었다. 오배자를 MeOH로 추출하여 용매분획을 하였고, 용매분획 중에서 가장 강한 활성을 나타낸 hexane fraction을 column chromatography로 분리하여 활성이 강한 분획들을 GC-MS로 분석하였다. GC chromatogram 상의 주요 peak에 해당하는 mass spectrum과 Wiley library를 비교하여 profiling한 결과, 지방산인 myristic acid, palmitic acid와 3-n-pentadecylphenol이 주요 물질로 검출되었다.
- 이들 검출된 화합물 myristic acid, palmitic acid, 3-n-pentadecylphenol의 항균활성을 검정하기 위하여 표준품 myristic acid, palmitic acid, 3-n-pentadecylphenol을 1,000 ppm으로 조제하여 동일한 방법으로 항균활성을 검정하였다. 생물검정 결과 myristic acid 화합물이 매우 강한 항균활성을 보였고 3-n-pentadecylphenol 화합물도 강한 활성을 보였으나 palmitic acid에서는 약한 활성을 보였다(Fig.
- UV spectrum을 통해 TLCplate 상에서 UV 흡수 또는 발색 spot이 생기거나, 염색제 H2SO4을 분무하여 태웠을 때 발색 spot 발생유무를 조사하였다. 이에 따라 총 6개의 그룹으로 활성분획으로 나누어 500 ㎖ 라운드 플라스크에 옮기고 회전감압 농축기로 농축 건조시켰다. hexane fraction으로부터 각각 OBJ-H-S1 (760 mg), OBJ-H-S2 (80 mg), OBJ-H-S3 (230 mg), OBJ-H-S4 (410 mg), OBJ-HS5 (240 mg), OBJ-H-S6 (4,270 mg) 6개의 subfraction을 얻었다.
- 수박 과실썩음병원균을 대상으로 모든 처리는 각각의 test tube에 12시간 30℃로 진탕배양 한 배양액 9,900 ㎕씩 넣고, 각각의 검정시료를 100 ㎕씩 접종하였다. 처리 후 30℃에서 24시간 shaking 배양한 다음 30분간 상온에서 정치 후 600 nm UV/VIS Spectrophotometer에서 optical density (OD)값을 측정하였으며, 한 개의 용기를 한 반복으로 5 반복으로 수행하였다.
- 활성이 우수한 hexane 분획물의 활성물질을 탐색하기 위하여 Silica gel (Merck 7734, 500g)을 glass column(50 mm × 860 mm)에 충전한 후 Hexane fraction (6.6 g)을 n-hexane에 용해시켜 columm chromatography에 loading 하였다.
대상 데이터
- 표준품 시약 myristic acid, palmitic acid은 Samchun 제품을, 3-n-pentadecylphenol은 Aldrich 제품을 사용하였다. Bioassay에 사용된 beef extract, yeast extract, peptone은 Bacto 제품, NaCl은 Samchun제품, KH2PO4, Na2HPO4 등은 Duksan 제품을 사용하였다. UV/VIS Spectrophotometer는 Shimadzu 회사의 UV mini 1240을, Gas chromatography-Mass spectrometry (GC-MS)는 Agilent의 7890A기종을 사용하였고 Column은 HP-5MS capillary를 사용하였으며 Detector는 Agilent5975C, Library는 Wiley (W9N08.
- Bioassay에 사용된 beef extract, yeast extract, peptone은 Bacto 제품, NaCl은 Samchun제품, KH2PO4, Na2HPO4 등은 Duksan 제품을 사용하였다. UV/VIS Spectrophotometer는 Shimadzu 회사의 UV mini 1240을, Gas chromatography-Mass spectrometry (GC-MS)는 Agilent의 7890A기종을 사용하였고 Column은 HP-5MS capillary를 사용하였으며 Detector는 Agilent5975C, Library는 Wiley (W9N08.L)를 사용하였다.
- avenae subsp. citrulli는 전북대학교 농생물과(Prof. 주호영)에서 분양받아 경북대학교 과학기술대학원 식물자원학전공 천연물화학 연구실에 보관하면서 배양하여 사용하였고, 식물재료인 오배자는 경동시장 약재상에서 구매하여 사용하였다.
- 용매분획과 silica gel column chromatography에 사용된 MeOH, hexane, CHCl3, EtOAc, 그리고 BuOH 등은 덕산약품공업(주)회사의 extra pure grade의 용매가 사용되었다. 표준품 시약 myristic acid, palmitic acid은 Samchun 제품을, 3-n-pentadecylphenol은 Aldrich 제품을 사용하였다.
