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문제 정의
- 丹蔘 메탄올 추출물 (SMR)의 항산화 활성이 마우스 대식세포에서의 항염증, 세포 내 활성 산소를 억제하는 연구를 수행하여 아래와 같은 결과를 얻었다.
- 그에 따라 본 연구에서는 항산화제에 의한 산화적 스트레스가 차단될 경우 염증반응이 효과적으로 억제된다는 사실들 10, 11)을 기반으로 LPS로 염증이 유도된 RAW264.7 mouse macrophage cell line을 이용하여 한약재 丹蔘의 메탄올 추출물이 나타내는 염증억제반응을 관찰하여, 丹蔘 추출물이 염증성 질환의 예방과 치료에의 응용 가능성을 검토하였다.
- 산화적 Free radical에 전자를 공여하여 산화를 억제시키게 하는 방법으로서 항산화효과를 보는 것을 목적으로 하였다. 항산화능은 페놀화합물의 양과 상관관계가 있는 것으로 보고되고 있으며17, 18), 본 연구에서 SMR과 양성대조군의 전자공여 능을 농도별로 측정하여 비교한 결과 SMR의 활성이 비교적 높은 것으로 나타났다(Table 1).
제안 방법
- 각 시료의 단백질 농도는 BCA assay를 이용하여 정량 하였고, 각 단백질의 동등한 양을 변성시킨 뒤 SDS- polyacrylamide gels을 통해 분리 한 다음 nitrocellulose membranes을 통해 전달 시킨 뒤, Membrane을 실온에서 1 시간 동안 5% skim milk에 블로킹시켰다. 1차 항체 i-NOS (1:2000), COX-2 (1:1000), beta-actin (1:1000)을 저온실에 하루 보관 시키고, TBST 완충액으로 세척한 후, HRP conjugated a goat anti-mouse IgG, pAb (1:3000), HRP conjugated a goat anti-rabbit IgG, pAb (1:5000)을 이용하여 1시간 실온에서 반응시켜 주었다. 반응 시킨 뒤 다시 TBST 완충액으로 세척한 후 West-Q Chemiluminescent Substrate Kit, Plus (GenDEPOT)에 의해 활성화 된 단백질 밴드를 LAS (Luminescent Analyzeer system)를 사용하여 시각화 하였다.
- PBS로 1회 washing 한 다음 5mM Hydrogen peroxide (H2O2)를 가하고, 30분 배양한 뒤에 Fluorescence reader를 이용해 excitation 485nm, emission 530nm에서 형광강도를 측정하였다. DCF 형광광도의 증가율은 대조군과 비교하여 배수 (fold)로 계산하였다.
- 약물 처리 후 배지를 제거한 다음, Phosphate Buffer Saline (PBS)로 희석된 10uM 2' 7-dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA)를 가하고, 30분간 배양하였다. PBS로 1회 washing 한 다음 5mM Hydrogen peroxide (H2O2)를 가하고, 30분 배양한 뒤에 Fluorescence reader를 이용해 excitation 485nm, emission 530nm에서 형광강도를 측정하였다. DCF 형광광도의 증가율은 대조군과 비교하여 배수 (fold)로 계산하였다.
- SMR의 총 폴리페놀 함량은 Tannic acid를 이용하여 표준 곡선으로 mg/g TAE (Tannic Acid Equivalent) 단위로 나타내었고, 플라보노이드 함량은 Naringin을 이용한 표준 곡선으로 mg/g NE (Naringin Equivalent)를 구하였다. 그 결과는 Table 1과 같은데 SMR에서의 함량은 그리 높지 않은 것으로 나타났다.
- 차가운 PBS으로 2회 세척한 후, pro-prep (iNtRON Biotech, Seongnam, Korea)을 이용하여 용해된 세포들을 수득하였다. 각 시료의 단백질 농도는 BCA assay를 이용하여 정량 하였고, 각 단백질의 동등한 양을 변성시킨 뒤 SDS- polyacrylamide gels을 통해 분리 한 다음 nitrocellulose membranes을 통해 전달 시킨 뒤, Membrane을 실온에서 1 시간 동안 5% skim milk에 블로킹시켰다. 1차 항체 i-NOS (1:2000), COX-2 (1:1000), beta-actin (1:1000)을 저온실에 하루 보관 시키고, TBST 완충액으로 세척한 후, HRP conjugated a goat anti-mouse IgG, pAb (1:3000), HRP conjugated a goat anti-rabbit IgG, pAb (1:5000)을 이용하여 1시간 실온에서 반응시켜 주었다.
