[논문]PCR을 이용한 벚나무 빗자루병균(Taphrina wiesneri)의 월동부위 검출

손수연; 이선근; 서상태

doi:10.14578/jkfs.2015.104.2.332

초록
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자낭균인 Taphrina wiesneri는 한국의 공원과 도로 주변에 주로 식재되는 왕벚나무에 빗자루병을 발생시킨다. 이 병원균은 생태적 특성이 잘 알려져 있지 않아 방제법 등을 개발하는데 어려움이 있다. 이번 연구에서는 빗자루 병원균의 월동부위를 조사하기 위해 빗자루 병징을 보이는 왕벚나무의 건전가지와 이병가지, 그리고 병징이 나타나지 않은 건전한 왕벚나무 가지에서 종 특이적 primer (TwITSF와 TwITSR)를 사용하여 월동부위를 조사하였다. 그 결과 빗자루병에 감염된 왕벚나무의 이병가지 뿐만 아니라 건전가지에서도 종 특이적인 PCR 증폭산물이 관찰되었으며, 그 이외의 건전한 왕벚나무와 감염목 주변의 다른 식물 종 샘플에서는 PCR 증폭산물이 관찰되지 않았다.

Abstract ▼ AI-Helper

Taphrina wiesneri, a pathogen of cherry witches' broom, is highly pathogenic to Prunus yedoensis Matsumura which are widely planted in parks and streets in South Korea. In order to control the disease, it is crucial to know the life cycle of the fungus. We attempted to detect the fungus tentatively ...

Taphrina wiesneri, a pathogen of cherry witches' broom, is highly pathogenic to Prunus yedoensis Matsumura which are widely planted in parks and streets in South Korea. In order to control the disease, it is crucial to know the life cycle of the fungus. We attempted to detect the fungus tentatively overwintering in shoots and branches of cherry trees both having witches' broom and healthy before flowering and leafing in spring using PCR with species-specific primer set (TwITSF and TwITSR). Genomic DNAs were extracted from the symptomatic and the asymptomatic shoots or branches. Results indicated that T. wiesneri is present in leaf buds and inner bark not only in symptomatic branches but also in the asymptomatic branches in diseased trees. However, the fungus was not detected in flower buds of the symptomatic trees and any samples of healthy trees.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

wiesneri의 염기서열과 100% 일치하였다. 따라서 본 연구에 사용된 primer는 일본 균주 뿐만아니라 국내 균주에서도 특이적으로 반응하는 것이 확인되었으므로 국내에서의 벚나무 빗자루병 진단연구에 효과적으로 이용될 수 있는 가능성을 제시하였다. 이를 위해 앞으로 좀 더 다양한 Taphrina 속 균들을 추가하여 이번에 이용한 primer의 종 특이성을 검정할 필요가 있다.

제안 방법

본 연구에서는 Komatsu et al.(2010)이 제작한 종 특이적 primer를 이용한 PCR을 실시하여 국내의 건전한 벚나무와 T. wiesneri에 감염된 벚나무로부터 T. wiesneri의 월동부위를 탐색하였다.
PCR 용액의 조성은 최종농도 10 mM Tris-HCl(pH 8.5), 40 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 200 nM dNTPs 이었으며, 각 10 pM의 primer(TwITSF: 5’-GAA TCT TTG AAC GCA CAT TGC-3’, TwITSR: 5’-ATC CCA GAA GGT TCG CAA GT-3’)와 10 ng의 주형 DNA를 첨가하고 Taq DNA polymerase(TaKaRa Ex Taq, TAKARA BIO INC., Japan) 0.1 unit를 사용하여 총 반응용량을 50 µL로 하였다.
한편, 건전한 왕벚나무는 반경 30 m 내에 이병목이 없는 나무를 선택하여 꽃눈과 잎눈이 포함된 가지를 채집하였다. 또한, 왕벚나무 주변 식물에서의 월동 가능성을 검정하기 위하여 왕벚나무 이병목 근처에서 자라는 회양목(Buxus microphylla var. koreana Nakai), 사철나무(Euonymus japonicus Thunb.),철쭉(Rhododendron schlippenbachii Max.)의 가지를 채집하였다. 채집한 가지들은 냉장보관상태를 유지시키고 실험실로 운반하여 70% ethanol을 이용하여 1분간 표면살균 한 후, 각각 꽃눈, 잎눈, 가지로 분류하여 2 mL microtube에 넣고 DNA 추출 전까지 -20ºC에 보관하였다.
첫 cycle은 94ºC에서 2분간 denaturation 하고, 그 후 30 cycles 과정은 94ºC에서 30초간 denaturation, 54ºC에서 30초간 annealing, 72ºC에서 30초간 extension한 후, 마지막 extension은 72ºC에서 10분간 실시하였다. 증폭된 PCR 산물은 1.5% agarose gel에서 전기영동 후 ethidium bromide로 염색하여 UV lamp에서 확인하였다.
첫 cycle은 94ºC에서 2분간 denaturation 하고, 그 후 30 cycles 과정은 94ºC에서 30초간 denaturation, 54ºC에서 30초간 annealing, 72ºC에서 30초간 extension한 후, 마지막 extension은 72ºC에서 10분간 실시하였다.

