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문제 정의
- Pro-inflammatory cytokine인 IL-6 생성에 미치는 시료의 효과를 조사하기 위하여 UVB를 조사하였다. UVB는 Ultraviolet BTL 20 W/12 RS(Philips, Holland)를 이용하여 20 mJ/cm2로 조사 하였으며, 사람 각질형성세포(HaCaT)를 10% Fetal bovine serum (FBS, Gibco)가 포함된 배지에 1×105개씩 분주하여 48시간 부착시켰다.
- 본 연구는 해당화꽃 추출물의 피부에서 약리활성을 조사하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
- 최근 식물자원으로부터 약물, 식품첨가제, 화장품의 소재로 개발하는 다양한 연구가 이루어지고 있는데, 화장품소재로서 기능성 으로는 항산화, 주름개선, 미백, 항염증 등이 있다. 해당화는 뿌리와 줄기에서 항산화, 항염, 혈당개선 및 혈압강화 작용 등 다양한 효능이 보고되었으며, 본 연구에서는 화장품 소재로서 잠재적 가능성 높은 해당화꽃 추출물의 기능성을 조사하였다.
제안 방법
- Chamber slide에 세포를 5×103개씩 분주하여 부착 후 시료(12.5, 25 μg/ml)와 α-MSH(100 nM)를 처리하고 3일 동안 배양 하였다.
- 1% L-dihydroxyphenylalanine(DOPA)와 실온에서 4시간 반응시켰다. PBS로 세척하고 10% formalin 용액으로 30분간 고정한 후 에탄올로 탈수시킨 다음 봉입하여 광학현미경으로 관찰하였다.
- UVB는 Ultraviolet BTL 20 W/12 RS(Philips, Holland)를 이용하여 20 mJ/cm2로 조사 하였으며, 사람 각질형성세포(HaCaT)를 10% Fetal bovine serum (FBS, Gibco)가 포함된 배지에 1×105개씩 분주하여 48시간 부착시켰다.
- UV로 유도한 전염증성 cytokine의 생성에 대한 해당화꽃 추출물의 효과를 조사하기 위하여 시료를 1시간 전처리 한 후 UV를 조사하고 24시간 배양 후 ELISA를 이용하여 측정하였다. UV 조사 시 IL-6 생성이 대조군의 약 3.
- Collagen은 피부 진피층 세포 외 기질 단백질의 90%를 이루고 있으며, collagen을 분해하는 collagenase는 주름을 유발하여 피부 노화를 촉진시킨다. 그러므로 피부노화 주원인 중의 하나인 collagenase의 활성에 미치는 시료의 영향을 조사하였다. 시료 12.
- Collagenase 활성 억제 평가 실험은 EnzCheck Gelatinase/Collagenase assay kit(Invitrogen, USA)를 사용하였다. 기질(substrate)로 DQTM gelatin from pig skin, fluorescein conjugate을 이용하여 측정하였다. 96 well plate에 reaction buffer 150 μl, 시료 20 μl, collagenase(10 μg/ml) 20 μl, gelatin(100 μg/ml) 10 μl을 처리하고 37oC 암실에서 1시간 동안 반응시킨 후 fluorescence micro plate reader(Bio-tek, USA)를 사용해 495/ 515 nm에서 측정하였다.
- 멜라닌의 정량은 Hosoi 등27)의 방법을 변형하여 사용하였다. 직경 6 cm plate에 1×105개씩 분주하여 24시간 부착시킨 후, 시료(12.
- 시료(12.5, 25 μg/ml)를 처리하고 3일간 배양 후 B16F10 세포의 수지상돌기의 변화를 위상차도립현미경(inverted phase contrast microscope, Leica)을 이용하여 관찰하였다.
