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문제 정의
- 높은 분자량의 셀레늄 화학종들 특히 셀레노 단백질들은 생체에서 셀레늄의 일반적인 농도를 알려주는 지표가 될 수 있으며 질병의 예방지표와 직접관련이 있는 항산화 물질의 농도를 모니터링할 수 있게 된다. 따라서 본 연구에서는 HPLC (High Performance Liquid Chromatography)-ICP/MS (Inductively Coupled Plasma/ Mass Spectrometry)를 사용하여 셀레노아미노산이나 셀레노 단백질 (GPx와 SelP)을 분리하고 동위원소 희석법으로 정확하게 정량분석할 수 있는 분석적 기 술을 개발하고 가축에 적용하여 사료와 생체내의 화학종들의 변화를 알아낼 수 있는 의미 있는 연구를 진행하였다.
- 본 연구에서는 가축의 혈청에서 여러 셀레늄 화학 종들(유 • 무기 셀레늄 및 셀레노 단백질)을 HPLCICP/MS를 사용하여 분석할 수 있는 기술을 개발하였다. 셀레늄이 강화된 사료를 모돈에 4 주간 먹였을 때 셀레노 단백질들이나 셀레늄 화학종들이 더 생성되고 농도는 각 47%와 33%가 더 증가됨을 알아낼 수 있었다.
- 무엇보다 셀레늄을 섭취할 때에 생체 내에는 어떠한 화학종이 얼마나 직접적으로 영향을 받는지에 대한 연구들이 필요하다. 본 연구에서는 셀레늄 강화사료를 먹었을 때에 사료와 가축의 혈청에서의 여러 셀레늄 화학종들 즉, 무기 셀레늄이나 셀레노아미노산(Selenocystein, Selenomethinine등) 또는 셀레노 단백질(GPx, SelenoAlbumin; SeAlb, selenoprotein; SelP)과의 관계를 알아내는 연구를 시도하였다.
제안 방법
- 각 시료는 고체상 추출을 사용하여 Br을 제거한 후에 HPLC-ICP/MS를 사용하여 분석하였다. 정량에 는 78Se 동위원소를 spike로 사용하여 온라인 방식인 후컬럼 동위원소 희석법을 적용하였다.
- 공시 동물은 분만직 전 Duroc종 모돈 20 두(처리 군당 5 두)를 대상으로 하였다. 대상모돈을 4 그룹으로 무작 위로 나눈 뒤 각 그룹별로 다른 형태의 유무기형태의 셀레늄을 배합후 급여 하였다. 다음 Table 1에 실험군 들의 분류에 대한 정보를 요약하여 나타내었다.
- 돈 혈청에서의 셀레노 아미노산의 분리 및 정량방법은 기존의 선행연구4를 기반으로 하여 최적의 조건을 찾았다. 돈혈청은 먼저 효소를 이용하여 가수분해 시킨 뒤에 작은 분자량의 셀레늄 화학종들을 분석하였다. 역상(RP) 및 음이온 교환(AE) 크로마토 그라피 를 모두 사용한 뒤에 더 효율적인 음이온 교환 컬럼 을 사용하여 셀레늄 화학종들을 분리하고 정량하였다
- 이때 충돌셀 기체인 수소는 시료 중의 Br과 반응 후 BrH+를 형성해 80Se, 82Se 에 간섭을 일으킨다. 따라서 셀레늄 화학종의 정확한 정량을 위해 시료 중 Br을 제거할 필요성이 있으며 연구에서는 SPE cartridge (Bond elut-SAX, 500 mg, 3 mL, Agilent, Lake forest, USA)를 이용한 고체상 추출법으로 시료 중 Br을 제거해 주었다. Fig.
- 무기 및 셀레노 아미노산의 분리분석은 주로 음이온 교환 (Anion Exchange; AE)컬럼을 사용하였고 셀레노 단백 질은 HEP 컬럼만을 사용하여 SelP를 분리하고 나머지 셀레노 단백질인 GPx와 SeAlb을 함께 분리하여 분석하였다. 먼저 binding buffer로 안정화시킨 다음, 시료를 주입한 뒤, GPx + SeAlb을 검출하였다. 다시 elution bufr를 흘려주면 HEP 속의 SelP가 용리되어 나온다.
- 레노 아미노산의 분리 및 정량이나 셀레노 단백 질의 정량은 기본적으로는 선행연구의 결과4,5를 이용 하였으나 시료에 맞게 일부 새롭게 변형하였다. 무기 및 셀레노 아미노산의 분리분석은 주로 음이온 교환 (Anion Exchange; AE)컬럼을 사용하였고 셀레노 단백 질은 HEP 컬럼만을 사용하여 SelP를 분리하고 나머지 셀레노 단백질인 GPx와 SeAlb을 함께 분리하여 분석하였다. 먼저 binding buffer로 안정화시킨 다음, 시료를 주입한 뒤, GPx + SeAlb을 검출하였다.
