국내산 및 수입산 참돔의 중금속 함량 및 항산화 활성과 세포독성 효과 비교 Heavy Metal Contents and Antioxidant Activity and Cytotoxic Effect of Red Sea Bream (Pagrus major): Comparative Studies in Domestic and Imported Red Sea Bream (Pagrus major)원문보기
본 연구에서는 국내에서 주로 소비되는 국내산 및 수입산 참돔의 일반성분과 중금속 함량을 비교 분석하였고 생리활성을 비교하기 위하여 참돔을 용매의 극성에 따라 추출하여 항산화 및 세포독성 효과에 대해 연구하였다. 수입산과 비교했을 때 국내산 참돔은 높은 함량의 수분과 낮은 함량의 조지방, 조단백질 및 회분을 나타내었다. 국내산 및 수입산 참돔의 중금속 함량을 비교한 결과 원산지에 따른 유의적 차이를 보였으며 국내산 참돔의 수은 함량은 0.08 mg/kg으로 수입산 참돔보다 높은 함량을 나타내었으나 납의 경우 원산지에 따른 유의적 차이는 보이지 않았다. 국내산 및 수입산 참돔의 A+M 및 MeOH 추출물을 인체 섬유육종세포(HT-1080)에 처리하였을 때, 세포 내 활성산소종 생성 저해효과를 살펴 본 실험 결과, 국내산 및 수입산 참돔 추출물들에 의한 활성산소종 생성 억제효과를 비교해 보면 수입산 참돔 추출물에 의한 저해효과가 높았으며 두 추출물들 중 MeOH 추출물에 의한 저해효과가 높았음을 알 수 있었다. 인체 암세포들(AGS 및 HT-29)들에 대한 세포독성 활성 결과에서 AGS 암세포의 경우 국내산 참돔 A+M 및 MeOH 추출물들에 의한 세포독성 효과가 수입산 참돔A+M 추출물들보다 높았다. HT-29 암세포에 대해서는 국내산 참돔A+M 추출물에 의한 세포독성 효과가 수입산 참돔 A+M 추출물에 의한 것보다 높았고 MeOH 추출물에 의한 세포독성 효과는 유사했다. 따라서 본 연구 결과를 기초자료로 하여 향후 참돔의 다양한 생리활성 규명이 필요하다고 사료된다.
본 연구에서는 국내에서 주로 소비되는 국내산 및 수입산 참돔의 일반성분과 중금속 함량을 비교 분석하였고 생리활성을 비교하기 위하여 참돔을 용매의 극성에 따라 추출하여 항산화 및 세포독성 효과에 대해 연구하였다. 수입산과 비교했을 때 국내산 참돔은 높은 함량의 수분과 낮은 함량의 조지방, 조단백질 및 회분을 나타내었다. 국내산 및 수입산 참돔의 중금속 함량을 비교한 결과 원산지에 따른 유의적 차이를 보였으며 국내산 참돔의 수은 함량은 0.08 mg/kg으로 수입산 참돔보다 높은 함량을 나타내었으나 납의 경우 원산지에 따른 유의적 차이는 보이지 않았다. 국내산 및 수입산 참돔의 A+M 및 MeOH 추출물을 인체 섬유육종세포(HT-1080)에 처리하였을 때, 세포 내 활성산소종 생성 저해효과를 살펴 본 실험 결과, 국내산 및 수입산 참돔 추출물들에 의한 활성산소종 생성 억제효과를 비교해 보면 수입산 참돔 추출물에 의한 저해효과가 높았으며 두 추출물들 중 MeOH 추출물에 의한 저해효과가 높았음을 알 수 있었다. 인체 암세포들(AGS 및 HT-29)들에 대한 세포독성 활성 결과에서 AGS 암세포의 경우 국내산 참돔 A+M 및 MeOH 추출물들에 의한 세포독성 효과가 수입산 참돔A+M 추출물들보다 높았다. HT-29 암세포에 대해서는 국내산 참돔A+M 추출물에 의한 세포독성 효과가 수입산 참돔 A+M 추출물에 의한 것보다 높았고 MeOH 추출물에 의한 세포독성 효과는 유사했다. 따라서 본 연구 결과를 기초자료로 하여 향후 참돔의 다양한 생리활성 규명이 필요하다고 사료된다.