- UVB는 Ultraviolet BTL 20 W/12 RS(Philips, Holland)를 이용하여 20 mJ/cm2로 조사 하였으며, 사람 각질형성세포(HaCaT)를 10% Fetal bovine serum (FBS, Gibco)가 포함된 배지에 1×105개씩 분주하여 48시간 부착시켰다. 시료를 1시간 전처리 후 배지를 PBS로 수세하고 UVB를 조사하였다. 시료가 포함된 배지에 24시간 배양 후 배지에 분비된 IL-6를 Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)법으로 정량하였다.
- 직경 6 cm plate에 1×105개씩 분주하여 24시간 부착시킨 후, 시료(12.5, 25 μg/mL)를 처리하였다.
- 멜라닌세포에서 tyrosinase는 tyrosine을 DOPA로 전환시키는 tyrosine hydroxylase와 DOPA를 DOPAquinone으로 전환시키는 DOPA oxidase로서 멜라닌 합성 초기의 두 단계 반응을 촉매하는 중요한 역할을 하고 있다. 피부의 멜라닌 합성에 미치는 영향을 조사하기 위하여 B16F10 세포의 tyrosinase 활성을 DOPA 염색으로 관찰하였다. B16F10 세포에 시료를 12.
대상 데이터
- B16F10 mouse melanoma cell은 한국세포주은행에서 분양받았으며, 5% Fetal bovine serum(FBS, Gibco)가 포함된 Dulbecco's modified Eagle medium(DMEM, Gibco) 배지를 이용하여 37oC, 5% CO2 incubator(Forma)에서 배양하였다.
- 경동시장(서울)에서 구입한 해당화꽃(매괴화, Rosa rugosa Thunb. flower, 중국산) 200 g을 자연건조 후, 100% ethanol 2L을 넣어 3일 동안 실온에서 추출하였으며, 표본은 원광대학교 해부학교실에 보관하였다. 추출액은 여과하여 감압 농축(EYELA, Japan) 및 동결 건조하여 추출물 27.
- 8%)을 얻었다. 시료는 냉장 보관하였으며 dimethylsulfoxide(DMSO)에 녹여 실험에 사용하였다.
데이터처리
- 실험 결과는 student's t-test를 이용하여 p-value를 구하였으며, p＜0.05인 경우 *로 표기하였고 p＜0.01인 경우 **로 표기하여 유의성을 나타내었다.
이론/모형
- Collagenase 활성 억제 평가 실험은 EnzCheck Gelatinase/Collagenase assay kit(Invitrogen, USA)를 사용하였다. 기질(substrate)로 DQTM gelatin from pig skin, fluorescein conjugate을 이용하여 측정하였다.
- 시료를 1시간 전처리 후 배지를 PBS로 수세하고 UVB를 조사하였다. 시료가 포함된 배지에 24시간 배양 후 배지에 분비된 IL-6를 Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)법으로 정량하였다. IL-6 assay kit(BD pharmingen, CA, USA)를 이용하여 540 nm에서 측정하였다.
- 활성산소 소거능은 Blosis26)방법에 의한 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH) 라디칼 소거법으로 측정하였다. 시료를 methanol로 녹여 500 μl를 1.
성능/효과
- 1. 해당화꽃 추출물의 DPPH 라디칼 소거능은 농도 의존적으로 유의성 있게 증가하였다.
- 2. 해당화꽃 추출물은 collagenase의 활성을 농도 의존적으로 유의성 있게 억제하였다.
- 3. 해당화꽃 추출물은 UVB에 의하여 증가된 IL-6의 생성을 농도 의존적으로 유의성 있게 억제하였다.
- 4. 해당화꽃 추출물은 멜라닌세포의 멜라닌생성, tyrosinase의 활성과 수지상돌기의 형성을 억제하였다.
- B16F10 세포에 시료를 12.5, 25 μg/ml로 처리하고 3일간 배양한 후 DOPA 염색을 실시한 결과, 시료 12.5와 25 μg/ml 처리군은 대조군에 비해 tyrosinase 활성이 감소하였다.
