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문제 정의
- aureus에 대한 항균 활성을 확인한 결과 황련과 오배자가 우수한 결과를 나타내었다. 따라서 본 실험에서는 원핵생물과 진핵생물을 대상으로 항균 활성을 보기 위하여 원핵생물 중에서 Gram(+)인 병원성 식중독 원인균 S. aurerus와 Gram(-)인 E. coli, 그리고 진핵생물 중에서 C. albicans를 대상으로 항균활성을 보고자 하였고, 본 실험의 목적인 비듬의 원인균 M. furfur를 대상으로 항균 활성을 본 후 항균활성이 우수한 황련과 오배자를 선택하여 각각 항균 활성을 시험한 후, 부유세균을 억제하고자 시판되고 있는 (주)태극제약 에어메딕용액(대두추출물에 피톤치드가 혼합됨)과 본 실험에 사용된 천연추출물인 황련, 오배자의 단독추출물과 혼합물에서의 항균활성과 혼합추출물의 시너지 효과를 보고자 본 실험을 진행하였다. 이 실험결과를 토대로 보다 우수한 항균제를 생산하여 다양한 제품에 활용하고자 본 실험을 진행하였다.
- 본 연구는 천연한약재 추출물이 비듬원인균인 M. furfur에항균활성이 있는지를 선행연구결과와 비교하였고, 천연물질의 단일추출물과 단일추출혼합물이 시너지효과를 발휘하여 항균 활성을 증가시키는지를 알아보고자 진행하였다. 먼저 황련, 오배자, 등심초, 지유 4가지가 항균활성이 있다는 연구 결과에 기초하였고, 일반적으로 생약자원의 항균성 물질은 세균에는 효과가 크지만 효모, 곰팡이 등에는 활성이 낮은 것으로 알려져 있는데, 여러 연구 결과 생약자원의 단독 추출물에서는 항균력이 적었더라도 추출혼합물에서는 항균활성이 강하게 나타나, 항균성 물질이 추출된 후 시너지효과를 나타내는 것으로 관찰되고 있다.
- furfur를 대상으로 항균 활성을 본 후 항균활성이 우수한 황련과 오배자를 선택하여 각각 항균 활성을 시험한 후, 부유세균을 억제하고자 시판되고 있는 (주)태극제약 에어메딕용액(대두추출물에 피톤치드가 혼합됨)과 본 실험에 사용된 천연추출물인 황련, 오배자의 단독추출물과 혼합물에서의 항균활성과 혼합추출물의 시너지 효과를 보고자 본 실험을 진행하였다. 이 실험결과를 토대로 보다 우수한 항균제를 생산하여 다양한 제품에 활용하고자 본 실험을 진행하였다.
제안 방법
- C. albicans의 디스크 확산법을 위한 Mueller-Hinton agar glucose methylene blue (MH-GMB) 배지 제조는 Mueller- Hinton broth 21 g, agar 15 g을 증류수 1 l에 녹여 배지를 만들었다. methylene blue 염료 1g을 증류수 20 ml에 녹인 것 100 μl와, glucose 20 g을 배지에 첨가하였다.
- 5 McFarland 탁도(spectrophotometer, 530 nm) 로맞추어 균 농도가 약 1~5×106 CFU/ml 되도록 하였다. 균 액을 소독된 면봉을 이용하여 MH-GMB 배지에 고르게 도말하고 황련, 오배자, 등심초, 지유의 에탄올 추출액과 (주) 태극제약에서 제품으로 판매되는 에어메딕항균기에 사용된 Phyton- cide를 각각 농도의존적으로 제작한 디스크와 fluconazole 디스크를 올렸다. 균을 접종한 배지는 35℃에서 배양하였고, 24 시간, 48시간 후에 균의 성장이 억제된 억제대의 크기를 mm 단위로 측정하였다.