This study compared the heavy metal contents and the effects of extracts from domestic and imported red sea bream on the antioxidant activity and cytotoxicity of human cancer cell lines. The antioxidant activity was measured using the fluorescently sensitive dye, 2’-7’ dichlorofluoresc...
This study compared the heavy metal contents and the effects of extracts from domestic and imported red sea bream on the antioxidant activity and cytotoxicity of human cancer cell lines. The antioxidant activity was measured using the fluorescently sensitive dye, 2’-7’ dichlorofluorescein-diacetate (DCFH-DA), and antiproliferative activity against AGS human gastric adenocarcinoma and HT-29 human colon cancer cell lines, which was determined by the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay. Domestic red sea bream had a higher mercury content when compared to imported red sea bream, but there was no significant difference in the lead content. Treatments with acetone/methylene chloride (A+M) and methanol (MeOH) extracts from domestic and imported red sea bream dose-dependently decreased the H2O2 induced ROS production, compared to the control. The cell viability showed that treatments with the A+M and MeOH extracts had cytotoxicity in the growth of AGS and HT-29 cancer cells. In the case of AGS, the extracts from the domestic red sea bream were higher in inhibiting cancer cell growth, compared to imported red sea bream. Our results demonstrate that the heavy metal contents of domestic and imported red sea bream were below the limit of the Food Code of Korea. The results of the biological activities indicate that the antioxidant activity of extracts from imported red sea bream was more effective, while the extracts from the domestic red sea bream were stronger in cytotoxic activity.
This study compared the heavy metal contents and the effects of extracts from domestic and imported red sea bream on the antioxidant activity and cytotoxicity of human cancer cell lines. The antioxidant activity was measured using the fluorescently sensitive dye, 2’-7’ dichlorofluorescein-diacetate (DCFH-DA), and antiproliferative activity against AGS human gastric adenocarcinoma and HT-29 human colon cancer cell lines, which was determined by the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay. Domestic red sea bream had a higher mercury content when compared to imported red sea bream, but there was no significant difference in the lead content. Treatments with acetone/methylene chloride (A+M) and methanol (MeOH) extracts from domestic and imported red sea bream dose-dependently decreased the H2O2 induced ROS production, compared to the control. The cell viability showed that treatments with the A+M and MeOH extracts had cytotoxicity in the growth of AGS and HT-29 cancer cells. In the case of AGS, the extracts from the domestic red sea bream were higher in inhibiting cancer cell growth, compared to imported red sea bream. Our results demonstrate that the heavy metal contents of domestic and imported red sea bream were below the limit of the Food Code of Korea. The results of the biological activities indicate that the antioxidant activity of extracts from imported red sea bream was more effective, while the extracts from the domestic red sea bream were stronger in cytotoxic activity.
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문제 정의
따라서 본 연구에서는 국내에서 주로 소비되는 국내산 및 수입산 참돔의 영양적 가치와 안전성를 평가하기 위하여 일반 성분과 중금속 함량을 비교 분석하였고 생리활성을 알아 보기 위하여 참돔을 용매의 극성에 따라 추출하여 항산화 및 세포 독성 효과에 대해 비교 연구하였다.
제안 방법
1은 국내산 참돔의 A+M 및 MeOH 추출물을 인체 섬유육종세포(HT-1080)에 처 리하였을 때, 세포 내 활성산소종 생성 저해효과를 본 실험 결과이다. A+M 및 MeOH 추출물을 첨가농도 0.1 및 5 mg/ml 로 처리했을 때 측정시간 120분 동안 500 μM H2O2만을 처리한 control군에 비해 세포 내 활성산소종을 억제시켰다. A+M 추출물의 경우, 측정시간 120분 기준으로 5 mg/ml의 처리 농 도에서 control군에 비해 50%의 억제효과가 나타났으며, 반면 MeOH 추출물의 경우 65%의 높은 활성산소종 억제효과를 나타내었다.
