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문제 정의
- 본 연구는 약용식물인 해당화의 열매 분말을 이용하여 영양학적 관점으로 열매가 가지고 있는 식품의 일반성분 분석과 항산화 활성 및 고지방 식이로 유도된 쥐의 체내에서의 혈중 지질 수준의 변화와 혈청 insulin과 leptin 수준의 변화 등을 확인하여 식품가공 산업에서 천연항산화제 재료로 응용할 수 있는지 알아보고자 실시하였다.
- 이에 본 연구에서는 우리나라에서 오래 전부터 민간요법으로 사용되었던 약용식물인 해당화의 열매 추출 분말을 이용하여 열매가 가지고 있는 식품의 일반성분과 항산화 활성 및 고지방 식이로 유도된 흰쥐 체내에서의 혈중 지질 수준의 변화와 혈청 insulin과 leptin 수준의 변화 등을 확인하여 해당화 열매 분말의 가공식품산업의 재료로 이용할 수 있는지를 알아보고자 실시하였다.
제안 방법
- 실험하였다. ABTS 용액은 7 mM ABTS 저장용액과 2.45 mM potassium persulfatelKzSzOQ 을 포함하는 ABTS 용액 에 시료를 혼합하여 실온에서 6분간 반응시킨 후, 734 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료의 라디칼 소거능은 건조시료 g당 mM Trolox equivalents로 나타내 었다
- Louis, MO, USA) 를 이용하여 실험하였다. 각 시료 20 yL 에 증류수 1.58 mL 를 추가한 후 FC reagent(Sigma- Aldrich, St. Louis, MO, USA) 100 yL 를 vortex 로 혼합하여 5 분 후 20% sodium carbonate 용액 300 yL 를 첨가하여 2시간 동안 실온에서 반응시킨 후 765 nm 파장에서 spectrophotometer (Ultrospec 3, 100 pro, Amersham Bio., Cambridge, UK) 를 이용하여 흡광도를 측정하였다. 해당화 열매 추출 분말의 페놀 함량은 해당화 열매 분말 중 100 g 에 해당하는 galic acid 의 용량 (mg GAE/g dw) 으로 표시하였다.
- 하였다. 각종 비타민과 무기질을 각각 1%, 3%, 그리고 섬유질 1%를 첨가하였으며, 여기에 Choi 등(2013)의 연구 방법을 기준으로 하여 해당화 열매 분말을 각각 10%와 20% 비율로 첨가하여 배합하였다.
- 시료의 ABTS assay 방법은 Re 등(1999)의 방법을 변형하여 실험하였다. ABTS 용액은 7 mM ABTS 저장용액과 2.
- 시료의 총 페놀 함량의 측정은 Singleton & Rossi(1965) 의 방법을 일부 변경하여 Folin-Ciocalteau's(FC) reagent(Sigma- Aldrich, St. Louis, MO, USA) 를 이용하여 실험하였다. 각 시료 20 yL 에 증류수 1.
- 수컷을 성숙기 모델로 잡아 실험군당 7마리를 공시하였다. 시판 고형식이 (PicoLab® Rodent Diet) 로 1주일간 적응시킨 후, 무게에 따라 완전임의 배치한 후 60일간 물과 식이를 충분하게 공급(ad libltum)해 주면서 사육하였다 실험 전체기간 동안 실험실의 사육조건은 20±2C, 습도 40~60%를 항상 유지시켰고, 명암은 11±1시간을 주기로 조절하였다 실험 기간은 2014년 9월 16일부터 2014년 11월 11 일까지 총 8주간 실험하였다. 실험동물(Approved number; SYUIACUC 2014-036) 과정은 삼육대 학교 동물실험 윤리 위 원회(IACUC: Institutional Animal Care and Use Committees) 의 지침에 따라 수행하였다.
- 실험동물의 처리는 실험사육 최종일 12시간 동안 절식을 시키고, ethyl ether 로 살짝 마취시킨 후 복부를 절개한 뒤 심장에서 주사기를 이용하여 채혈하였다. 채취한 각 혈액은 1 시간 정도 4C 냉장실에 놓아둔 후에 원심분리기를 이용하여3, 000 rpm/15 min으로 원심분리 (A32010, Gyrozen, Daejeon, Korea)를 하여 혈청을 분리하였다.