- 1차 항체 i-NOS (1:2000), COX-2 (1:1000), beta-actin (1:1000)을 저온실에 하루 보관 시키고, TBST 완충액으로 세척한 후, HRP conjugated a goat anti-mouse IgG, pAb (1:3000), HRP conjugated a goat anti-rabbit IgG, pAb (1:5000)을 이용하여 1시간 실온에서 반응시켜 주었다. 반응 시킨 뒤 다시 TBST 완충액으로 세척한 후 West-Q Chemiluminescent Substrate Kit, Plus (GenDEPOT)에 의해 활성화 된 단백질 밴드를 LAS (Luminescent Analyzeer system)를 사용하여 시각화 하였다.
- 이는 Carmichaeal 등의 방법15)을 응용하였다. 세포가 부착되어 있는 plate에 MTT solution (1mg/ml)을 동량반응 시켜 2시간 동안 incubator 에서 반응시키고 상층액을 제거 한 후 남아 있는 formazan 을 용해시켜 Fluorescence reader를 이용해 570nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 데이터들은 다음과 같이 계산하였다.
- 샘플 100µl, 1N Folin-ciocalteu's phenol reagent를 100µl 을 반응시킨 후 실온에서 3분간 방치하고, 2% 탄산나트륨을 2ml을 넣어 30분 동안 반응시켰다. 아스코르브산을 양성대조군으로 사용하고, Fluorescence reader로 725nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 위 실험은 Blois의 방법14)을응용하였다. 전자공여능은 시료 첨가한 샘플과 첨가하지 않은 샘플 차이를 백분율로 구하였으며, EDA를 50% 감소시키는데 필요한 농도를 Inhibition concentration 50% (IC50) 값으로 계산하여 구하였다. 양성대조군으로서 아스코르브산과 Butylated hydroxyanisole (BHA), Butylated hydroxytoluene (BHT)를 이용하였다.
- 차가운 PBS으로 2회 세척한 후, pro-prep (iNtRON Biotech, Seongnam, Korea)을 이용하여 용해된 세포들을 수득하였다. 각 시료의 단백질 농도는 BCA assay를 이용하여 정량 하였고, 각 단백질의 동등한 양을 변성시킨 뒤 SDS- polyacrylamide gels을 통해 분리 한 다음 nitrocellulose membranes을 통해 전달 시킨 뒤, Membrane을 실온에서 1 시간 동안 5% skim milk에 블로킹시켰다.
대상 데이터
- Folin & Ciocalteu's phenol reagent와 Sodium carbonate, Diethylene glycol, 2, 2-Diphenyl-1-pikryl-hydrazyl 등 이하 나머지 시약들은 Sigma-Aldrich, Co., 를 Dimethyl sulfoxide (DMSO)와 30% hydrogen peroxide는 Junsei chemical Co., 에서 추출에 사용한 Methanole SK chemicals, 세포 배양액인 Dulbecco's Modifide Eagle Medium (DMEM)은 welgene, Fetal bovine serum (FBS)과 Penicillin -streptomycin는 Gibco BRL (Grand Island, USA), 실험에 사용된 시약 중 Sodium Dodesyl Sulfate (SDS)는 Bioneer Co., 30% Acrylamide는 Bio-RAD, 단백질 정량에 사용한 Bovine serum albumin (BSA)는 Thermo scientific, Skim milk는 BD science에서 iNOS는 EMD Millipore Co., 에서 COX-2 및 Goat anti-rabbit IgG, pAb (HRP conjugate), Goat anti-mouse IgG, pAb (HRP conjugate)는 Enzo사에서, beta-actine Santa Cruz사 제품을 이용하였다.
- 마우스 유래 대식세포주인 RAW264.7 세포는 10% Fetal bovine serum (FBS)과 1% penicillin-streptomycin을 포함하는 DMEM 배지를 사용하였다. 세포는 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다.
