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문제 정의
- 본 연구에서는 미세조류로부터 바이오매스 및 생리활성물질의 대량생산을 최종목적으로 설계되었으며, 이에 따라 먼저 생리활성물질을 생산하는 미세조류의 무균순수분리 및 미세조류 배양에 필요한 균체 생육도 측정법을 확립하고자 하였으며, 또한 생리활성물질인 astaxanthin의 생성량을 파악하고자 하였다.
제안 방법
- Astaxanthin이 유도된 배양균체(H. lacustris)는 8, 000× g, 4℃로 10분간 원심분리하여 상층액을 제거하고 균체는 증류수로 반복 세척하였으며, 원심분리한 균체에 acetone을 첨가하여 초음파 파쇄기(Branson 250, Dabbury, CT, USA)로 냉각추출을 반복하였다. 그 후, 원심분리를 통하여 침전물의 균체 찌꺼기는 동결건조하여 고형분 회수율을 계산하였으며, 상층액은 감압, 농축하여 용매를 제거하고, n-Hexane을 첨가하여용해시켰다.
- H. lacustris의 세포벽을 파쇄하여 astaxanthin을 추출하였으며, 이를 이용하여 광범위한 파장에 걸쳐 UV spectrum을 조사하였고, 또한 확인된 파장에서 흡광도와 astaxanthin 농도의 상관관계를 조사하여 생성량을 측정하였다. Astaxanthin standard curve를 그리기 위해 사용된 표준물질은 독일 슈트트가르트 Subitec Gmbh 회사로부터 공급받았다.
- 0 조건에서 실시하였다. H. lacustris의배양을 위해 60-70 μmol photon․m-2․s-의 조건에 맞는 형광등 10개를 장착하고, 일정 광량을 조절할 수 있게 shaking in- cubator를 제작하여 사용하였다. 또한 이산화탄소 농도의 경우 air와 고순도 이산화탄소를 일정비율로 혼합하여 조절하였으며, 유속은 flowmeter를 이용하여 조절하였다.
- 1 vvm, 5% CO2 조건에서 250 ml elernmeyer flask에 130 ml working volume으로 전 배양을 실시하였으며, 배양 15일 전후로 성장상태가 우수한 균주를 선발하여 실험에 사용하였다. 균주배양은 25˚C, 3000× g, 10% inoculum, pH 7.0 조건에서 실시하였다. H.
- lacustris)는 8, 000× g, 4℃로 10분간 원심분리하여 상층액을 제거하고 균체는 증류수로 반복 세척하였으며, 원심분리한 균체에 acetone을 첨가하여 초음파 파쇄기(Branson 250, Dabbury, CT, USA)로 냉각추출을 반복하였다. 그 후, 원심분리를 통하여 침전물의 균체 찌꺼기는 동결건조하여 고형분 회수율을 계산하였으며, 상층액은 감압, 농축하여 용매를 제거하고, n-Hexane을 첨가하여용해시켰다. 또한 분액깔때기에 물과 함께 첨가하여 흔들고, 수용액층을 제거(3회 반복)한 후, sodium sulfate anhydrous 를 이용하여 잔류수분을 제거시켜 astaxanthin을 추출하였다
- 단조주로부터 오염되어있는 세균을 제거하기 위하여 항생제 처리법을 실시하여 무균 순수분리를 시도하였다. 항생물질은 ampicillin (100 μg/ml), streptomycin (10 μg/ml), chlor- amphenicol (10 μg/ml), penicillin (10 μg/ml), neomycin (50μg/ml), gentamycin (50 μg/ml), kanamycin (10 μg/ml), 그리고 항진균제인 nystatin (1.
- 0×10-8이었다. 따라서 UV spectrometer를 이용하여 세포의 생장속도를 확인할 수 있었으며 이렇게 확립된 방법을 이용하여 항산화제 등의 유용한 용도로 사용이 가능한 astaxanthin을 배양, 추출 하는 데에 사용하였다.
- 또한 미세조류의 양을 간편하게 측정하기 위하여 UV spectrum 상의 680, 750 nm의 파장에서 흡광도와 세포의 양을 비교한 결과, 선형성이 나타남을 확인하고 미세조류의 생장량을 평가하였다. 더 나아가 H.