- 실험동물의 체중은 5일에 한 번씩 측정하였다 각 군들은 희생 12시간 전부터 절식시키고, ethyl ether 로 살짝 마취시킨 후 복부를 절개한 뒤 장기를 적출하여 차가운 생리식염수에 씻은 후, 연결조직을 제거하여 중량을 측정하였다.
- 흡광도를 측정하였다. 표준물질로 trolox(Sigma Chemical)를 이용하여 검량선을 작성하였고, 각 시료의 라디칼 소거능은 건조시료 1 g당 mM Trolox equivalent로 나타내었다.
- 0 mL 의 핵산층을 분취하였다. 핵산층을 질소로 농축 및 건조시키고, o-phthaldehyde 시약 2.0 mL 를 첨가하여 잘 혼합하고, 10분 후 발색시약으로서 진한 황산 1.0 mL 를 첨가하여 잘 혼합하였다 황산 첨가 후 10〜90분내에 분광광도계 (Spectrophotometer; Human corporation, Korea)를 사용하여 550 nm 에서 흡광도를 측정하고, 표준검량선에따라 콜레스테롤의 함량을 정량하였다.
- 혈중 insulin 농도는 실험 종료일에 분리한 혈장에서 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) kit(Linco, Washington,USA) 를 사용하였고, 분석장비 (Molecular device, USA) 를 이용하여 녹십자에서 분석하였다. 혈중 leptin 농도는 ELISA를 이용하여 분석하였으며, 분석 방법은 manufacturer's protocols(R&D Systems Inc.
- 혈청 중의 LDL-cholesterol 함량은 Cho & Choi(2007) 의 방법을 참고하여 혈청 0.1 mL, 표준혈청 0.1 mL 를 시험관에 넣고 여기에 BLF kit 시약 I 및 II를 각각 4.0 mL씩 넣은 후 5초간 잘 혼합한 다음, 실온(25±3℃) 에서 25분간 방치 후 10분 이내에 증류수를 대조로 하여 분광광도계를 사용하여 650 nm 에서 흡광도를 측정하여 LDL-cholester이의 함량을 정량하였다.
대상 데이터
- 동물사료는 현재 시판되고 있는 시판용 mice 고형사료를 분말로 만든 후 사용하였으며, 동물실험용 사료조성은 탄수화물 60%(starch+sucrose+glucose+fructose+lactose) 를 기준으로 하여 단백질 21%, 지질 13%(고지방 식이 group 33% 첨가)를영양원으로 하였다. 각종 비타민과 무기질을 각각 1%, 3%, 그리고 섬유질 1%를 첨가하였으며, 여기에 Choi 등(2013)의 연구 방법을 기준으로 하여 해당화 열매 분말을 각각 10%와 20% 비율로 첨가하여 배합하였다.
- 본 연구에 사용된 해당화 열매는 동결 건조한 후, 분말(1 g)로 만들어 열수 추출물과 70.5% 에탄올 추출물의 방법은 초음파 추출(SM30-CEP, Mirco, Korea) 을 사용하였다.
- 실험동물은 (주)오리엔트 바이오로부터 분양 받아 ICR-mouse 8주령 수컷을 성숙기 모델로 잡아 실험군당 7마리를 공시하였다. 시판 고형식이 (PicoLab® Rodent Diet) 로 1주일간 적응시킨 후, 무게에 따라 완전임의 배치한 후 60일간 물과 식이를 충분하게 공급(ad libltum)해 주면서 사육하였다 실험 전체기간 동안 실험실의 사육조건은 20±2C, 습도 40~60%를 항상 유지시켰고, 명암은 11±1시간을 주기로 조절하였다 실험 기간은 2014년 9월 16일부터 2014년 11월 11 일까지 총 8주간 실험하였다.
- 해당화 열매는 2013년 11월 8일 경기도 시흥 갯골생태공원에서 채취하여 동결 건조시킨 후 분쇄하여 분말로 만들어 사용하였다.