- 멜라닌 합성을 촉진하는 호르몬 α-MSH(100 nM) 처리군에서 대조군에 비해 tyrosinase 활성이 증가하였으며, 시료 처리군에서는 감소하였다(Fig. 4).
- 멜라닌은 수지상돌기를 통해 각질세포로 운반되는데 멜라닌세포의 형태적 관찰 결과 시료 12.5, 25 μg/ml 처리군은 대조군에 비해 수지상돌기가 감소되었다.
- 자외선은 멜라닌세포뿐만 아니라 각질형성세포도 자극하여 α-MSH 의 분비를 유도하는데32), α-MSH는 멜라닌세포의 cAMP 경로를 통해 tyrosinase 활성과 멜라닌의 생성을 촉진하며, 또한 수지상돌기의 형성도 촉진한다33). 본 실험결과, 해당화꽃 추출물은 멜라닌 세포의 tyrosinase 활성과 멜라닌 합성 및 수지상 돌기의 형성을 억제하였다(Fig. 4, 5). 특히 해당화꽃 추출물의 멜라닌생성 억제효과와 수지상돌기 형성 억제효과는 α-MSH 자극에 의한 과색소침착 조건에서 더욱 높은 것을 알 수 있었다.
- 따라서 UV에 의해 유도된 collagenase 효소의 합성을 억제하거나 활성산소에 의해 발생되는 손상을 방지하는 물질은 피부 노화를 억제하는 화장품의 소재로서 잠재적 가치가 높다고 할 수 있다. 본 실험결과, 해당화꽃 추출물의 항산화활성이 높게 나타났으며, Fig. 2와 3에서와 같이 collagenase의 활성과 pro-inflammatory cytokine인 IL-6의 생성을 억제하였다.
- 본 실험에서 해당화꽃 추출물의 항산화능을 측정한 결과 농도에 따라 DPPH radical 소거능이 증가하였고, 50 μg/ml의 농도에는 80% 이상의 높은 항산화능을 보였다.
- 시료 12.5, 25, 50, 100μg/ml의 농도에서 대조군(100%)에 비해 77.9±0.1%, 71.7±1%, 66.1±4%, 49.6±7%로 collagenase의 활성을 억제하였으며, 양성대조군인 1-10-phenanthroline( 0.5 μM/ml)의 경우 41.9±5%였다(Fig. 2).
- 1배로 감소하였다. 시료는 UV에 의해 증가된 IL-6의 생성을 현저히 억제하였다(Fig. 3).
- 실험결과 시료 12.5, 25, 50, 100 μg/ ml의 농도에서 대조군에 비해 각각 42.79±4%, 72.99±1.4%, 85.03±0.6%, 85.57±0.5%의 DPPH 소거능을 보였다(Fig. 1).
- 양성대조군인 Ascorbic acid(10 μM)는 89.40±0.2%의 소거능을 보였으며, 시료 50 μg/ml의 농도에서 80% 이상의 높은 DPPH 소거능을 나타냈다.
- 이상의 결과 해당화꽃 추출물은 항산화, 주름개선, 항염증과 더불어 멜라닌생성 억제효과가 있었으며, 화장품 소재로 활용 가치가 매우 높을 것으로 사료된다.
- 이상의 연구 결과 해당화꽃 추출물은 항산화, 항염효과가 있으며 collagenase 활성과 멜라닌 형성을 억제하였다. 따라서 해당화 꽃은 피부노화 예방과 미백 기능성 소재로서 가치가 매우 높은 것으로 사료된다.
- 최종산물인 세포내 멜라닌양을 측정한 결과에서도 α- MSH 처리군은 멜라닌양이 증가하였으며, 시료처리군에서는 유의성 있게 멜라닌양이 감소하였다(Fig. 5).
- 특히 해당화꽃 추출물의 멜라닌생성 억제효과와 수지상돌기 형성 억제효과는 α-MSH 자극에 의한 과색소침착 조건에서 더욱 높은 것을 알 수 있었다.
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