- 본 실험에 사용한 丹蔘은 광명당제약 (울산, 대한민국)으로부터 중국산을 구입하여 사용하였다. 실험에 사용하기 위해 丹蔘은 400g을 적당량의 메탄올에 넣고 추출이 잘 되도록 2일 정도 잘 섞어 준 후 rotary vacuum evaporator (EYELA, 일본) 및 speed vacuum을 이용하여 메탄올 추출물 (SMR) 을만들었으며, 이를 냉동실에 보관하였다가 실험 직전에 필요한 농도로 만들어 사용하였다.
- 중국산을 구입하여 사용하였다. 실험에 사용하기 위해 丹蔘은 400g을 적당량의 메탄올에 넣고 추출이 잘 되도록 2일 정도 잘 섞어 준 후 rotary vacuum evaporator (EYELA, 일본) 및 speed vacuum을 이용하여 메탄올 추출물 (SMR) 을만들었으며, 이를 냉동실에 보관하였다가 실험 직전에 필요한 농도로 만들어 사용하였다. 사용된 동일한 한약재 시료 부산대학교 약재보관실 (시료 번호: 2014-DSM004)에 보관 중이다.
- 전자공여능은 시료 첨가한 샘플과 첨가하지 않은 샘플 차이를 백분율로 구하였으며, EDA를 50% 감소시키는데 필요한 농도를 Inhibition concentration 50% (IC50) 값으로 계산하여 구하였다. 양성대조군으로서 아스코르브산과 Butylated hydroxyanisole (BHA), Butylated hydroxytoluene (BHT)를 이용하였다.
데이터처리
- 모든 실험은 3번 반복하고, 실험 결과는 평균±표준편차로 표현하였다. 통계 프로그램 SIGMAPLOT 12.
- 표현하였다. 통계 프로그램 SIGMAPLOT 12.0 version을 사용하고, 제어 및 실험군 간의 통계적 유의성을 비교한 표본 t검정(t-test) 및 일원 분산 분석(one-way ANOVA)에 의해 확인되었다. 모든 그래프에서 p 값은 0.
이론/모형
- 단백질의 발현 수준은 Western blot 분석을 통해 확인하였다. 차가운 PBS으로 2회 세척한 후, pro-prep (iNtRON Biotech, Seongnam, Korea)을 이용하여 용해된 세포들을 수득하였다.
- 동시에 SMR이 RAW264.7 세포주에 대해 독성이 있는지 측정하기 위해3-[4, 5-dimethylthiazol-2-yl]-2, 5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay 방법으로 분석하였다. 이는 Carmichaeal 등의 방법15)을 응용하였다.
- 8 ml을 혼합하여 암실에서 30분간 반응 시켜 Fluorescence reader를 이용해 510 nm에서 흡광도를 측정하였다. 위 실험은 Blois의 방법14)을응용하였다. 전자공여능은 시료 첨가한 샘플과 첨가하지 않은 샘플 차이를 백분율로 구하였으며, EDA를 50% 감소시키는데 필요한 농도를 Inhibition concentration 50% (IC50) 값으로 계산하여 구하였다.
- 총 폴리페놀 함량은 Folin-Denis의 방법12)을 참고하여 사용하였으며, 검량선 기준 물질으로 탄닌산을 사용하였다. 샘플 100µl, 1N Folin-ciocalteu's phenol reagent를 100µl 을 반응시킨 후 실온에서 3분간 방치하고, 2% 탄산나트륨을 2ml을 넣어 30분 동안 반응시켰다.
- 총 플라보노이드 함량은 Diethylene glycol colorimetry 방법13)을 참고하여 사용하였으며, 검량선 기준 물질으로 Naringin 을 사용하였다. 샘플 100µl에 diethylene glycol 1 ml을 반응시키고 이어서 1N NaOH 100µl를 넣어준 뒤, 항온 수조에 1시간 반응시켰다.
성능/효과
- 1. 양성대조군들에 비해 뛰어난 항산화 효과는 나타내지 않았지만 RAW264.7 세포주에서의 RNS와 ROS를 억제하는 효과를 얻을 수 있었다.