- 균 액을 소독된 면봉을 이용하여 MH-GMB 배지에 고르게 도말하고 황련, 오배자, 등심초, 지유의 에탄올 추출액과 (주) 태극제약에서 제품으로 판매되는 에어메딕항균기에 사용된 Phyton- cide를 각각 농도의존적으로 제작한 디스크와 fluconazole 디스크를 올렸다. 균을 접종한 배지는 35℃에서 배양하였고, 24 시간, 48시간 후에 균의 성장이 억제된 억제대의 크기를 mm 단위로 측정하였다. 대구가톨릭대학교 진단검사의학과에서 분리 동정된 S.
- 균 액을 소독된 면봉을 이용하여 MH-GMB 배지에 고르게 도말하고 황련, 오배자, 등심초, 지유의 에탄올 추출액과 (주) 태극제약에서 제품으로 판매되는 에어메딕항균기에 사용된 Phyton- cide를 각각 농도의존적으로 제작한 디스크와 fluconazole 디스크를 올렸다. 균을 접종한 배지는 35℃에서 배양하였고, 24 시간, 48시간 후에 균의 성장이 억제된 억제대의 크기를 mm 단위로 측정하였다. 대구가톨릭대학교 진단검사의학과에서 분리 동정된 S.
- 균을 접종한 배지는 35℃에서 배양하였고, 24 시간, 48시간 후에 균의 성장이 억제된 억제대의 크기를 mm 단위로 측정하였다. 대구가톨릭대학교 진단검사의학과에서 분리 동정된 S. aureus, E.coli 균주를 BAP agar와 MacConkey agar 평판배지에서 각각 Loop로 배양한 집락을 취하여 0.85% 식염수에 풀어 잘 섞은 후 0.5 McFarland 탁도(spectrophoto- meter, 530nm)로 맞추어 균 농도가 약 1~5×106 CFU/ml 되도록 하였다. 이 균액을 소독된 면봉을 이용하여 MH-GMB 배지에 고르게 도말하고 G(+)균에 대한 항생제는 페니실린 디스크를 올렸고, G(-)균에 대한 디스크는 암피실린 디스크를 올렸다.
- methylene blue 염료 1g을 증류수 20 ml에 녹인 것 100 μl와, glucose 20 g을 배지에 첨가하였다. 만들어진 배지를 고압멸균기로 처리하고(121℃, 15 LB, 15분), 배양 접시에 부어 평판 배지를 만들었다. 만들어진 MH-GMB 배지를 사용 전까지 4℃에 보관하였다.
- 농도의존적으로 실험하였다. 먼저 원핵생물인 병원성 세균 G(+) 균인 S. aureus와 G(-)인 E.coli, 진핵생물인 C. albicans로 항균활성을 실험하여 우수한 결과를 얻은 황련 과오배자를 선택하여 에어메딕 항균기에 사용하고 있는 피톤치드와 비교하여 사전 실험을 진행하였다. 그 결과 황련은 S.
- 본 실험에 사용한 천연물질 중 단일추출물과 추출혼합물을 이용, 원핵생물인 S. aureus와 E. coli, 진핵생물인 C. albicans와 M. furfur는 통계학적 유의성 검증을 위해 각 균주 당 5개의 같은 배지에 각 12가지 물질들의 항균실험(susceptibility test) 을 진행하였다. 실험결과는 SPSS 20.
- albicans.와 M. furfur에 대한 항진균제 디스크는 25 μg 플루코나졸 디스크 (Difco, Oxoid, UK)와 8 mm paper disc (Toyo, Japan)를 사용하여 에탄올 천연추출물을 각각 황련(25 μl/disc), 오배자(25 μl/disc), Phytoncide (25 μl/disc)를 분주하여 사용하였다.
- 5 McFarland 탁도(spectrophoto- meter, 530nm)로 맞추어 균 농도가 약 1~5×106 CFU/ml 되도록 하였다. 이 균액을 소독된 면봉을 이용하여 MH-GMB 배지에 고르게 도말하고 G(+)균에 대한 항생제는 페니실린 디스크를 올렸고, G(-)균에 대한 디스크는 암피실린 디스크를 올렸다. 균을 접종한 배지는 35℃에서 배양하였고, 24시간, 48시간 후에 균의 성장이 억제된 억제대의 크기를 mm단위로 측정하였다.