데이터처리
- 01). 그리고 그룹들 간에 평균치 비교는 one-way ANOVA 방법에 따라 실시하였으며, 평균들간 차이의 유의성 분석 (p<0.05) 은 Duncan 의 다중검정법에 의해 실시하였다.
- 모든 결과는 3회 반복 실험한 것을 평균값으로 계산하여 나타내었다.
- 수집된 모든 자료는 SPSS package(version 18.0) 프로그램을 이용하여 평균과 표준편차를 구하였다 항산화 활성 실험방법에 대한 평균치 비교는 student /-test 방법을 이용하여 유의성 분석을 하였다3<0.01). 그리고 그룹들 간에 평균치 비교는 one-way ANOVA 방법에 따라 실시하였으며, 평균들간 차이의 유의성 분석 (p<0.
이론/모형
- 분석하였다. Serum lactate dehydrogenase(LDH) 활성은 Martinek RG(1972) 방법에 의해 UV/VIS-spectrophotometric(Specord 200, Analytik-Jena, Jena, Germany) 을 이용하여 분석하였다.
- 시료의 DPPH 라디칼 소거능 측정은 Sa'nchez-Moreno 등 (1998) 의 방법에 준하여 각각의 DPPH(1, 1-diphenyl-2-picryl- hydrazyl) 에 대한 수소공여 효과로 측정하였다 시료 50 yL 를넣고 60 yM DPPH 용액 2 mL 를 첨가하여 vortex 로 균일하게 혼합한 다음, 실온의 암실에서 30분 방치한 후, 515 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로 trolox(Sigma Chemical)를 이용하여 검량선을 작성하였고, 각 시료의 라디칼 소거능은 건조시료 1 g당 mM Trolox equivalent로 나타내었다.
- 시판 고형식이 (PicoLab® Rodent Diet) 로 1주일간 적응시킨 후, 무게에 따라 완전임의 배치한 후 60일간 물과 식이를 충분하게 공급(ad libltum)해 주면서 사육하였다 실험 전체기간 동안 실험실의 사육조건은 20±2C, 습도 40~60%를 항상 유지시켰고, 명암은 11±1시간을 주기로 조절하였다 실험 기간은 2014년 9월 16일부터 2014년 11월 11 일까지 총 8주간 실험하였다. 실험동물(Approved number; SYUIACUC 2014-036) 과정은 삼육대 학교 동물실험 윤리 위 원회(IACUC: Institutional Animal Care and Use Committees) 의 지침에 따라 수행하였다.
- 해당화 열매 분말의 일반성분 분석은 Korea Food and Drug Administration(2003) 에 준하여 실시하였으며, 수분 함량의 측정은 상압가열건조법(105℃ 건조법), 조회분은 직접회화법, 조지방은 Soxhlet 추출법 및 조단백질은 Keltech 방법으로 측정하였다. 모든 결과는 3회 반복 실험한 것을 평균값으로 계산하여 나타내었다.
- 혈액에서 phospholipid, alkaline phosphatase(ALP), aspartate transaminase(AST), alanine transaminase(ALT)은 Reitaman & Frankel(1957) 방법에 의해 UV/VIS- spectrophotometric(Specord 200, Analytik-Jena, Jena, Germany)을 이용하여 분석하였다. Serum lactate dehydrogenase(LDH) 활성은 Martinek RG(1972) 방법에 의해 UV/VIS-spectrophotometric(Specord 200, Analytik-Jena, Jena, Germany) 을 이용하여 분석하였다.
- 녹십자에서 분석하였다. 혈중 leptin 농도는 ELISA를 이용하여 분석하였으며, 분석 방법은 manufacturer's protocols(R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA) 에 의해 분석하였다.
- 혈청 중의 HDL-cholesterol 및 LDL-cholesterol 함량의 측정은 Cho & Choi(2007) 의 방법을 참고하여 HDL-cholesterol(HDL-C 555, Eiken Co., Tokyo, Japan)과 LDL-cholesterol(BLF, Eiken Co., Tokyo, Japan) kit 시약을 사용하였다.