- 그 후, 원심분리를 통하여 침전물의 균체 찌꺼기는 동결건조하여 고형분 회수율을 계산하였으며, 상층액은 감압, 농축하여 용매를 제거하고, n-Hexane을 첨가하여용해시켰다. 또한 분액깔때기에 물과 함께 첨가하여 흔들고, 수용액층을 제거(3회 반복)한 후, sodium sulfate anhydrous 를 이용하여 잔류수분을 제거시켜 astaxanthin을 추출하였다
- lacustris의배양을 위해 60-70 μmol photon․m-2․s-의 조건에 맞는 형광등 10개를 장착하고, 일정 광량을 조절할 수 있게 shaking in- cubator를 제작하여 사용하였다. 또한 이산화탄소 농도의 경우 air와 고순도 이산화탄소를 일정비율로 혼합하여 조절하였으며, 유속은 flowmeter를 이용하여 조절하였다.
- 5 μg/ml)을 사용하였으며, 각 항생제를 지시 농도대로 각각 단독 처리하거나 항생제 혼합물을 조제하여 처리하였다. 미세조류 배양액을 항생제에 12시간 동안 노출시킨 후, 항생제를 첨가하지 않은 배지에서 배양하면서 미세조류의 생육도와 배양액의 무균성을 조사하였으며, 무균성은 일정량의 배양액을 LB plate에 접종하여 30℃에서 배양하면서 미생물 콜로니 생성 유무나 현미경으로 검경하여 확인하였다. 아래 Table 2에 표시한 항생제를 농도별로 처리한 후 생균수 측정법으로 오염유무를 평가하였다.
- 미세조류의 생성량, 성장속도 등을 정량적으로 파악하기 위해 분광법을 이용하여 absorbance와 세포수의 상관관계를 조사하였다.
- 미세조류 배양액을 항생제에 12시간 동안 노출시킨 후, 항생제를 첨가하지 않은 배지에서 배양하면서 미세조류의 생육도와 배양액의 무균성을 조사하였으며, 무균성은 일정량의 배양액을 LB plate에 접종하여 30℃에서 배양하면서 미생물 콜로니 생성 유무나 현미경으로 검경하여 확인하였다. 아래 Table 2에 표시한 항생제를 농도별로 처리한 후 생균수 측정법으로 오염유무를 평가하였다.
- 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 앞서 설명한 대로 H. la- custris로부터 생리활성 물질인 astaxanthin을 추출한 후, 이를 이용하여 넓은 파장에 걸쳐 UV spectrum을 얻었으며 472 nm 의 파장주위로 강한 흡수 피크를 확인하였다(Fig. 4A). 또한, 이렇게 확인된 472 nm의 파장에서 absorbance 양과 astax- anthin의 농도는 Fig.
- 4B에서 제시하는 바와 같이 선형성을 나타내었다. 이러한 방법은 Ana 등[2] 및 Strickland와 Parsons [32]이 사용한 분광학적인 방법에 따른 것이며, BBM 배지에서 배양된 H. lacustris를 이용하여 astaxanthin의 축적 정도를 확인하기 위하여 UV scanning을 실시한 결과, Fig. 5에서 나타난 바와 같이 astaxanthin이 축적된 것을 관찰하였다. 이는 Ana 등, 이 등, 그리고 박 등이 H.
- 항생물질은 ampicillin (100 μg/ml), streptomycin (10 μg/ml), chlor- amphenicol (10 μg/ml), penicillin (10 μg/ml), neomycin (50μg/ml), gentamycin (50 μg/ml), kanamycin (10 μg/ml), 그리고 항진균제인 nystatin (1.5 μg/ml)을 사용하였으며, 각 항생제를 지시 농도대로 각각 단독 처리하거나 항생제 혼합물을 조제하여 처리하였다. 미세조류 배양액을 항생제에 12시간 동안 노출시킨 후, 항생제를 첨가하지 않은 배지에서 배양하면서 미세조류의 생육도와 배양액의 무균성을 조사하였으며, 무균성은 일정량의 배양액을 LB plate에 접종하여 30℃에서 배양하면서 미생물 콜로니 생성 유무나 현미경으로 검경하여 확인하였다.