- 소재)에서 추출하였다. 황련, 오배자, 지유, 등심 초를 각각 1 kg을 3일간 60℃ 배양기에서 3일간 건조하였고, 실온에서 에탄올로 2회 추출하였다. 추출 수율은 등심초 7.
대상 데이터
- coli를 사용하였다. C. albicans, S. aureus, E. coli는 대구광역시 소재 대구가톨릭대학교병원 진단검사의학과에서 분양 받은 임상 분리 균주를 사용하였고 Table 1과 같다. 본 실험에 사용하기 위한 균주는 M.
- coli는 대구광역시 소재 대구가톨릭대학교병원 진단검사의학과에서 분양 받은 임상 분리 균주를 사용하였고 Table 1과 같다. 본 실험에 사용하기 위한 균주는 M. furfur (KCTC 7743)는 한국생명공학연구원의 생물자원센터(Biological Resource Center, KCTC)로 부터 분양 받았다.
- 부유세균증식억제를 위하여 제품으로 판매하고 있는 (주) 태극제약 에어메딕항균기에 사용하고 있는 원료 피톤치드 (Phytoncide)를 농도의존적으로 실험하였다. 먼저 원핵생물인 병원성 세균 G(+) 균인 S.
- 정리하였다. 사용된 천연물질들은 대부분 한방재료로 사용되는 물질로 건조된 상태로 대구소재 한약재료상에서 구입한 국산을 사용하였다. 에탄올 추출 후 분말을 증류수와 DMSO에 녹여서 사용하였다.
- 에탄올 추출 후 분말을 증류수와 DMSO에 녹여서 사용하였다. 피톤치드는 현재 공기청정항균기(에어메딕, 태극제약, KOREA)에 사용하는 항균용액을 사용하였다.
- 항진균력을 보기 위한 예비실험용 대상 균주는 C. albicans, S. aureus, E. coli를 사용하였다. C.
- 황련, 오배자, 지유, 등심초 분말은 한국한방산업진흥원(경북 경산시 소재)에서 추출하였다. 황련, 오배자, 지유, 등심 초를 각각 1 kg을 3일간 60℃ 배양기에서 3일간 건조하였고, 실온에서 에탄올로 2회 추출하였다.
데이터처리
- furfur는 통계학적 유의성 검증을 위해 각 균주 당 5개의 같은 배지에 각 12가지 물질들의 항균실험(susceptibility test) 을 진행하였다. 실험결과는 SPSS 20.0을 이용하여 one-way ANOVA, two-way ANOVA 검정을 수행하였으며, 각 처리군 간의 유의성 검정은 Scheffė의 검정법을 이용하여 p<0.05 수준에서 실시하였다.
이론/모형
- coli를 보기 위한 디스크 확산법은 Kirby-Bauer 방법을 이용하였고, Candida spp.와 M. furfur를 대상으로 한 디스크 확산법은 NCCLS M44-A 법에 따라 시행하였다. C.
- 원핵생물과 진핵생물과의 예비효과를 보기 위하여 Kirby- Bauer Method의거 S. aureus에는 페니실린 10IU/IE/UI (sensi disc, BD BBL, USA)를 사용하였고, E. coli에는 엠피실린 10㎍ (sensi disc, BD BBL, USA)를 사용하였다. C.
성능/효과
- aureus)에 대해 항균활성을 조사한 결과는 Table 3과 같다. 4가지 식물 중에서 황련, 오배자가 에탄올추출물에서 가장 우수한 항균성을 나타내었다.
- 05). Prokaryote인 S. aureus와 E. coli는 단일추출물(14.35 mm), 추출혼합물(12.84 mm), Kirby- bauer 법에서 제시한 대조로 사용한 G(+) 대조용 페니실린(21.4 mm), G(-) 대조용 엠피실린(20.00 mm)로 단일추출물과 추출혼합물과의 효과는 비슷하였으며 대조군에 비에 천연추출물의 효과는 낮았지만 통계학적 유의한 것으로 나타났다 (p<0.05). 본 실험에서 보고자 하였던 M.
