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문제 정의
- 따라서 본 연구는 우울증 유발 동물 모델에서 포공영 추출물의 항우울 효과를 조사하였다. 본 연구에서 강제 수영 실험, 꼬리 매달기 실험, 과잉 행동 관찰 실험에 의한 포공영 추출물의 우울증 예방 및 치료 효과를 관찰하였으며, 뇌 조직에서의 BDNF, ERK, CREB 단백질의 발현 변화를 측저아여 매우 유의하고 의미 있는 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
- 항우울 효과를 조사하였다. 본 연구에서 강제 수영 실험, 꼬리 매달기 실험, 과잉 행동 관찰 실험에 의한 포공영 추출물의 우울증 예방 및 치료 효과를 관찰하였으며, 뇌 조직에서의 BDNF, ERK, CREB 단백질의 발현 변화를 측저아여 매우 유의하고 의미 있는 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
- 본 연구에서는 포공영 추출물의 항우울 효과를 확인하기 위해 마우스에서 사람의 우울증 행동양상과 가장 비슷한 FST 와 TST를 실시하였다22).
제안 방법
- 동물의 관리 및 처치는 대구한의대학교의 동물실험윤리위원회 지침에 따라 수행하였다. 실험 당일 포공영 추출물(25, 50 및 100 mg/kg)은 실험 1시간 전 경구 투여하였으며, 대조약물로써 항우울제인 fluoxetine(15 mg/kg) 을 실험 30분 전 복강 투여하였다.
- 절망행동검사 중 하나이다. 이를 위해 윗면이 개방된 지름 10 cm, 높이 25 cm 투명한 원통 모양의 아크릴 원통에 20 cm의 높이로 수온 23±2 ℃의 물을 채운 뒤 총 6분간 강제로 수영을 시키며 촬영하였다. 처음 2분을 제외한 모든 시간 동안 동물이 발버둥치지 않고 물 위에 떠 있는 시간 인부동시간을 행동분석장치인 ethovision system(Noldus, Wageningen, Netherlands)을 이용하여 측정하였다.
- 이를 위해 윗면이 개방된 지름 10 cm, 높이 25 cm 투명한 원통 모양의 아크릴 원통에 20 cm의 높이로 수온 23±2 ℃의 물을 채운 뒤 총 6분간 강제로 수영을 시키며 촬영하였다. 처음 2분을 제외한 모든 시간 동안 동물이 발버둥치지 않고 물 위에 떠 있는 시간 인부동시간을 행동분석장치인 ethovision system(Noldus, Wageningen, Netherlands)을 이용하여 측정하였다.
- 꼬리 매달기 실험(Tail suspension test, TST)은 절망행동검사의 하나로 검은색 상자(30×30×50 cm)에 실험동물의 꼬리 끝 부분으로부터 약 1 cm 떨어진 부위에 테이프를 이용하여 거꾸로 매달고, 6분간 부동시간을 ethovision system을 이용하여 측정하였다.
- 실험동물을 검은색의 상자(25×25×30 cm) 가운데 조심히 넣고 20분간 자유롭게 움직이게 한 후 총 보행 거리를 ethovision system을 이용하여 측정하였다.
- 1% tween 20)를 이용하여 3회 세척하고 2차 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 분리된 단백질 관찰은 LAS 4000 mini system(GE Healthcare, VA, USA)을 이용하여 촬영하였다.
- 포공영추출물의 항우울 작용이 단순한 활동성의 증가로 인하여 생기는 지 확인하기 위하여 OFT를 실시하였다. 대조군 및 포공영추출물을 25, 50 및 100 mg/kg 투여한 군에서의 총 이동거리를 5분 간격으로 총 20분 동안 측정한 결과, 모든 군에서 자발적 활동성의 통계적 차이가 나타나지 않았다(Table 1).
대상 데이터
- 실험동물은 4주령의 웅성 ICR mice (23-25 g)를 대한 바이오링크 (주)(충북, 한국)사에서 공급받은 후 clean cage에 약 7일간 적응시켜 사용하였으며, 명암주기는 12 시간씩 자동적으로 조절되는 환경에서 부드러운 깔짚이 깔린 상자에 5 마리씩 사육하였다. 사육실의 온도는 23±2 ℃로 유지되었고, 습도는 55±10 %로 하였으며, 먹이와 물을 자유롭게 섭취하도록 하였다.