한국 세포주 은행(서울의대)으로부터 인체 위암세포(AGS), 인체 결장암세포(HT-29)와 인체 섬유육종세포(HT-1080)를 분 양받아 본 실험실에서 계대 배양하면서 실험에 사용하였다. AGS와 HT-29 세포는 10% FBS와 100 units/ml의 penicillin- streptomycin이 함유된 RPMI 1640 배지, HT-1080 세포는 10% FBS와 100 units/ml의 penicillin-streptomycin이 함유된 RPMI 1640 배지로 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양하였으며 배양 중인 세포를 일주일에 2∼3번 새로운 배지로 바꿔주었 다. 일주일 후 phosphate buffered saline (PBS)으로 세척한 뒤 0.
실험에 사용된 수입산 참돔은 일본산으로 2013년 3월에 부 산 자갈치 수산시장에서 구입하였으며, 국내산 참돔은 통영시 에서 양식된 것으로 2013년 4월 부산 자갈치 수산시장에서 구입하였다. 각각의 시료는 신선한 상태에서 머리와 꼬리, 내 장을 제거한 후 뼈를 중심으로 반으로 나누어 5 mm 두께로 3등분으로 포를 떴으며 동결건조기를 이용하여 -45℃에서 20 Pa의 압력으로 3일간 건조시켰다. 건조된 시료는 분말화하여 실험 사용 전까지 -75℃ deep freezer (NF-400SF, NIHON FREEZER, Tokyo, Japan)에 냉동 보관하였다.
건조된 시료는 유기용매 추출을 위하여 acetone과 methyl- ene chloride를 1:1 비율로 혼합하여 시료가 충분히 잠기도록 하여 24시간 방치한 후 추출하였다. 이 과정을 2회 반복하여 얻은 추출액은 40℃ 수욕 상에서 rotary evaporator (N-1000, EYELA, Tokyo, Japan)로 농축하여 acetone/methylene chlor- ide 추출물(A+M)을 얻었다.
각 well에 시료를 처리하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 1시간 배양한 후, DCFH-DA을 없애고 세포는 다시 PBS로 씻은 후 500 μM H2O2 를 처리하여 시간별로 DCF fluorescence를 excitation 488 nm, emission 530 nm에서 microplate reader (VICTOR3, Perkin Elmer, Waltham, MA, USA)로 측정하였다. 대조군들(blank군 과 control군)은 시료 대신 PBS를 처리하며, control군은 500 μM H2O2를 처리를 하고, blank군은 500 μM H2O2 대신 PBS를 처리하여 측정하였다.
배양된 암세포는 96 well cell culture plate에 5×104 cells/ ml이 되도록 100 μl씩 분주하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 배양한 후 배지는 제거한 뒤 각 시료를 배지로 희석하여 각 well당 100 μl씩 첨가하고, 대조군에는 시료 대신 PBS를 100 μl씩 첨가하였다. 이 plate를 다시 37℃, 5% CO2 incubator 에서 48시간 배양하였다.
수은은 화학적 전처리한 후 자동수은분석기(Direct Mer- cury Analyzer, DMA-80, Milestone Srl, Bergamo, Italy)를 이용하여 측정하였다. 납 분석은 무게를 측정한 후 시료를 도가 니에 취하여 건조 후 탈화시킨 다음 500℃에서 24시간 회화하였다.
AGS와 HT-29 세포는 10% FBS와 100 units/ml의 penicillin- streptomycin이 함유된 RPMI 1640 배지, HT-1080 세포는 10% FBS와 100 units/ml의 penicillin-streptomycin이 함유된 RPMI 1640 배지로 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양하였으며 배양 중인 세포를 일주일에 2∼3번 새로운 배지로 바꿔주었 다. 일주일 후 phosphate buffered saline (PBS)으로 세척한 뒤 0.05% trypsin-0.02% EDTA (GIBCO, Buffalo, NY, USA)로 부착된 세포를 분리하여 원심분리 한 후 집적된 암세포에 배 지를 넣고 피펫으로 암세포가 골고루 분산되도록 잘 혼합하여 75 mm3 cell culture flask에 10 ml씩 일정한 수로 분할하여 주입하고 계속 6~7일마다 계대 배양하면서 실험에 사용하였다.