- 다음 Table 1에 실험군 들의 분류에 대한 정보를 요약하여 나타내었다. 셀레 늄급원은 유기 셀 레 늄급원은 셀 레 늄강화효모(Sel-Plex) 를 사용하여(제조 및 판매사: Alltech Biotechnology Corp. Inc., Nicholasville, KY, USA) 셀레늄함량기준으로 사료 1 kg 중 0.3 또는 0.6 mg (0.3 ㎎/㎏ 및 0.6 ㎎/㎏)이 함유하도록 배합하였다. 무기셀레늄급원은 sodium selenite (Na2SeO3)를 사용하였고 셀레늄함량기준으로 사료 1 kg 중 0.
- HPLC pump는 L-6200A Intelligent pump (Hitachi, Tokyo, Japan)를 사용하였다. 셀레노 단백질 화학종을 분 리하기 위한 컬럼은 친화 컬럼 (HEP; Heparin Sepharose) 을 사용하였고 셀레노아미노산의 분리를 위하여서는 역상 컬럼 (Synchronis 300-10 C8, 250 * 4.6 mm) 및 음이온 교환컬럼 (PRP X-100)을 사용하였으며 후 컬럼동위원소 희석법에서 78Se 동위원소용액의 주입을 위해 연동펌프 Minipuls 3(Gilson, Bad Camber, Germany)을 사용하였다. HPLC와 ICP/MS의 연결은 비교적 간단 하며 직접 연결할 수 있다.
- 다시 elution bufr를 흘려주면 HEP 속의 SelP가 용리되어 나온다. 셀레노 아미노산의 분석은 효소를 이용하여 단백질을 가수분해한 뒤에 HPLC-ICP/MS로 연구하였다
- 돈혈청은 먼저 효소를 이용하여 가수분해 시킨 뒤에 작은 분자량의 셀레늄 화학종들을 분석하였다. 역상(RP) 및 음이온 교환(AE) 크로마토 그라피 를 모두 사용한 뒤에 더 효율적인 음이온 교환 컬럼 을 사용하여 셀레늄 화학종들을 분리하고 정량하였다
대상 데이터
- 공시 동물은 분만직 전 Duroc종 모돈 20 두(처리 군당 5 두)를 대상으로 하였다. 대상모돈을 4 그룹으로 무작 위로 나눈 뒤 각 그룹별로 다른 형태의 유무기형태의 셀레늄을 배합후 급여 하였다.
- 6 ㎎/㎏)이 함유하도록 배합하였다. 무기셀레늄급원은 sodium selenite (Na2SeO3)를 사용하였고 셀레늄함량기준으로 사료 1 kg 중 0.6 mg(0.6 ㎎/㎏)을 함유하도록 배합하였다.
- 사용된 ICP/MS는 팔중극자 반응셀이 장착된 7500ce Model (Agilent, Lake forest, USA)을 사용하였다. HPLC pump는 L-6200A Intelligent pump (Hitachi, Tokyo, Japan)를 사용하였다.
- 시료 제조에 사용된 질산은 동우화인켐사에서 구입한 반도체급 시약 을 사용하였다. 셀레늄 화학종들은 Sigma-Aldrich (Saint Luis, MO, USA)에서 구입한 sodium selenite (Se4+, 99%) sodium selenate decahydrate (Se6+, 99.999%), seleno-DL-methionine (SeMet), L-Selenocysteine (SeCys), se-(Methyl)selenocysteine hydrochloride (MeSeCys, 95%) 을 탈 이온수에 묽혀 사용하였다. 시료 중 셀레늄을 추줄하기 위해서 사용된 효소는 streptomyces griseus type XIV이며 Lipase는 pancreas type II이고 완충용액 은 Sigma-Aldrich에서 구입하였다.
- 실험에 사용한 모든 용기와 기구는 산세척 후 탈 이온수로 세척하고 건조하여 사용하였다. 시료 제조에 사용된 질산은 동우화인켐사에서 구입한 반도체급 시약 을 사용하였다. 셀레늄 화학종들은 Sigma-Aldrich (Saint Luis, MO, USA)에서 구입한 sodium selenite (Se4+, 99%) sodium selenate decahydrate (Se6+, 99.