대상 데이터
- lacustris의 세포벽을 파쇄하여 astaxanthin을 추출하였으며, 이를 이용하여 광범위한 파장에 걸쳐 UV spectrum을 조사하였고, 또한 확인된 파장에서 흡광도와 astaxanthin 농도의 상관관계를 조사하여 생성량을 측정하였다. Astaxanthin standard curve를 그리기 위해 사용된 표준물질은 독일 슈트트가르트 Subitec Gmbh 회사로부터 공급받았다.
- H. lacustris 순수균주를 이용하여 0.1 vvm, 5% CO2 조건에서 250 ml elernmeyer flask에 130 ml working volume으로 전 배양을 실시하였으며, 배양 15일 전후로 성장상태가 우수한 균주를 선발하여 실험에 사용하였다. 균주배양은 25˚C, 3000× g, 10% inoculum, pH 7.
- Table 1과 같다. Haematococus lacustris는 한국산업플랑크톤소재은행으로부터, Isochrysis galbana 균주들은 한국 해양 미세조류은행으로부터 공급받았으며, 이들 미세조류들은 모두 순수 분리되지 않은 단조주(uni-algal strain) 상태로 공급받았다. 또한 H.
- Haematococus lacustris는 한국산업플랑크톤소재은행으로부터, Isochrysis galbana 균주들은 한국 해양 미세조류은행으로부터 공급받았으며, 이들 미세조류들은 모두 순수 분리되지 않은 단조주(uni-algal strain) 상태로 공급받았다. 또한 H. lacustris는 BBM 배지로, I. galbana 균주들은 f/2-Si 배지로 배양하여 실험을 진행하였다.
이론/모형
- 미세조류의 성장속도 생성량 등을 간편하게 정량적으로 측정하기 위해 Melinda 등이 사용한 방법[18]에 따라, UV spec- trophotometer를 이용하여 세포수와 absorbance와의 관계를 알아보았다. Fig.
성능/효과
- Fig. 2에 제시한 바와 같이 680, 750 nm의 파장에서 세포수와 absorbance 간에 강한 선형성이 나타남을 확인하였다. 680, 750 nm에서의 흡광도는 미세조류의 chlorophyll a를 측정하는 파장이며, P.
- 미세조류로부터 유용성분 추출을 위한 무균 순수 분리법을 확립하기 위하여 항생제 혼합물을 이용하였으며, 그 결과 1-3% 혼합항생제의 농도가 미세조류의 치사 효과는 줄이면서 또한 세균오염을 막을 수 있는 최적농도임을 확인하였다. 또한 미세조류의 양을 간편하게 측정하기 위하여 UV spectrum 상의 680, 750 nm의 파장에서 흡광도와 세포의 양을 비교한 결과, 선형성이 나타남을 확인하고 미세조류의 생장량을 평가하였다.
- gal- bana의 무균화에 가장 효과적이라고 보고하였다[6]. 본 연구에서 6종의 미세조류에 대해 혼합 항생제(ampicillin, streptomy- cin, chloramphenicol, penicillin, neomycin, gentamycin, ka- namycin, nystatin)을 처리한 후, 25℃ 광조건에서 120시간 정치배양 한 결과는 Table 3과 같으며, 관찰 결과 모든 미세조류가 순수분리 된 것을 확인할 수 있었다. 즉, 6종의 미세조류 순수분리를 위해 적합한 혼합 항생제의 농도는 H.
- 본 연구에서 6종의 미세조류에 대해 혼합 항생제(ampicillin, streptomy- cin, chloramphenicol, penicillin, neomycin, gentamycin, ka- namycin, nystatin)을 처리한 후, 25℃ 광조건에서 120시간 정치배양 한 결과는 Table 3과 같으며, 관찰 결과 모든 미세조류가 순수분리 된 것을 확인할 수 있었다. 즉, 6종의 미세조류 순수분리를 위해 적합한 혼합 항생제의 농도는 H. lacustris가 1% 이었으며, I. galbanaH-8는 1-3% 이었고, I. galbanaH-7는 1-2% 이었으며, I. galbanaH-2, I. galbana H-9, I. galbana H-10는각각 1% 이었다. 이는 1-3% 혼합 항생제의 농도가 미세조류의 치사 효과는 줄이면서 또한 세균오염을 막을 수 있는 농도임을 의미한다.
후속연구
- 9×10-3 μg/l이었다. 따라서 개발된 무균 순수 분리법을 이용하여 미세조류로부터 양질의 astaxanthin 및 유용성분들을 얻을 수 있을 것으로 사료된다.
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