), hydroxyl radical (·OH), 알킬 과산화물, 할로겐 산화물 등이 있는데 이들은 구조적으로 분자 또는 원 자 최외각에 하나의 부대 전자를 가지므로 반응성이 크고 매우 불안정한 화합물이며, 다양한 산화효소에 의해 세포질, 세 포내과립(mitochondria, microsome, peroxisome) 및 cytosol 에서 생성된다[8]. 천연물 유래 항산화 물질 검색과 수산식품 의 효과적인 이용이라는 측면에서 참돔을 이용하여 세포 내 활성산소종 억제효과를 검색하였다. Fig.
대상 데이터
실험에 사용된 수입산 참돔은 일본산으로 2013년 3월에 부 산 자갈치 수산시장에서 구입하였으며, 국내산 참돔은 통영시 에서 양식된 것으로 2013년 4월 부산 자갈치 수산시장에서 구입하였다. 각각의 시료는 신선한 상태에서 머리와 꼬리, 내 장을 제거한 후 뼈를 중심으로 반으로 나누어 5 mm 두께로 3등분으로 포를 떴으며 동결건조기를 이용하여 -45℃에서 20 Pa의 압력으로 3일간 건조시켰다.
한국 세포주 은행(서울의대)으로부터 인체 위암세포(AGS), 인체 결장암세포(HT-29)와 인체 섬유육종세포(HT-1080)를 분 양받아 본 실험실에서 계대 배양하면서 실험에 사용하였다. AGS와 HT-29 세포는 10% FBS와 100 units/ml의 penicillin- streptomycin이 함유된 RPMI 1640 배지, HT-1080 세포는 10% FBS와 100 units/ml의 penicillin-streptomycin이 함유된 RPMI 1640 배지로 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양하였으며 배양 중인 세포를 일주일에 2∼3번 새로운 배지로 바꿔주었 다.
데이터처리
실험은 3회 반복 실험하여 Mean ± SEM (Standard Error of Mean)으로 나타내었고, 분석된 실험 데이터는 대조군과 각 시료로부터 얻은 실험 자료로부터 t-test를 실시하여 유의성을 검증하였다.
이론/모형
국내산 및 수입산 참돔 추출물의 인체 암세포에 대한 독성 효과를 조사하기 위해 MTT assay를 행하였다. DMSO에 의한 독성은 값이 거의 변화하지 않았으므로 DMSO에 의한 독성은 세포의 생존율에 아무런 영향을 미치지 않았다.
세포 내 활성산소종은 DCFH-DA (2', 7’-dichlorofluorescin diacetate) assay로 측정하였다[12, 19]. DCFH-DA (Sigma- Aldrich, Saint Louis, MO, USA)는 세포 내 활성산소종과 반응 하여 형광물질(dichlorofluorescein, DCF)을 만들어 내는 것으로 이 시약을 세포 속에 넣어 발생하는 형광을 측정함으로써 세포 내의 활성산소종을 측정할 수 있다.
시료의 일반성분인 수분, 조지방, 조단백, 조회분은 AOAC 방법[1]에 따라 분석하였다. 즉 수분은 상압가열건조법(105℃ 건조법), 조단백은 Kjeldahl 질소정량법, 조지방은 Soxhlet 추 출법, 조회분은 550℃ 회화로에서 회화시키는 직접회화법으 로 정량하였다.
시료의 일반성분인 수분, 조지방, 조단백, 조회분은 AOAC 방법[1]에 따라 분석하였다. 즉 수분은 상압가열건조법(105℃ 건조법), 조단백은 Kjeldahl 질소정량법, 조지방은 Soxhlet 추 출법, 조회분은 550℃ 회화로에서 회화시키는 직접회화법으 로 정량하였다.
성능/효과
05). A+M 및 MeOH 추출물 모두 5 mg/ml 첨가 농도에서 80% 및 82%의 세포독성 을 나타내었고 IC50값은 각각 3.35 및 2.53 mg/ml로 국내산 참돔과 유사하게 MeOH 추출물에 의한 세포독성 효과가 높았 다. Fig.
Table 3은 AGS 및 HT-29 암세포들에 대한 국내산 및 수입산 참돔 추출물의 IC50 값을 비교하여 나타낸 것이다. AGS 암세포에 대한 국내산 참 돔 A+M 및 MeOH 추출물의 IC50값은 각각 2.77 및 1.18 mg/ ml로 MeOH 추출물에 의한 세포독성 효과가 높았다. Fig.