- albicans로 항균활성을 실험하여 우수한 결과를 얻은 황련 과오배자를 선택하여 에어메딕 항균기에 사용하고 있는 피톤치드와 비교하여 사전 실험을 진행하였다. 그 결과 황련은 S. aureus와 C. ablicans에만 항균활성이 있었고, 오배자는 S. aur- eus와 E. coli에만 항균활성이 있었다. 피톤치드에서는 S.
- 위와 같은 결과는 천연물질에 따라서 항균활성 물질이 다르고, 균주에 따라 항균활성도 다르다는 것을 알 수 있었다. 다른 연구자들의 결과, 황련과 감초의 경우 추출혼합물에서 우수한 항균활성을 보인 결과도 있었지만, 본 연구에서는 황련과 오배자, 피톤치드의 단일추출물 보다 추출혼합물에서 반드시 항균활성이 더 우수한 것은 아니다는 결론을 얻었다. 또한 같은 진균인 C.
- 3과 같다. 단일추출물 중황련(22.00 mm)과 오배자(20.00 mm) 피톤치드(Phytoncide 20 %, 18.00 mm), (Phytoncide 50%, 19.40 mm)로 항균활성이 높은 것으로 나타났다. 혼합물에서는 황련과 오배자(10.
- 단일추출물과 추출혼합물이 각 균주에 미치는 효과를 검증해본 결과 eukaryote인 C. albicans와 M. furfur는 단일추출물 평균(10.20 mm), 추출혼합물(8.69 mm), 대조로 사용한 Fluco- nazole (27.65 mm)로 단일추출물과 추출혼합물과의 효과는 거의 비슷하였으며 대조군인 Fluconazole에 비해 천연추출물의 효과는 내성이 있는 것으로 나타났으나 통계학적 유의성은 있는 것으로 나타났다(p<0.05). Prokaryote인 S.
- 4과 같다. 단일추출물에서는 황련(0.00 mm)은 항균활성이 나타나지 않았으며, 피톤치드(Phytoncide 20%, 7.40 mm), (Phy- toncide 50%, 8.40 mm)으로 낮게 나타났으며, 오배자(19.40 mm)는 항균활성이 높은 것으로 나타났다. 황련과 오배자 (17.
- albicans는 천연물질 황련이 NCCLS M44-A에서 제시한 대조약물인 Fluconazole 과 비교하였을 때 농도의존적 감수성(≥19 mm)이 있는 것으로 나타나 항균활성이 있는 것으로 판독하였다. 대조로 사용된 항진균제는 NCCLS M44-A법에서 제시한 C. albicans 균에 대한 항진균제로 사용한 Fluconazole (39.00 mm)의 항균력 비교에서 황련, 황련과 피톤치드20%, 황련과 피톤치드 50%는 감수성이 있는 것으로 나타났으며 황련과 오배자, 단일추출물인 피톤치드 50%는 농도에 따라 농도의존적으로 감수성이 있었으며 단일추출물과 오배자가 혼합된 물질에서는 내성이 있다는 것을 알 수 있었다.
- 00 mm) 로항균활성이 나타나지 않았다. 따라서 C. albicans는 천연물질 황련이 NCCLS M44-A에서 제시한 대조약물인 Fluconazole 과 비교하였을 때 농도의존적 감수성(≥19 mm)이 있는 것으로 나타나 항균활성이 있는 것으로 판독하였다. 대조로 사용된 항진균제는 NCCLS M44-A법에서 제시한 C.
- coli에 대한 피톤치드(피톤치드 20%, 피톤치드 50%)용액에서는 농도 의존적으로는 유의한 항균 활성의 차이는 없었다. 따라서 E. coli에는 오배자 단일추출물과 오배자가 혼합된 추출물질에서 항균 활성이 높게 나타났으며 대조로 사용된 항생물질은 Kirby-Bauer 법에서 제시한 그람 음성균에 대한 항생제로 사용한 엠피실린의 항균력(20.00 mm)과의 비교에서 황련(0 mm), 황련과 피톤치드 20%, 황련과 피톤치드50%에서 내성이 있었고 오배자 단일추출물과 오배자가 혼합된 추출물질에서 대조군으로 사용된 엠피실린과의 항균활성 비교에서는 감수성이 있었다.
