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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 진피 에탄올 추출물(Ethanol Extracts of Citrus Peel, EECP)의 항비만 효과 및 그에 따른 생화학적 기전의 해석을 위하여 지방전구세포인 3T3-L1 세포의 생존율과 증식에 영향을 미치지 않는 농도의 EECP가 insulin, dexamethasone 및 IBMX가 혼합된 비만유도인자에 의하여 인위적으로 유발된 adipogenesis 과정에 어떠한 영향을 미치는지를 조사하였고, 이때 adipogenic transcription factors 및 adipocyte expressed genes의 발현변화와 함께 AMPK의 역할에 대하여 조사하여 유의적인 결과를 얻었기에 이를 보고하는 바이다.
제안 방법
- 3T3-L1 preadipocytes가 adipocytes로의 분화에 따른 형태 변화에 EECP가 어떠한 영향을 미치는 지를 확인하기 위하여 세포 배양용 6 well plate에 3T3-L1 preadipocytes를 분주하여 confluent 상태까지 배양한 후 EECP를 적정농도로 희석 처리하면서 분화를 유도하였다. 분화가 끝난 후 EECP 처리농도에 따른 형태변화를 도립 현미경을 이용하여 200배의 배율로 관찰한 다음 Axio Vision 프로그램을 이용하여 사진 촬영을 하였다.
- 성숙한 지방세포에서는 LPL에 의한 triglyceride 유입과 adipose triglyceride lipase (ATGL) 및 hormone sensitive lipase (HSL)에 의한 triglyceride 유출에 의하여 lipid droplet이 유지되며, 이러한 lipid droplet은 비만유발뿐 만 아니라 암, 동맥경화 및 제2형 당뇨병 등과 같은 대사성 질환에도 관련성이 크다고 보고되고 있다[16, 20]. 따라서 EECP가 3T3-L1 preadipocytes가 adipocytes로 분화되는 과정에 나타나는 lipid droplet 생성에 어떠한 영향을 미치는 지를 확인하기 위하여 분화유도 시 EECP를 적정농도로 처리한 다음 Oil red O 염색 전과 후로 구분하여 세포 내 lipid droplet의 생성 정도를 도립 현미경으로 관찰하였다. Fig.
- 일반적으로 triglyceride는 포도당과 함께 세포의 중요한 에너지원으로 사용되지만 과도한 음식물 섭취로 인한 여분의 triglyceride는 지방세포에 흡수되고 저장되어 비만의 원인으로 작용할 뿐 만 아니라 다양한 질환의 원인이 되기도 한다[13]. 따라서 EECP가 triglyceride의 생성에 어떠한 영향을 미치는 지를 확인하기 위하여 Oil Red O로 염색된 lipid droplet을 isopropanol로 추출한 후 triglyceride의 함량을 측정하였다. Fig.
- Adipogenesis의 핵심 조절자로 불리는 C/EBPα 및 PPARγ는 서로 상호작용하여 상승 효과를 나타내어 최종적으로 분화과정을 완성하게 되며, 그 결과로 백색지방세포에서 나타나는 lipid droplet 생성 및 triglyceride의 축적과 함께 세포의 크기 증가 등과 같은 형태적 특징과 더불어 aP2 및 Leptin 등과 같은 adipocyte expressed genes의 발현을 유발함으로서 지방세포의 특징을 지니게 된다[1, 8]. 따라서 본 연구에서는 EECP가 adipogenic transcription factors 및 adipocyte expressed genes의 발현에 어떠한 영향을 미치는지 단백질 수준에서 확인하였다. 먼저 adipogenic transcription factors의 발현 정도를 확인한 결과 Fig.
- 색소결합법에 해당하는 Oil red O 염색법은 총 지질을 정량할 때 쓰이는 방법 중 하나로서 지질에만 특이적으로 결합하므로 adipocytes에 생성된 지방 빈도를 파악할 수 있다. 따라서 분화가 유발된 3T3-L1 adipocytes 내에 생성되는 lipid droplet에 EECP가 어떠한 영향을 미치는 지를 확인하기 위하여 Oil Red O 염색을 실시하였다. 대조군과 각기 다른 농도의 EECP가 처리된 3T3-L1 adipocytes를 대상으로 배지를 제거하고 PBS로 세척한 다음 3.
대상 데이터
- 본 실험에서 단백질 분석을 위하여 사용된 PPARγ, C/EBP α, C/EBPβ, SREBP, Laptin, aP2 및 actin 1차 항체는 Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA, USA) 및 Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA)에서 구입하였다.