- 용매분획과 silica gel column chromatography에 사용된 MeOH, hexane, CHCl3, EtOAc, 그리고 BuOH 등은 덕산약품공업(주)회사의 extra pure grade의 용매가 사용되었다. 표준품 시약 myristic acid, palmitic acid은 Samchun 제품을, 3-n-pentadecylphenol은 Aldrich 제품을 사용하였다. Bioassay에 사용된 beef extract, yeast extract, peptone은 Bacto 제품, NaCl은 Samchun제품, KH2PO4, Na2HPO4 등은 Duksan 제품을 사용하였다.
이론/모형
- Silica gel column chromatography 분획의 주요 성분을 분석하기 위하여 GC-MS를 사용하였다. Flow rate는 0.
성능/효과
- 6개의 subfraction의 수박 과실썩음병원균에 대한 항균활성을 조사한 결과, OBJ-H-S6에서 가장 높은 억제율을 보였고, OBJ-H-S2에서 그 다음으로 높은 억제율을 나타내었다(Fig. 2).
- 오배자를 MeOH로 추출하여 용매분획을 하였고, 용매분획 중에서 가장 강한 활성을 나타낸 hexane fraction을 column chromatography로 분리하여 활성이 강한 분획들을 GC-MS로 분석하였다. GC chromatogram 상의 주요 peak에 해당하는 mass spectrum과 Wiley library를 비교하여 profiling한 결과, 지방산인 myristic acid, palmitic acid와 3-n-pentadecylphenol이 주요 물질로 검출되었다. 이들 검출 화합물의 항균활성을 검정하기 위하여 표준품을 사용하여 bioassay한 결과, myristic acid와 3-n-pentadecylphenol 화합물이 강한 활성을 보였다.
- Subfraction OBJ-H-S2 subfraction의 GC Chromatogram에서 15.555min에 나타난 peak (A)의 mass spectrum을 Wiley library DB의 spectrum과 비교분석한 결과 myristic acid로 검출되었다 (Fig. 5).
- Subfraction OBJ-H-S6을 분석한 GC chromatogram에서 22.925 min에 나타난 peak (C)의 mass spectrum을 Wiley library DB의 spectrum과 비교분석한 결과 3-n-pentadecylphenol로 검출되었다(Fig. 7).
- 이들 검출된 화합물 myristic acid, palmitic acid, 3-n-pentadecylphenol의 항균활성을 검정하기 위하여 표준품 myristic acid, palmitic acid, 3-n-pentadecylphenol을 1,000 ppm으로 조제하여 동일한 방법으로 항균활성을 검정하였다. 생물검정 결과 myristic acid 화합물이 매우 강한 항균활성을 보였고 3-n-pentadecylphenol 화합물도 강한 활성을 보였으나 palmitic acid에서는 약한 활성을 보였다(Fig. 9). 따라서 본 연구에서 오배자로부터 분리한 myristic acid와 3-n-pentadecylphenol 화합물이 활성물질인 것으로 추정 되었으며, 항균력이 강한 오배자 추출물 또는 myristic acid와 3-n-pentadecylphenol 화합물을 주성분으로 하는 추출물을 수박 과실썩음병에 대한 친환경 방제용 자제로 개발이 가능할 것으로 판단되었다.
- 수박 과실썩음병원균에 대한 오배자의 MeOH 추출물 용매분획에 대한 항균활성을 감정한 결과, hexane fraction에서 가장 강한 항균활성을 보였으며 다음으로 CHCl3 fraction에서 강한 활성을 보였으나, EtOAc fraction, BuOH fraction, Aqueous fraction에서는 활성이 보이지 않았다(Fig. 1).
- GC chromatogram 상의 주요 peak에 해당하는 mass spectrum과 Wiley library를 비교하여 profiling한 결과, 지방산인 myristic acid, palmitic acid와 3-n-pentadecylphenol이 주요 물질로 검출되었다. 이들 검출 화합물의 항균활성을 검정하기 위하여 표준품을 사용하여 bioassay한 결과, myristic acid와 3-n-pentadecylphenol 화합물이 강한 활성을 보였다. 따라서 오배자로부터 분리한 myristic acid와 3-n-pentadecylphenol 화합물이 항균 활성물질인 것을 구명하였다.
후속연구
- 9). 따라서 본 연구에서 오배자로부터 분리한 myristic acid와 3-n-pentadecylphenol 화합물이 활성물질인 것으로 추정 되었으며, 항균력이 강한 오배자 추출물 또는 myristic acid와 3-n-pentadecylphenol 화합물을 주성분으로 하는 추출물을 수박 과실썩음병에 대한 친환경 방제용 자제로 개발이 가능할 것으로 판단되었다.
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