대상 데이터

wiesneri는 Seo et al.(2009)의 방법을 이용하여 분리하였으며, 기타 공시균주는 국립산림과학원 산림병해충연구과에서 보존중인 균주를 이용하였다(Table 1).
T. wiesneri의 월동부위를 탐색하기 위하여 2014년 3월 27일 경기도 가평에서 빗자루 병징을 나타내는 왕벚나무 내에서 이병가지와 건전가지를 채집하였다. 한편, 건전한 왕벚나무는 반경 30 m 내에 이병목이 없는 나무를 선택하여 꽃눈과 잎눈이 포함된 가지를 채집하였다.

이론/모형

공시한 균주들의 DNA는 PDA(Potato Dextrose Agar, BD DifcoTM, USA) 배지에서 2-3일간 배양 후 멸균수에 현탁하여 DNA extraction kit(DNeasy® Plant Mini kit, Qiagen, Netherlands)를 이용하여 분리하였고, 종 특이적 PCR은 PCR 용액의 조성을 제외하고 Komatsu 등(2010)이 보고한 방법에 준하여 실시하였다.

성능/효과

Komatsu et al.(2010)이 제작한 T. wiesneri 종 특이적 Primer에 대하여 국내 균주 적용의 가능성 여부를 확인하기 위해서 13개의 T. wiesneri 균주들과 대조구로 사용한 4종의 진균과 3종의 세균으로부터 DNA를 추출하고 T.wiesneri에 특이적인 primer를 이용하여 PCR을 실시한 결과, T. wiesneri 균주들에서만 123 bp의 종 특이적인 증폭산물이 검출되었으며, 대조구로 사용한 진균과 세균에서는 검출되지 않았다(Table 1). 증폭된 PCR 산물의 염기서열을 분석한 결과, T.
wiesneri의 염기서열과 100% 일치하였다. 또한, 회양목, 사철나무, 철쭉나무에서도 T. wiesneri 종 특이적 증폭산물은 관찰되지 않았다. Carrieri et al.
한편, 건전한 왕벚나무의 모든 시료에서는 특이적 증폭산물이 관찰되지 않았다. 종 특이적 증폭산물이 관찰된 모든 샘플에서는 T.wiesneri가 분리되었으며, 증폭된 PCR 산물의 염기서열을 분석한 결과, T. wiesneri의 염기서열과 100% 일치하였다. 또한, 회양목, 사철나무, 철쭉나무에서도 T.
wiesneri 균주들에서만 123 bp의 종 특이적인 증폭산물이 검출되었으며, 대조구로 사용한 진균과 세균에서는 검출되지 않았다(Table 1). 증폭된 PCR 산물의 염기서열을 분석한 결과, T. wiesneri의 염기서열과 100% 일치하였다. 따라서 본 연구에 사용된 primer는 일본 균주 뿐만아니라 국내 균주에서도 특이적으로 반응하는 것이 확인되었으므로 국내에서의 벚나무 빗자루병 진단연구에 효과적으로 이용될 수 있는 가능성을 제시하였다.
한편, 벚나무 빗자루병 이병목의 건전부와 이병부의 가지로부터 T. wiesneri에 종 특이적인 primer를 이용하여 PCR을 실시한 결과, 빗자루 병징을 나타내는 왕벚나무의 건전가지와 이병가지의 잎눈과 가지에서 종 특이적 증폭산물이 검출되었다(Table 2).