4은 국내산 참돔 추출물을 HT-29 암세포에 처리했을 때 세포독성 효과를 나타낸 것이다. AGS 암세포와 마찬가지로 A+M 및 MeOH 추출물 모두 가장 낮은 농도인 0.5 mg/ml부터 농도 의존적으로 HT-29 암세포에 대해 독성을 나타내었으며 5mg/mL 첨가 농도에서 각각 82% 및 60%의 세포독성을 나타 내었다(P<0.05). HT-29 암세포에 대한 국내산 참돔A+M 및 MeOH 추출물의 IC50값은 각각 2.
1 및 5 mg/ml의 처리 농도에서 측정시간 동안 control군에 비해 각각 74% 및 85%의 활성산소종 생성을 감소시키는데 우수한 능력을 나타내었다. 따라서 국내산 및 수입산 참돔추출물들에 의한 활성산소종 생성 억제효과를 비교해보면 수입산 참돔 추출물에 의한 저해효과가 높았으며 두 추출물들 중 MeOH 추출물에 의한 저해효과가 높았음을 알 수 있었다.
1%에 해당되는 상당히 낮은 수준으로 과잉 섭취로 인한 위해성은 거의 없는 것으로 생각된다. 또한 국내산 및 수입 산 참돔의 생리활성을 비교한 결과 활성산소종 생성 억제와 같은 항산화 효과에서는 수입산 참돔의 활성이 높았고 암세포 증식 억제 효과에서는 국내산 참돔에 의한 증식 억제효과가 높았음을 알 수 있었다. 본 연구결과를 기초자료로 하여 향후 참돔의 다양한 생리활성 규명이 필요하다고 사료된다.
또한 전갱이 과에 속하는 방어(Seriola quinqueradiata)를 보통육과 혈압육으 로 구분하여 각각의 항산화 및 항증식 효과을 비교한 연구에서 보통육과 비교했을 때 방어 혈압육에 의한 세포 내 ROS 생성 억제능과 AGS 및 HT-29 인체 암세포 증식 억제효과가 높았다고 보고하였다[3]. 이상의 결과들로부터 국내산 및 수입 산 참돔(P. major)의 중금속 함량은 우리나라의 중금속 기준인 0.5 ㎎/㎏이하로 검출되었으며 또한 FAO/WHO에서 설정 한 인체 허용 잠정 주간섭취허용기준(PTWI: Provisional Tolerable Weekly Intake)과 비교[6]하여 수은의 경우 2.5%, 납은 0.1%에 해당되는 상당히 낮은 수준으로 과잉 섭취로 인한 위해성은 거의 없는 것으로 생각된다. 또한 국내산 및 수입 산 참돔의 생리활성을 비교한 결과 활성산소종 생성 억제와 같은 항산화 효과에서는 수입산 참돔의 활성이 높았고 암세포 증식 억제 효과에서는 국내산 참돔에 의한 증식 억제효과가 높았음을 알 수 있었다.
fas- ciatus)에서 높았고 조단백질과 회분은 참돔에서 가장 높은 함 량을 나타내었다. 중금속 함량을 비교한 결과 수은의 함량은 뱅애돔및 돌돔에서 각각 0.07 및 0.06 ㎎/㎏로 유의적으로 높은 함량을 나타내었고 납의 함량에는 종류별 유의적 차이가 없었다. 우리나라의 중금속 규제 현황[10]을 살펴보면 중금속 함량 기준이 0.
후속연구
또한 국내산 및 수입 산 참돔의 생리활성을 비교한 결과 활성산소종 생성 억제와 같은 항산화 효과에서는 수입산 참돔의 활성이 높았고 암세포 증식 억제 효과에서는 국내산 참돔에 의한 증식 억제효과가 높았음을 알 수 있었다. 본 연구결과를 기초자료로 하여 향후 참돔의 다양한 생리활성 규명이 필요하다고 사료된다.
1%의 라디칼 소거능이 있음을 보였다. 이와 같이 현재 천연물 유래 항산화 물질 검색이 활발히 진행 되고 있으며, 본 연구에 사용된 참돔 추출물 또한 향후 분리, 정제를 통하여 유용한 천연항산화제 탐색에 기초 자료가 될 것이라 사료된다.
참고문헌 (21)
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