- 2. 추출물의 세포 독성 여부를 확인하여 세포 생존율에 영향을 미치지 않는 농도 (-100µg/ml)를 선정하였으며, 세포 내 NO를 억제하는 것을 확인한 결과 각 농도에서 염증 억제 반응을 나타내었고 (p<0.001), 이 결과로인해 SMRe LPS로 자극된 염증인자인 NO 생성 전구물질인 i-NOS와 COX-2의 발현도 저해하는 결과를 단백질 수준에서도 확인하였다.
- 3. 세포 내 ROS 억제 실험을 한 결과, 5mM의 Hydrogen peroxide와 LPS를 자극시켜 세포 내 ROS를 유도한 결과 농도의존적으로 (p<0.001) ROS의 생성을 저해하였다.
- LPS 처리에 의해 수치가 상승되었던 세포 내 ROS가 SMR 처리에 의해 유의하게 감소함을 확인하였고, 이러한 감소는 SMR의 농도에 의존적으로 나타났다(Fig. 3).
- SMR에 의한 대식세포의 독성을 MTT assay에 의해 확인한 결과 농도별 약물을 주입하였을 때 각 농도에서 대식세포에 대한 독성을 일으키지 않은 것으로 나타났다(Fig. 1).
- SMR이 LPS에 의해 유도된 RAW264.7 cell에서의 i-NOS와 COX-2의 발현에 영향을 미치는 것을 Western blot을 통해 확인하기 위하여 LPS 처리 후 SMR을 25, 50, 100µg/ml의농도로 처리하였으며, 그 결과 LPS 처리한 군에서 발현이 증가하였던 COX-2의 활성이 SMR 100 µg/ml의 농도처리에 의해 유의적인 감소함을 확인할 수 있었다(Fig. 2B, C).
- DCFH-DA는 산화적 손상을 조사하기 위해 사용되어 왔는데, 세포에 전처리하면 세포 안으로 들어가, H2O2와 반응하면 형광을 띠는 DCF 를 생성하게 되므로 형광강도를 측정하면 세포 내 ROS 생성량을 측정할 수 있다. 본 실험에서 역시 LPS에 의해 유도된 ROS 생성이 SMR 처리에 의해 농도 의존적으로 유의하게 감소하는 것이 확인되었다.
- NO는 Reactive nitrogen species (RNS) 라고불리며 활성산소중 하나이며, 염증 유발에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다20). 본 연구에서 LPS 단독으로 처리한 경우 염증 발현이 상승함을 확인하였고 SMRe 농도에 의존적으로 이러한 염증 반응을 감소시켰으며, 이러한 과정에 NO 및 COX-2 발현의 억제가 관여함도 확인할 수 있었다.
- 2A에 나타내었다. 생성된 NO의 양을 Griess reagent를 이용하여 세포 상등액과 반응하였으며, LPS만 처리한 군에서 염증발현이 최대치임을 알 수 있었고, 추출물들의 농도 의존적으로 감소함을 알 수 있었다.
- 항산화능은 페놀화합물의 양과 상관관계가 있는 것으로 보고되고 있으며17, 18), 본 연구에서 SMR과 양성대조군의 전자공여 능을 농도별로 측정하여 비교한 결과 SMR의 활성이 비교적 높은 것으로 나타났다(Table 1).
후속연구
- 본 연구에서는 丹蔘의 메탄올 추출물인 SMR에 포함된 플라보노이드 함량이 그다지 높은 편이 아닌데도 일부 양성 대조군에 크게 뒤지지 않은 항산화 활성을 보였고, 연구 재료로 사용된 RAW264.7 세포에서 100µg/ml 농도에서까지 세포독성을 전혀 보이지 않았으므로 향후 SMR이 다양한 세포주를 이용한 연구에 활용될 수 있음을 보였다.
- 위의 내용을 종합하면 본 연구를 통해 丹蔘의 메탄올 추출물인 SMR이 항산화 작용과 함께 항염증 효과도 가지고 있으며, 현재까지 다양한 천연물을 대상으로 항산화 활성이 보고된 것을 감안하면 향후 이러한 재료들을 대상으로 추가적인 항염증 활성 또는 항암 활성 등에 대한 접근이 가능할 것으로 보인다.
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