- 본 실험에 사용된 포공영은 휴먼허브(경북, 한국)에서 구매하였고, 약재의 10 배의 증류수를 가하여 80℃에서 2시간 열수 추출하였다. 이를 환류 냉각장치(rotary evaporator)로 감압 농축하여 얻은 점조상의 추출물을 동결건조(Eyela, model FDU-2000, Tokyo, Japan)하여 실험에 사용하였다(수득율: 15.
- 추출하였다. 이를 환류 냉각장치(rotary evaporator)로 감압 농축하여 얻은 점조상의 추출물을 동결건조(Eyela, model FDU-2000, Tokyo, Japan)하여 실험에 사용하였다(수득율: 15.2%). Fluoxetine은 시그마 알드리치사(St.
- 2%). Fluoxetine은 시그마 알드리치사(St. Louis, Mo, USA)에서 구입하여 사용하였다.
데이터처리
- 모든 실험 결과는 평균과 표준오차(S.E.M)로 표시하였고, 각 실험군 간의 통계학적 분석은 일원변량분석(one way-ANOVA) 을 사용하여 유의성을 증명하였으며, 사후 검증은 Student- Newman-Keuls test를 통해 검증하였다. 실험의 통계적 유의성은 p값이 0.
이론/모형
- 항우울 작용과 관련 있는 대표적 신호전달경로인 BDNF/ ERK/CREB 단백질의 발현 변화를 비교하기 위해 Western blot을 실시하였다. 그 결과 해마부위에서 BDNF와 pERK, pCREB의 발현은 포공영 추출물 100 mg/kg을 투여한 군에서 정상군에 비해 유의적으로 증가되는 것을 알 수 있었다 (Fig.
성능/효과
- 포공영추출물의 항우울 효과를 확인하기 위해 FST를 수행한 결과, 정상군의 부동시간은 204.1±3.7초로 측정되었으며, 포공영 추출물을 25, 50 및 100 mg/kg 용량으로 투여한 군에서는 각각 215.5±2.3초, 186.1±8.5초, 183.8± 6.3초로 측정되어 포공영추출물 50과 100 mg/kg 투여군에서 정상군에 비해 유의적인 부동시간 감소를 나타내었다. 한편 양성대조군으로 사용한 fluoxetine 투여군에서도 FST가 132.
- 포공영추출물의 항우울 효과를 확인하기 위해 TST를 수행한 결과, 정상군의 부동시간은 205.4±5.7초, 포공영 추출물을 25, 50 및 100 mg/kg로 투여한 군은 각각 197.8± 13.5초, 156.7±12.4초, 159.6±13.0초로 포공영추출물 50 과 100 mg/kg 투여군에서 정상군에 비해 유의적인 부동 시간의 감소를 나타내었다. 또한 fluoxetine 투여군에서도 129.
- 생기는 지 확인하기 위하여 OFT를 실시하였다. 대조군 및 포공영추출물을 25, 50 및 100 mg/kg 투여한 군에서의 총 이동거리를 5분 간격으로 총 20분 동안 측정한 결과, 모든 군에서 자발적 활동성의 통계적 차이가 나타나지 않았다(Table 1).
- 실시하였다. 그 결과 해마부위에서 BDNF와 pERK, pCREB의 발현은 포공영 추출물 100 mg/kg을 투여한 군에서 정상군에 비해 유의적으로 증가되는 것을 알 수 있었다 (Fig. 3, 4, 5).
- 따라서 시험약물이 효과가 있으면 부동자세를 취하는 시간이 감소하기 때문에 이를 토대로 약물의 효능을 검정할 수 있게 된다. 본 연구에서 포공영추출물은 50과 100 mg/kg 투여용량에서 정상군에 비해 부동시간이 유의성 있게 감소함을 확인하였다. 한편, TST는 꼬리가 매달린 쥐는 활동과 부동자세를 교대로 보이는데 이 부동자세를 보이는 시간의 감소 여부를 측정하여 항우울 활성을 검색할 수 있는데, 본 연구에서 포공영 추출물 50과 100 mg/kg 투여 시 FST에서와 마찬가지로 정상군에 비해 부동시간이 유의적으로 감소함을 확인하였다.