- 999%), seleno-DL-methionine (SeMet), L-Selenocysteine (SeCys), se-(Methyl)selenocysteine hydrochloride (MeSeCys, 95%) 을 탈 이온수에 묽혀 사용하였다. 시료 중 셀레늄을 추줄하기 위해서 사용된 효소는 streptomyces griseus type XIV이며 Lipase는 pancreas type II이고 완충용액 은 Sigma-Aldrich에서 구입하였다. 셀레노 단백질 분리에서는 binding buffer(A) 0.
- 시험사료는 시판되는 포유돈사료(부경 양돈협동조합 배합사료공장, 경남 김해소재)에 셀레늄급원을 화학형 태 및 수준별로 첨가하여 배합하였다. 혈액채취는 4 주간 사료급여후 모돈 경정맥을 통해 채혈 후, 원심 분리 (3,000 xg, 15 분, 4 oC)하여 혈청 (상등액)을 분석 시까지 -70 oC 냉동고에 보관하였다.
이론/모형
- 각 시료는 고체상 추출을 사용하여 Br을 제거한 후에 HPLC-ICP/MS를 사용하여 분석하였다. 정량에 는 78Se 동위원소를 spike로 사용하여 온라인 방식인 후컬럼 동위원소 희석법을 적용하였다.
- 단순한 정성분석이나, 정량에서 검정곡선법을 사용 하려면 구태 여 m/z 80을 사용하지 않고 m/z 78을 사용하여도 무방하겠다. 하지만 본 연구에서는 제일 정확한정량법인 동위원소 희석법을 사용하고 있다. 즉, m/z 80을 기준으로 삼고 m/z 78의 동위원소에 대하여 표준동위원소를 첨가하게 되므로 m/z 80을 반드시 모니터링하여야 한다.
- 03 mL를 넣은 후 처리하였다. 효소처리와 나머지 과정은 기존의 연구에 따라 사용하였다.
성능/효과
- 지금까지 셀레늄에 대한 연구는 원소분석에서부터 시작하여 셀레늄을 포함한 아미노산과 단백질의 연구에까지 이르기까지 매우 폭넓게 진행되고 있다.9-16 현재까지의 연구를 종합해 보면 생체에서 셀레늄을 적정수준으로 유지하는 것이 필요하고 부족하면 건강에 지장이 있으며 저항력이 떨어지는 것을 알게 되었다. 따라서 인체나 가축의 건강을 위하여 식품으로부터 충분한 셀레늄을 섭취하 여야 하며 필요하면 셀레늄 강화제를 통하여 적절한 수준을 유지하는 것이 요구된다.
- 권오 석의 연구24에서는 셀레늄강화 이스트를 5 주간 비육돈 에 급여한 뒤에 여러 조직에서의 셀레늄의 함량과 혈청 내에서의 글루타티온 과산화효소인 GPx (Glutathione Peroxidase)의 활성을 조사하였다. 결과는 대조군에 비하여 일부 조직(신장, 간)에서 더 높은 함량을 보였고, GPx의 활성도는 약간 차이가 있었지만 통계적으로 현저하지는 않았다. 이 연구에서도 GPx의 활성도는 알아내었지만 다른 셀레늄이 포함된 단백질인 셀레노 단백질에 대하여서는 알 수가 없었다.
- 즉, 셀레늄의 총량을 분석할 뿐, 어떤 형태로 얼마씩 변화하는지에 대한 연구는 진행되지 못하였다. 결론적으로 셀레늄 강화 사료섭취와 GPx의 상관관계에 대한 연구, 또는 알부민에 대한 연구들은 있지만 이들이 과연 셀레노 단백질인지 아니면 단순한 단백질인지에 대한 정보는 얻을 수 없었다. 무엇보다 셀레늄을 섭취할 때에 생체 내에는 어떠한 화학종이 얼마나 직접적으로 영향을 받는지에 대한 연구들이 필요하다.
- 6 μg/kg)을 보여주고 있다. 또한 t-test를 적용하여 보면 99% 이상의 신뢰수준으로 실험군이 다르며 실험군간의 차이는 보이지 않았다. 이러한 연구의 결과는 기존의 연구23와 유사한 결과를 보여준다.
- 또한 자돈에 대하여서도 셀레노 단백질을 일차적으 로 분석해 본 결과, 모돈과 자돈과의 관계에 있어서는 큰 연관성이 나타나지 않았다. 즉 모돈의 포유를 통한 셀레늄의 섭취량에서 그룹간 차이가 크지 않으며 그 이유는 모유에서 셀레늄의 농도가 별 차이가 없는 것인지 아니면 포유자돈의 특성인지 확실하지 않으며 이 연구는 차후에 밝혀져야 할 것이다.