- 00 mm)로 항균활성이 나타나지 않았다. 따라서 M. furfur의항균활성을 보기 위해 대조로 사용된 항진균제는 NCCLS M44-A법에서 제시한 Fluconazole의 항균력(33.20 mm) 과의비교에서 황련과 피톤치드 50%에서 내성이 있었으며, 이를 제외한 나머지 단일추출물 및 추출혼합물 모두에서 M. furfur 에 대한 항균활성은 나타나지 않았다. 단일 에탄올 추출물인 황련, 오배자와 (주)태극제약 에어메딕 용액인 피톤치드 20%, 피톤치드 50%와의 혼합물의 항균활성의 확산결과는 Table 4 (Fig.
- 40 mm)에서는 항균 활성이 낮았다. 따라서 황색포도알구균(S. aureus)에 대하여 4종의 단일추출물과 추출혼합물의 항균활성이 우수하였으며 대조로 사용된 항생물질 Kirby-Bauer법에서 제시한 그람양성균에 대한 항생제로 사용한 페니실린의 항균력(21.40 mm) 과의비교에서도 황련과 오배자와 피톤치드 추출물20%(9.40 mm), 황련과 오배자와 피톤치드 추출물50%(3.40 mm)은 페니실린에 비해 항균활성이 낮았으나 이를 제외한 물질에는 우수한 항균 활성을 보였고, 페니실린과 같은 우수한 결과를 얻을 수 있었다. 이 결과 단일추출물과 2가지 추출물의 혼합물은 비슷한 항균활성을 보였으나 3가지 혼합물에서는 상승효과를 기대하였지만, 오히려 항균활성이 저하된 결과를 보였다.
- 다른 연구자들의 결과, 황련과 감초의 경우 추출혼합물에서 우수한 항균활성을 보인 결과도 있었지만, 본 연구에서는 황련과 오배자, 피톤치드의 단일추출물 보다 추출혼합물에서 반드시 항균활성이 더 우수한 것은 아니다는 결론을 얻었다. 또한 같은 진균인 C. albicans와 M. furfur와 비교하여 볼 때 항균 활성에 현저한 차이가 있었다. 그 이유는 M.
- furfur에항균활성이 있는지를 선행연구결과와 비교하였고, 천연물질의 단일추출물과 단일추출혼합물이 시너지효과를 발휘하여 항균 활성을 증가시키는지를 알아보고자 진행하였다. 먼저 황련, 오배자, 등심초, 지유 4가지가 항균활성이 있다는 연구 결과에 기초하였고, 일반적으로 생약자원의 항균성 물질은 세균에는 효과가 크지만 효모, 곰팡이 등에는 활성이 낮은 것으로 알려져 있는데, 여러 연구 결과 생약자원의 단독 추출물에서는 항균력이 적었더라도 추출혼합물에서는 항균활성이 강하게 나타나, 항균성 물질이 추출된 후 시너지효과를 나타내는 것으로 관찰되고 있다. 관중, 단삼, 가자, 황금에 개미취, 계피 등을 혼합하여 항균활성을 조사한 결과 B.
- 05). 본 실험에서 보고자 하였던 M. furfur는 같은 eukar- yote인 C. albicans와의 비교에서 C. albicans (12.32 mm), M. furfur (2.78 mm)로 C. albicans가 M. furfur에 비해 천연추출물의 항균활성 효과가 있으며 M. furfur에는 효과가 미약하게 나타났으나 통계학적 유의성은 있는 것으로 나타났다(p<0.05).
- 20 mm의 직경으로 미약한 항균 활성을 보였다. 위와 같은 결과는 천연물질에 따라서 항균활성 물질이 다르고, 균주에 따라 항균활성도 다르다는 것을 알 수 있었다. 다른 연구자들의 결과, 황련과 감초의 경우 추출혼합물에서 우수한 항균활성을 보인 결과도 있었지만, 본 연구에서는 황련과 오배자, 피톤치드의 단일추출물 보다 추출혼합물에서 반드시 항균활성이 더 우수한 것은 아니다는 결론을 얻었다.