- 실험에 사용된 세포주는 American Type Culture Collection (ATCC, USA)에서 분양받은 mouse fibroblast인 3T3-L1 preadipocytes를 사용하였다. 3T3-L1 preadipocytes는 90%의 Dulbecco's Modified EaDCRT Media (DMEM, Gibco BRL, Grand Island, NY, USA), 10%의 bovine calf serum (BCS, Gibco BRL, Grand Island, NY, USA) 및 1%의 penicillin 및 streptomycin (Gibco BRL, Grand Island, NY, USA)이 포함된 성장배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하였다.
데이터처리
- 모든 실험 결과는 SPSS ver. 18.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) 통계 프로그램을 이용하여 평균(mean) ± 표준편차(SD)로 나타냈다. 각 실험군의 분석 항목별 통계의 유의성 검증은 분산분석(Analysis of Vatiance, ANOVA)을 한 후, Student t-test와 Duncan's multiple range test를 이용하여 p＜0.
- , Chicago, IL, USA) 통계 프로그램을 이용하여 평균(mean) ± 표준편차(SD)로 나타냈다. 각 실험군의 분석 항목별 통계의 유의성 검증은 분산분석(Analysis of Vatiance, ANOVA)을 한 후, Student t-test와 Duncan's multiple range test를 이용하여 p＜0.05 수준에서 검증하였다.
이론/모형
- 5 mg/ml EECP 처리군에서 부터는 점차적인 생존율의 감소가 관찰되었다. 동일한 조건에서 3T3-L1 preadipocytes의 증식에 미치는 EECP의 영향을 알아보기 위하여 MTT assay를 실시하였다. Fig.
성능/효과
- Fig. 2의 결과에서 알 수 있듯이 EECP를 처리하지 않고 분화를 유도하였을 경우에 세포질 내 lipid droplet의 형성이 활발하게 유발되는 것으로 관찰되었으나, EECP를 처리하였을 경우에는 처리농도 의존적으로 lipid droplet의 형성이 현저하게 억제되는 것으로 나타났다. 따라서 EECP는 3T3-L1 preadipocytes에서 adipocytes로의 분화를 억제한다는 것을 알 수 있었다.
- Fig. 3에 나타난 바와 같이 EECP를 처리하였을 경우에는 대조군과 비교하여 농도 의존적으로 triglyceride의 생성 정도가 점차적으로 감소되었으며, 최고 농도인 2 mg/ml 처리군에서는 약 55%의 triglyceride 생성 억제효과가 있는 것으로 나타났다. 이상의 결과를 살펴보면 EECP는 lipid droplet의 형성억제와 연관된 triglyceride 생성억제효과가 있는 것으로 나타났으므로 3T3-L1 preadipocytes의 분화를 억제함으로서 비만 예방에 효과적 일것으로 생각된다.
- 먼저 AMPK 및 ACC의 발현 변화를 확인한 결과 Fig. 5A에 나타난 바와 같이 AMPK 및 ACC의 인산화가 현저하게 증가되는 것으로 나타났으므로 EECP에 의한 adipogenesis 억제에 있어서 AMPK의 활성화가 관여한다는 것을 예상할 수 있었다. 다음으로 Fig.
- 다음으로 Fig. 5B에 나타난 바와 같이 AMPK 억제제인 compound C를 선처리하여 AMPK 경로를 억제하였을 경우 EECP에 의하여 발현이 증가 되었던 pAMPK 및 pACC의 발현이 억제되었으며, EECP에 의하여 발현이 억제되었던 PPARγ, C/EBPα, C/EBPβ 및 SREBP1c의 발현이 다시 증가되는 것으로 나타났다. 이상의 결과를 살펴볼 때 EECP는 3T3-L1 세포에서 AMPK의 활성화를 통한 adipogenic transcription factors의 발현을 감소를 유발함으로서 adipogegesis를 억제한다는 것을 알 수 있었다.
- 1A에 나타낸 바와 같다. 결과에서 볼 수 있듯이 2 mg/ml EECP 처리군까지는 생존율 감소현상이 크게 나타나지 않았지만 2.5 mg/ml EECP 처리군에서 부터는 점차적인 생존율의 감소가 관찰되었다. 동일한 조건에서 3T3-L1 preadipocytes의 증식에 미치는 EECP의 영향을 알아보기 위하여 MTT assay를 실시하였다.
