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문제 정의
- 이에 본 실험에서는 연자육 추출물이 음경해면체 혈관의 이완에 미치는 영향과 그 기전에 대해서 내피세포성 이완인자를 중심으로 한 organ bath study와 조직화학적 방법을 통하여 확인하고자 한다.
제안 방법
- Endothelial cell basal medium-2(EBM-2) 배지로 37℃, 5% CO2 하에서 24시간 배양한 human umbilical vein endothelial cells(HUVEC)에 연자육 추출물을 농도별(10, 30, 50, 100, 300 ㎍/㎖)로 처리한 다음 24시간 배양하여 세포생존율을 MTT assay로 측정하였다23). MTT(methylthiazol-2-yl-2, 5-diphenyl tetrazolium bromide, 5 ㎎/㎖)를 20 ㎕ 넣고, 세포 배양기에서 2시간 방치하였다.
- 연자육 추출물이 음경해면체 혈관의 이완에 미치는 영향을 검증하고자 organ bath study와 조직화학적인 방법을 통해 아래와 같은 결과를 얻었다.
- 음경해면체에 분포하는 민무늬근육과 아교섬유의 분포 변화를 관찰하기 위해 Masson trichrome 염색을 실시하였다. 우선 50-60℃ Bouin 용액에서 1시간 동안 매염 처리한 다음 70% 에탄올에서 picric acid를 제거하였다.
- 이에 본 실험은 연자육 추출물이 음경해면체의 이완에 직접적으로 미치는 영향과 그 작용기전은 organ bath study를 통하여, eNOS의 생성은 조직화학적 방법을 통하여 연구해보았다.
- 해면체절편에 PE 1 μM을 투여하여 수축을 유발시킨 다음 연자육 추출물을 농도별(0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 1.0, 3.0 ㎎/㎖)로 투여하여 수축의 변화를 기록하였다.
- 해면체절편을 L-NNA 10 μM로 15분간 전처치하고 PE 1 μM을 투여하여 수축을 유발시킨 다음 연자육 추출물(0.1, 0.3, 1.0, 3.0 ㎎/㎖)을 투여하여 L-NNA을 전처치하지 않은 경우와 수축의 변화를 비교하였다.
- 해면체절편을 MB 1 μM로 15분간 전처치하고 PE 1 μM을 투여하여 수축을 유발시킨 다음 연자육 추출물(0.1, 0.3, 1.0, 3.0 ㎎/㎖)을 투여하여 MB를 전처치하지 않은 경우와 수축의 변화를 비교하였다.
- 해면체절편을 TEA 10 μM로 15분간 전처치하고 PE 1 μM을 투여하여 수축을 유발시킨 다음 연자육 추출물(0.1, 0.3, 1.0, 3.0 ㎎/㎖)을 투여하여 TEA를 전처치하지 않은 경우와 수축의 변화를 비교하였다.
- 해면체절편을 먼저 IM 10 μM로 15분간 처치하고 PE 1 μM을 투여하여 수축을 유발시킨 다음 연자육 추출물(0.1, 0.3, 1.0, 3.0 ㎎/㎖)을 투여하여 IM을 전처치하지 않은 경우와 수축의 변화를 비교하였다.
대상 데이터
- Organ bath study에는 체중 2.0~2.5 kg 사이의 New Zealand white 수컷 토끼(샘타코, 한국)를 사용하였고 조직화학적 실험에는 10주령의 SHR/Izm Rat (중앙실험동물센터)를 사용하였으며 고형사료와 물을 충분히 공급하면서 1주 이상 실험실 환경에 적응시킨 후 본 실험에 사용하였다.
데이터처리
- 실험결과는 평균과 표준편차로 나타내었고, 해면체 수축의 변화는 실제 수축의 크기와 PE를 투여하여 유발된 최고 수축에 대한 백분율로 표현하였다.
- 실험결과의 비교는 student's t-test로 유의성을 검증하였다.
- 조직화학과 면역조직화학의 결과의 수치화를 위해 Image pro Plus (Media Cybernetic, USA)을 이용한 영상분석 (image analysis)을 실시하였다.
성능/효과
- HUVEC에 연자육 추출물을 처치한 후 NO 량을 측정하였을 때 control에 비하여 유의성 있는 증가를 보였다.
- 또한 TEA는 KCa-channel blocker35,36)로서, K+ 통로를 활성화시키고 세포막의 과분극을 유발하는 EDHF의 작용을 차단하여 음경해면체 이완을 억제시키는데, TEA의 전처치가 음경해면체의 이완효과에 영향을 미치지 않았으므로 연자육 추출물의 음경해면체 혈관이완효과는 EDHF의 작용과도 무관하다는 것을 알 수 있다.
- 또한 indomethacin(IM), tetraethylammonium chloride (TEA), methylene blue(MB)를 전처치 하지 않은 경우와 이들을 전처치한 경우를 비교하였을 때 모두 이완효과에 유의성 있는 변화를 관찰할 수 없었으며, nω-nitro-L-arginine(ʟ-NNA)의 경우, ʟ-NNA 를 전처치하지 않은 경우에 비하여 ʟ-NNA를 전처치한 경우 이완효과가 유의성 있게 억제되어 나타났다.