- 40 mm)은 페니실린에 비해 항균활성이 낮았으나 이를 제외한 물질에는 우수한 항균 활성을 보였고, 페니실린과 같은 우수한 결과를 얻을 수 있었다. 이 결과 단일추출물과 2가지 추출물의 혼합물은 비슷한 항균활성을 보였으나 3가지 혼합물에서는 상승효과를 기대하였지만, 오히려 항균활성이 저하된 결과를 보였다.
- 따라서 더 경제적인 항진균제의 개발이 절실히 필요하다. 지금까지 보고 되어온 천연물질 중 강한 항균활성을 보이는 황련과 오배자, 지유, 등심초를 선택하여 예비실험에서 S. aureus에 대한 항균 활성을 확인한 결과 황련과 오배자가 우수한 결과를 나타내었다. 따라서 본 실험에서는 원핵생물과 진핵생물을 대상으로 항균 활성을 보기 위하여 원핵생물 중에서 Gram(+)인 병원성 식중독 원인균 S.
- 황련, 오배자, 지유, 등심 초를 각각 1 kg을 3일간 60℃ 배양기에서 3일간 건조하였고, 실온에서 에탄올로 2회 추출하였다. 추출 수율은 등심초 7.2%, 오배자 62.8%, 지유 27.2%, 황련 21.5%였다. 나머지 잔여물을 필터로 분리하였다(Toyo filter paper No.
- coli는 농도 의존적으로 감수성이 있는 것으로 나타났다. 추출혼합물에서 S. aureus는 3가지 혼합한 천연물질에서 항균활성이 내성이 있었으며 E. coli는 황련과의 혼합물에서 내성이 있었고 C. albicans는 오배자와 혼합물에서 내성이 있는 것으로 나타나 각 균주에 따라 항균 활성이 다른 것으로 나타났다. 반면 M.
- coli에만 항균활성이 있었다. 피톤치드에서는 S. aur- eus에 감수성이 있었고, C. albicans와 E. coli는 농도 의존적으로 감수성이 있는 것으로 나타났다. 추출혼합물에서 S.
- 00mm)에서는 항균 활성이 나타나지 않았다. 혼합물에서 황련과 오배자(15.40 mm), 황련과 피톤치드20%(19.00 mm), 황련과 피톤치드50%(20.80 mm) 으로 항균활성이 높았으며 오배자와 피톤치드20%(0.00 mm), 오배자와 피톤치드50%(0.00 mm), 황련과 오배자와 피톤치드 20%(5.20 mm), 황련과 오배자와 피톤치드 50%(0.00 mm) 로항균활성이 나타나지 않았다. 따라서 C.
- 40 mm)로 항균활성이 높은 것으로 나타났다. 혼합물에서는 황련과 오배자(10.40 mm), 황련과 피톤치드20%(19.80 mm), 오배자와 피톤치드 농도 20%(16.20 mm), 황련과 피톤치드50%(25.40 mm), 오배자와 피톤치드 농도50%(18.40 mm)추출혼합물에서 우수한 효과를 보였고, 황련과 오배자와 피톤치드 추출물20%(9.40 mm), 황련과 오배자와 피톤치드 추출물50%(3.40 mm)에서는 항균 활성이 낮았다. 따라서 황색포도알구균(S.
- 40 mm)는 항균활성이 높은 것으로 나타났다. 황련과 오배자 (17.00 mm), 오배자와 피톤치드20%(16.00 mm), 오배자와 피톤치드 50%(16.40 mm), 황련 오배자 피톤치드20%(15.00 mm), 황련 오배자 피톤치드50%(12.40 mm)으로 항균활성이 높았으며 황련과 피톤치드20%(0.00 mm), 황련과 피톤치드50%(0.00 mm)에서는 항균활성이 나타나지 않았다. E.
후속연구
- albicans에 비하여 세포벽이 지방친화성 성분을 지니고 있고 라멜라 층, 원형질내막, 중간 다층구조로 되어있기 때문이라고 사료된다[10]. 추후 비듬을 예방하기 위하여 천연물 추출의 연구가 지속되어야 하며 M. furfur균에 기존 사용하던 azole 계열이 포함된 천연추출물을 더욱 연구할 필요가 있다고 생각된다.
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