- 본 연구에서는 가축의 혈청에서 여러 셀레늄 화학 종들(유 • 무기 셀레늄 및 셀레노 단백질)을 HPLCICP/MS를 사용하여 분석할 수 있는 기술을 개발하였다. 셀레늄이 강화된 사료를 모돈에 4 주간 먹였을 때 셀레노 단백질들이나 셀레늄 화학종들이 더 생성되고 농도는 각 47%와 33%가 더 증가됨을 알아낼 수 있었다. 셀레노 아미노산의 경우에는 유기셀레늄 강화사료 가 더 효과적이었고 셀레노 단백질의 경우에는 두 형태의 사료 모두 효과적이었다.
- 실험군 특히 유기셀레늄 강화사료를 먹인 그룹에 대하여서 셀레늄 화학종들의 증가가 뚜렷하지만 사료 의 형태에 따라 어떤 화학종이 더 많이 분포되는지에 대한 부분은 확실하지 않으며 큰 상관관계가 보이지 않았다.
- 전반적으로 볼 때에 본 연구에서 조사된 돈혈청의 수는 각 그룹당 5으로서 아직 온전한 결론을 내리기 에는 좀 부족하다고 할 수 있지만 최소한 대조군과 강화사료를 먹인 그룹에서 셀레노 단백질농도의 차이는 잘 나타내 보이고 있다. 무기강화사료 또는 유기강 화사료와의 차이는 셀레노 단백질에서는 보이지 않는 다.
- 6 ㎎/㎏ 그룹 에 비하여 좋은 결과를 보여주고 있다. 통계학적으로 t-test를 적용해 본 결과, 95%의 신뢰수준에서 실험군 (그룹 I과 그룹 II)과 통제군은 서로 다른 것으로 나타났다. 무기셀레늄 강화사료를 먹인 그룹 Ⅲe 총량이 나 각 화학종 모두 대조군에 비해서 별로 증가하지 않았다.
후속연구
- 이러한 연구와 정보는 결국 셀레늄과 가축의 질병및 성장에 관련되는 직접적인 정보를 얻을 수 있는 좋은 기초연구가 될 것으로 생각된다. 본 연구에서는 HEP 컬럼을 사용하여 SelP만을 분리하여 조사하였지 만 다음에는 BLUE 컬럼을 사용하여 GPx와 SeAlb을 분리하면 좀 더 세밀한 결과를 얻을 수 있을 것으로 생각하며 다음 연구에서 시행되어야 할 것이다.
- 셀레노 단백질의 경우에는 유 • 무기 형태의 셀레늄 강화사료 모두 효과 적이었고 특히 SelP가 상대적으로 더 증가함을 알아 내었다. 이러한 연구와 정보는 결국 셀레늄과 가축의 질병및 성장에 관련되는 직접적인 정보를 얻을 수 있는 좋은 기초연구가 될 것으로 생각된다. 본 연구에서는 HEP 컬럼을 사용하여 SelP만을 분리하여 조사하였지 만 다음에는 BLUE 컬럼을 사용하여 GPx와 SeAlb을 분리하면 좀 더 세밀한 결과를 얻을 수 있을 것으로 생각하며 다음 연구에서 시행되어야 할 것이다.
- 또한 자돈에 대하여서도 셀레노 단백질을 일차적으 로 분석해 본 결과, 모돈과 자돈과의 관계에 있어서는 큰 연관성이 나타나지 않았다. 즉 모돈의 포유를 통한 셀레늄의 섭취량에서 그룹간 차이가 크지 않으며 그 이유는 모유에서 셀레늄의 농도가 별 차이가 없는 것인지 아니면 포유자돈의 특성인지 확실하지 않으며 이 연구는 차후에 밝혀져야 할 것이다.
- SeAlbe 단백질의 일반적인 지표이 지만 SelP는 그렇지 않으며 Meyer26는 독일의 전립선 암환자와 신장암의 경우에 SelP의 농도가 비정상적으 로 낮음을 보고하였다. 즉, SelP는 어떤 특정한 메커 니즘에 따라 심한 차이를 보이며 차후에 더욱 깊은 연구를 진행할 필요가 있는 것으로 보인다
- 이러한 연구의 결과는 기존의 연구23와 유사한 결과를 보여준다. 하지만, 앞의 연구에서는 총 셀레늄의 량만 조사되었으나 본 연구에서는 셀레노 단백질량과 각 단백질의 량까지 세부적으로 연구가 가능하였다. GPx+SeAlb 및 SelP 모두 대조군보다 셀 레늄강화사료를 먹인 그룹에서의 농도가 더 높다.
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