후속연구

, 2007). 그러나 본 연구에서는 이병가지에 비해 낮은 밀도지만 왕벚나무 이병목의 건전한 가지와 잎눈에서도 T. wiesneri균이 검출되었기 때문에 감염된 이병가지 뿐만 아니라 감염목 전체에 대한 체계적인 방제법 개발이 필요할 것이다.
따라서 본 연구에 사용된 primer는 일본 균주 뿐만아니라 국내 균주에서도 특이적으로 반응하는 것이 확인되었으므로 국내에서의 벚나무 빗자루병 진단연구에 효과적으로 이용될 수 있는 가능성을 제시하였다. 이를 위해 앞으로 좀 더 다양한 Taphrina 속 균들을 추가하여 이번에 이용한 primer의 종 특이성을 검정할 필요가 있다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	국내에서 왕벚나무의 주요 활용처은?	벚나무는 장미과(Rosaceae)에 속하는 낙엽교목으로 주로 조경수로 이용되고 있으며, 국내에는 약 20여종이 분포하고 있다(Lee, 2006). 이들 중 왕벚나무(Prunus yedoensis Matsumura)는 국내에서 가로수 및 정원수로 전국에 식재되고 있다. 왕벚나무는 많은 병원균에 대해 감수성이 높은 식물로 알려져 있으며, 특히 Taphrina wiesneri에 의한 빗자루병 피해가 심각하다(Shimizu et al.
	벚나무란?	벚나무는 장미과(Rosaceae)에 속하는 낙엽교목으로 주로 조경수로 이용되고 있으며, 국내에는 약 20여종이 분포하고 있다(Lee, 2006). 이들 중 왕벚나무(Prunus yedoensis Matsumura)는 국내에서 가로수 및 정원수로 전국에 식재되고 있다.
	벚나무 빗자루병의 병징 원인은?	벚나무 빗자루병균에 감염되면 가지가 비대해지고, 그 부분에서 작은 가지들이 밀생하며, 감염된 가지에서는 꽃이 거의 피지 않는다. 이러한 병징은 병원균이 기주에 호르몬 이상을 초래하여 나타나는 것으로 알려져 있다(Johnston과 Trione, 1974).

참고문헌 (9)

Agrios, G.N. 2005. Plant pathology, 5th edn. Elsevier Academic Press. San Diego.
Carrieri, R., D'Elia, I., Geraci, G., Alioto, D., Ragozzino, A. and Gaudio, R. 2010. Molecular evidence of Taphrina wiesneri in leaves and buds of healthy sweet cherry: A possible endophytism. Jounal of Plant Pathology 92: 327-333.
Johnston, J.C. and Trione, E.J. 1974. Cytokinin production by the fungi Taphrina cerasi and T. deformans. Canadian Journal of Botany 52: 1583-1589.

상세보기
Komatsu, M., Taniguchi, M., Matsushita, N., Takahashi, Y. and Hogetsu, T. 2010. Overwintering of Taphrina wiesneri within cherry shoots monitored with species-specific PCR. Journal of General Plant Pathology 76: 363-369.

상세보기
Lee, Y.N. 2006. New flora of Korea. Vol Kyo-Hak Publishing Co. Ltd. pp. 565-578.
Seo, S.T., Kim, K.H., Shin, C.H., Lee, S.H., Kim, Y.M., Park, J.H., and Shin, S.C. 2009. Control efficacy of fungicides on cherry witches' broom casued by Taphrina wiesneri. Research in Plant Disease 15: 13-16.

원문보기 상세보기
Shimizu, J., Fukuda, K. and Ikemoto, S. 2009. Distribution pattern of Perenniporia fraxinea on Izumino cherry street trees. Journal of Tree Health 13: 83-84.
Shoji, T. and Sato, K. 1980. Control of witches' broom on cherry trees caused by Taphrina wiesneri by pruning of the diseased twigs and fungicidal application. Annual Report of the Society of Plant Protection of North Japan 31: 95-97.
Yamamoto, A., Matsuda, Y., and Ito, S. 2007. Toward the establishment of control system on witches' broom of cherrypast knowledge and future direction of the study. Tree For Health 11: 115-120.

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