- 2의 결과에서 알 수 있듯이 EECP를 처리하지 않고 분화를 유도하였을 경우에 세포질 내 lipid droplet의 형성이 활발하게 유발되는 것으로 관찰되었으나, EECP를 처리하였을 경우에는 처리농도 의존적으로 lipid droplet의 형성이 현저하게 억제되는 것으로 나타났다. 따라서 EECP는 3T3-L1 preadipocytes에서 adipocytes로의 분화를 억제한다는 것을 알 수 있었다.
- 최근 연구에 따르면 AMPK activator인 AICAR 및 많은 종류의 natural compound들은 adipogenic marker인 fatty acid synthase (FAS) 및 adipogenic transcription factors를 억제함으로서 비만세포로의 분화 억제, apoptosis 유발 및 glucose uptake의 증가를 유발하는 것으로 보고되고 있다[5]. 따라서 EECP에 의한 adipogenesis 억제과정에서 AMPK 및 AMPK의 하위단계에서 작용하는 ACC의 발현 변화를 살펴보고 AMPK의 활성을 억제하였을 경우 EECP에 의하여 유발되는 변화에 어떠한 영향을 미치는 지를 확인하였다. 먼저 AMPK 및 ACC의 발현 변화를 확인한 결과 Fig.
- 5 mg/ml EECP 처리군에서부터는 증식억제가 강하게 유발된다는 것을 알 수 있었다. 이상의 결과를 바탕으로 EECP가 생존율 및 증식에 큰 영향을 미치지 않는 2 mg/ml의 농도까지를 실험 조건으로 설정하여 항비만 효능을 확인하였다.
- 3에 나타난 바와 같이 EECP를 처리하였을 경우에는 대조군과 비교하여 농도 의존적으로 triglyceride의 생성 정도가 점차적으로 감소되었으며, 최고 농도인 2 mg/ml 처리군에서는 약 55%의 triglyceride 생성 억제효과가 있는 것으로 나타났다. 이상의 결과를 살펴보면 EECP는 lipid droplet의 형성억제와 연관된 triglyceride 생성억제효과가 있는 것으로 나타났으므로 3T3-L1 preadipocytes의 분화를 억제함으로서 비만 예방에 효과적 일것으로 생각된다.
- 5B에 나타난 바와 같이 AMPK 억제제인 compound C를 선처리하여 AMPK 경로를 억제하였을 경우 EECP에 의하여 발현이 증가 되었던 pAMPK 및 pACC의 발현이 억제되었으며, EECP에 의하여 발현이 억제되었던 PPARγ, C/EBPα, C/EBPβ 및 SREBP1c의 발현이 다시 증가되는 것으로 나타났다. 이상의 결과를 살펴볼 때 EECP는 3T3-L1 세포에서 AMPK의 활성화를 통한 adipogenic transcription factors의 발현을 감소를 유발함으로서 adipogegesis를 억제한다는 것을 알 수 있었다. 본 연구 결과는 진피의 비만억제 가능성을 제시하는 것으로서 추가적으로 에너지 대사 및 신호전달계 등과 연관된 항비만기전에 대한 생화학적 해석이 필요할 것을 생각되며, 본 연구의 결과는 향후 지속적인 연구를 위한 귀중한 자료로서의 그 가치가 매우 높을 것으로 생각된다.
- 4B에서와 같이 EECP 처리에 의하여 현저하게 감소하였음을 확인하였다. 이상의 결과를 살펴볼 때 EECP는 adipogenic transcription factors의 발현을 억제함으로서 lipid droplet 및 triglyceride 생성 감소와 함께 adipocyte expressed genes의 발현을 감소시킴으로서 지방세포로의 분화를 억제시킬 수 있을 것으로 추정된다.
후속연구
- 이상의 결과를 살펴볼 때 EECP는 3T3-L1 세포에서 AMPK의 활성화를 통한 adipogenic transcription factors의 발현을 감소를 유발함으로서 adipogegesis를 억제한다는 것을 알 수 있었다. 본 연구 결과는 진피의 비만억제 가능성을 제시하는 것으로서 추가적으로 에너지 대사 및 신호전달계 등과 연관된 항비만기전에 대한 생화학적 해석이 필요할 것을 생각되며, 본 연구의 결과는 향후 지속적인 연구를 위한 귀중한 자료로서의 그 가치가 매우 높을 것으로 생각된다.
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