- 본 연구에서 포공영추출물은 50과 100 mg/kg 투여용량에서 정상군에 비해 부동시간이 유의성 있게 감소함을 확인하였다. 한편, TST는 꼬리가 매달린 쥐는 활동과 부동자세를 교대로 보이는데 이 부동자세를 보이는 시간의 감소 여부를 측정하여 항우울 활성을 검색할 수 있는데, 본 연구에서 포공영 추출물 50과 100 mg/kg 투여 시 FST에서와 마찬가지로 정상군에 비해 부동시간이 유의적으로 감소함을 확인하였다. 그러나 locomotor activity 실험에서는 포공영추출물 투여군과 정상군 모두 총 이동거리의 변화가 없었으며, 이는 포공영추출물이 행동과다의 부작용이 없으면서 항우울 작용을 가지고 있음을 의미한다.
- 따라서 이러한 단백질들은 항우울제제들의 분자적 수준에서의 효과를 확인하는 유용한 표식인자들로 볼 수 있으며, 특히 BDNF의 증가는 세로토닌 수용체의 활성화로 해마부위에서 손상된 뇌세포가 다시 회복되는 신경세포 재생성이라는 현상을 유도함으로써 우울증 환자의 손상된 기억력을 회복시켜 주는 것으로 알려져 있다25). 본 연구에서 포공영추출물 50과 100 mg/kg 용량의 투여는 해마부위에서의 BDNF 발현과 ERK 및 CREB의 인산화를 증가시켰으며, 특히 100 mg/kg 투여군에서 정상군에 비해 유의적인 발현양 증가를 관찰하였다. 현재 우울증 치료제의 주종을 이루고 있는 것은 SSRI 계열의 약물이며, 이보다 한 단계 발전한 것이 serotonin 뿐만 아니라 norepinephrine 및 dopamine의 고갈을 억제하는 serotonin -norepinephrine 재흡수 억제제(serotoninnoradrenergic reuptake inhibitors, SNRI)로 fluoxetine, paroxetine, sertraline 등이 개발되어 임상적 효능을 인정받고 있다.
- 이상의 결과로부터, 포공영추출물은 FST와 TST 실험에서 정상군에 비해 모두 유의성 있게 항우울 효과를 나타내었으며, 관련 기전으로써 해마부위에서의 BDNF, ERK 및 CREB 의 발현을 유의적으로 증가시킴을 확인하였다. 향후 포공영의 항우울 효과에 대한 확인을 위해 추가적으로 serotonin 함량측정, 성분 분석 및 임상연구가 필요할 것으로 생각되며, 다양한 활성성분에 대한 항우울증 효과에 대한 연구도 진행되어야 할 것으로 사료된다.
- 1. 강제 수영 실험(FST)에서 포공영추출물(50, 100 mg/kg) 은 정상군에 비해 부동시간이 현저히 감소하였다.
- 2. 꼬리 매달기 실험(TST)에서 포공영추출물(50, 100 mg/kg)은 정상군에 비해 부동시간이 현저히 감소하였다.
- 3. 과잉 행동 실험(OFT)에서 포공영 추출은 정상군과 비슷한 이동 거리를 나타내었다.
- 4. 포공영추출물(100 mg/kg) 투여에 의해 해마부위 BDNF, ERK, CREB 단백질 발현이 증가되었다.
- 이상의 결과, 마우스를 이용한 우울증 실험에서 포공영 추출물은 항우울증 효과를 나타내었으며, 이는 포공영이 우울증 개선 식품 및 의약품 개발 소재로 활용될 수 있음을 의미한다.
후속연구
- 발현을 유의적으로 증가시킴을 확인하였다. 향후 포공영의 항우울 효과에 대한 확인을 위해 추가적으로 serotonin 함량측정, 성분 분석 및 임상연구가 필요할 것으로 생각되며, 다양한 활성성분에 대한 항우울증 효과에 대한 연구도 진행되어야 할 것으로 사료된다.
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