- 혈청 중의 HDL-cholesterol 함량은 Cho & Choi(2007) 의 방법을 참고하여 혈청 0.3 mL 를 시험관에 넣고, 여기서 침전 시약 0.3 mL 를 넣어 잘 혼합한 다음, 실온에서 10분간 방치 후 700xg 에서 10분간 원심분리 하였다 그 후 상층액 50 yL, 표준용액(100 mg/dL) 50 yL, blank 로 증류수 50 yL 에 각각 HDL발색시약 3.0 mL 씩을 첨가하고 잘 섞은 후 37 C 수조상에서 5분간 가온시켰다. Blank 를 대조로 하여 555 nm 에서 흡광도를 측정하여 HDL-cholesterol^ 함량을 정량하였다
- 혈청 중의 triglyceride 함량은 Cho & Choi(2007) 의 방법을 참고하여 혈청 중의 중성지질은 TG kit(Sigma Co., St. Louis, MO, USA) 시약을 사용하여 분석하였다 혈청 10 µL, 표준용액 (300 mg/dL) 10 uL와 blank 로 탈이온수 10 µL에 TG kit 시약 1.0 mL 씩을 첨가하고 잘 혼합한 다음, 37C 수조상에서 5분간 반응시켰다. Blank 를 대조로 하여 분광광도계를 사용하여 540 nm 에서 흡광도를 측정하여 TG 의 함량을 정량하였다.
- 혈청 콜레스테롤 함량은 Cho & Choi(2007)와 Rudel & Morris(1973) 의 방법에 따라 o-phthaldehyde 법으로 측정하였다 시료를 0.1 mL 씩 분취한 다음, 33% KOH 용액 0.3 mL 와 95% 에탄올 3.0 mL 를 첨가하고 잘 혼합한 다음, 혈청은 15분 동안 60C 수조에서 가열시킨 후 냉각하였다. 핵산 5.
성능/효과
- 1. 해당화 열매 분말의 수분 함량은 4.55±0.18%, 조회분 함량은 3.75±0.16%, 조지방 함량은 6.81±0.48% 및 조단백질 함량은 8.86±0.05%로 나타났다
- 3. 혈중 LDL-cholesterol 농도는 고지방 식이에 해당화 열매 분말을 10% 첨가한 군에서 높았으며 (p<0.05), 중성지방 농도는 고지방 식이에 해당화 열매 분말을 각각 10%와 20%씩 첨가한 군에서 유의하게 낮은 수치를 보였다Q<0.05).
- 4. 혈청 내 insulin 농도는 대조군에 비해 고지방 식이를 첨가한 군에서 높은 경향을 보였으며, 고지방 식이에 해당화 열매 분말을 10% 첨가한 군(6.14±4.91 ng/dL) 에서 가장 높은 비율을 보였다@<0.05).
- 5. 혈청 내 leptin 의 농도는 고지방 식이에 해당화 열매 분말을 10% 첨가한 군에서는 10.36±5.96 ng/dL 로 높았지만, 고지방 식이에 해당화 열매 분말을 20% 첨가한 군에서 3.78±2.14 ng/dL 로 낮았다Q<0.05).
- 비만한 쥐의 경우, 혈중 leptin 의 농도는 높으며, 고지방 식이에 의해 유도된 비만에서도 leptin 저항성이 증가하는 것으로 보고되고 있다(Hong 등 2001). 위의 보고와 동일하게 본 연구에서도 고지방 식이를 섭취한 군에서는 혈중 leptin 의 농도가 높았으나, 고지방 식이에 해당화 열매 분말을 20% 첨가한 군에서는 leptin 의 농도가 오히려 낮은 것으로 나타나, 해당화 열매 분말을 20% 첨가한 군에서 혈중 leptin 의 기능을 조절하는데 효과적이라고 사료된다.
- 선행연구(Hong 등 2001) 에서는 혈중 leptin 농도와 혈중 insulin 농도가 양의 상관관계를 보인다고 보고하였으며, 본 연구에서도 두 가지 인자가 비슷한 변화 양상을 보였다. 특히 고지방 식이에 해당화 분말을 10% 첨가한 군보다는 20%를 첨가한 군에서 각각 insulin 농도와 leptin 농도의 조절 능력이 탁월한 것으로 나타났다. Havel PJ(2000) 의 연구에 의하면, 사람에게 insulin을 주입했을 때 혈중 leptin 농도를 증가시켜 insulin은 leptin 생성의 주조 절인 자라고 하였다 또한 insulin은 설치류와 사람에게서leptin 의 생성을 촉진한다고 하였다(Guerre-Millo M 1997; Hong등 2001).