- 또한 조직화학적인 실험결과, 대조군에 비하여 PE처리군에서 아교섬유에 대한 민무늬근육의 분포비율이 줄고 연자육처리군에서는 증가되어 나타났는데, 이는 PE의 처리로 인해 음경해면체 내 혈관이 수축되었다가 연자육을 처리함으로써 다시 확장된 것을 알 수 있다. 그리고 연자육처리군에서는 대조군에 비해 eNOS 양성반응도 뚜렷이 관찰되었는데 이는 연자육 추출물이 eNOS의 생성을 촉진시킨 것을 나타낸다.
- 세포외 Ca2+ 유입을 차단한 Ca2+-free solution에서 연자육 추출물의 전처치에 의해 수축의 증가가 유의성 있게 감소되었는데, 이결과는 연자육 추출물이 Ca2+ 유입을 차단시킴으로써 음경해면체 혈관이완에 관여하는 것으로 판단된다.
- 실험 결과 PE에 의한 최대수축에 대하여 연자육 추출물을 농도별로 투여하였을 때 1.0, 3.0 ㎎/㎖에서 이완효과가 유의하게 나타났으며, 이를 통해 음경해면체 평활근에 대한 연자육 추출물의 이완효과를 확인할 수 있었다.
- 연자육 추출물은 Ca2+-free solution에서 Ca2+의 첨가에 따른 음경해면체 수축의 증가를 유의하게 억제시켰다.
- 연자육 추출물은 HUVEC에 처치한 후 관찰한 NO 량을 control에 비해 유의하게 증가시켰다.
- 연자육 추출물은 IM과 TEA, MB를 전처치한 음경해면체에서는 이완효과에 영향을 미치지 않았으나, L-NNA를 전처치한 음경해면체에서는 이완효과를 유의하게 억제시켰다.
- 연자육 추출물은 PE로 최대 수축시킨 후 농도별로 투여되었을 때 1.0, 3.0 ㎎/㎖에서 유의성 있는 이완효과를 나타냈다.
- 연자육 추출물은 SHR의 음경해면체 조직에 처치하였을 때 PE 처치군에 비하여 민무늬근의 비율과 eNOS의 양성반응을 증가시켰다.
- 이렇듯 HUVEC 및 조직화학적 실험의 결과는 ʟ-NNA의 전처치 여부로 알게된, 연자육 추출물의 음경해면체 혈관이완효과가 eNOS 에 의한 NO의 생성과정에 관여함으로써 나타난다는 사실을 뒷받침 해주는 근거로 판단할 수 있다.
- 이상의 결과, 연자육 추출물은 내피세포 내에서 eNOS의 생성 및 NO의 생성을 증가시켜 세포외 Ca2+의 유입을 차단하는 경로를 통하여 음경해면체 혈관을 이완시키는 것으로 생각된다.
- 즉, 본 실험을 통해 연자육 추출물은 내피세포 내에서 eNOS의 생성 및 NO의 생성을 증가시켜 세포외 Ca2+의 유입을 차단하는 경로를 통하여 음경해면체 혈관을 이완시키는 것으로 생각된다.
- 해면체 평활근을 이완시키는 인자로 prostacyclin, endothelium-derived hyperpolarizing factor(EDHF), nitric oxide(NO)가 있고, IM34)은 prostacyclin의 생성을 차단하여 이완을 억제시키는데, IM의 전처치가 음경해면체의 이완효과에 영향을 미치지 않았으므로 연자육 추출물의 음경해면체 이완효과는 prostacyclin의 작용과 관련이 없음을 알 수 있다.
후속연구
- 음경평활근의 이완에는 EDRF 중 하나인 NO가 중요한 역할26)을 하는데, 해면체혈관계에 해당되는 eNOS 발현으로 NO가 합성되며 이 NO가 평활근 세포 내로 확산되어 세포내 칼슘 농도를 감소시키고, 해면체 평활근과 소동맥을 이완 및 확장시켜 발기가 유발27-30)된다. 그러므로 음경해면체 혈관의 이완효과를 관찰하기 위해서 는 eNOS와 NO의 생성을 관찰해볼 필요가 있다.
- 또한 백등32)은 蜈蚣의 성기능 개선 효능을 규명하기 위해 ethanol로 발기부전을 유도한 흰쥐의 혈액 및 음경해면체를 적출하여 cGMP 및 guanylate cyclase 활성 등을 측정하고 해면체 신경 절제 실험과 같은 방법을 이용하여 음경 발기능도 측정하였으며, 손 등33)도 覆盆의 성기능 개선 효과에 대해 알기 위해 음경해면체내 활성 NOS 子과 nitrite 함량을 측정하였다. 이상의 연구들은 모두 음경해면체내 효소활성 및 내압의 증가로써 발기부전에 대한 효과를 규명하는 방법을 사용하였고, 직접적인 이완을 측정하지는 못하였다.
- MB는 cGMP 억제제로 해면체 혈관내피세포에서 생성된 NO가 평활근에서 cGMP 농도를 증가시키는 기전을 차단하여 이완을 억제시키는데37,38), MB의 전처치가 음경해면체의 이완효과에 영향을 미치지 않았으므로 연자육의 이완효과가 cGMP를 활성화시키는 기전과 관련이 없다고 생각할 수 있다. 하지만 NO의 생성으로 cGMP가 활성화 되므로 이 실험결과에 대해서는 추가적인 연구가 필요할 것으로 생각된다.
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