- 해당화 열매 분말의 수분 함량은 4.55±0.18%, 조회분 함량은 3.75±0.16%, 조지방 함량은 6.81±0.48% 및 조단백질 함량은 8.86±0.05%로 나타났다.
- 혈중 콜레스테롤 농도와 HDL-cholesterol 농도는 대조군과 해당화 열매 분말을 먹인 그룹에서 유의한 차이는 없었다. 혈중 LDL-cholesterol 농도는 대조군(9.00±0.00 mg/dL) 과 고지방 식이에 해당화 열매 분말을 20% 첨가한 군(9.75±1.50 mg/dL) 의 비교에서는 유의한 차이는 나타나지 않았고, 고지방 식이군(10.00±1.55 mg/dL) 보다는 낮은 경향을 보여 혈중 LDL-cholesterol 농도를 낮추는데, 고지방 식이에 해당화 열매 분말을 20% 첨가한 군에서 효과가 있는 것으로 나타났다. 그러나 고지방 식이에 해당화열매 분말을 10% 첨가한 亲14.
- 혈중 중성지방 농도는 대조군(145.80±32.49 mg/dL) 에 비해 고지방 식이에 해당화 열매 분말을 각각 10%(98.00±30.69 mg/ dL) 와 20%(114.00±31.18 mg/dL) 씩 첨가한 군에서 유의하게 낮은 수치를 보였다P<0.05). 선행연구(Johnson-Johnson Diagnostics 2001; Sheo & Sheo 2002)에서는 정상 흰쥐의 혈중 중성지방량을 27~108 mg/dL로 제시하였으며, 혈중 중성지방량은 고지방 섭취 시에 동맥경화증, 당뇨병, 신장질환 및 췌장염 등을 일으킨다고 보고하였다.
- 혈중 지질의 농도는 Table 4에 제시하였다. 혈중 콜레스테롤 농도와 HDL-cholesterol 농도는 대조군과 해당화 열매 분말을 먹인 그룹에서 유의한 차이는 없었다. 혈중 LDL-cholesterol 농도는 대조군(9.
- 혈청 내 insulin 농도는 대조군(1.18±0.62 ng/dL) 에 비해 고지방식이를 첨가한 군(2.15±1.34 ng/dL) 에서 높은 경향을 보였으며, 고지방 식이에 해당화 열매 분말을 10% 첨가한 군(6.14土 4.91 ng/dL) 에서 가장 높은 수준을 보였다@<0.05). 선행연구 (Hong 등 2001)에서는 흰쥐에게 12주 이상 장기간 고지방 식이를 공급했을 경우, 혈중 insulin 농도는 증가한다고 보고하였다.
후속연구
- 05). 따라서 앞으로 해당화 열매 분말의 첨가량 조절에 대한 세밀한 연구가 진행되어야 할 것으로 사료된다. Sheo HJ(2001) 은 연구에서는 흰쥐의 정상 혈중 LDL-cholesterol 양을 10.
- 사용이 가능할 것으로 사료된다. 특히 해당화의 열매 분말은 혈중 중성지방을 낮추는 효과가 탁월하여 식품학적 활용도를 위해서 가공방법을 모색한 후 기능성 식품으로 이용 가능할 것으로 사료되며, 추후 해당화 열매의 생리활성에 대한 자세한 연구가 수반되어야 할 것이다.
- 현재 민간요법으로 한방에서는 해당화의 꽃, 꽃잎 및 뿌리를 사용하고 있는데, 본 연구를 통해 해당화의 열매도 한방에서 사용이 가능할 것으로 사료된다. 특히 해당화의 열매 분말은 혈중 중성지방을 낮추는 효과가 탁월하여 식품학적 활용도를 위해서 가공방법을 모색한 후 기능성 식품으로 이용 가능할 것으로 사료되며, 추후 해당화 열매의 생리활성에 대한 자세한 연구가 수반되어야 할 것이다.
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