초록 ▼

IV. 연구개발결과

본 연구 과제를 성공적으로 수행하여 다음과 같은 주요 연구기술 및 제품을 개발하였다.

① 흑삼의 표준화 제조공정 확립
기존의 흑삼 제조방법은 구증구포 방식으로 제조시간이 오래 걸리고, 잘못 증숙하게 되면 인삼이 탄화되어 발암물질인 벤조피렌 성분이 생성되는 문제점들이 발생하였다. 본 연구는 인삼 성분의 물리·화학적 전환원리를 과학적으로 적용하여 제조시간을 단축시키고, 유효 지표사포닌인 ginsenoside Rg₃ 함량을 극대화한 흑삼을 다량 제조할 수 있는 방법을

IV. 연구개발결과

본 연구 과제를 성공적으로 수행하여 다음과 같은 주요 연구기술 및 제품을 개발하였다.

① 흑삼의 표준화 제조공정 확립
기존의 흑삼 제조방법은 구증구포 방식으로 제조시간이 오래 걸리고, 잘못 증숙하게 되면 인삼이 탄화되어 발암물질인 벤조피렌 성분이 생성되는 문제점들이 발생하였다. 본 연구는 인삼 성분의 물리·화학적 전환원리를 과학적으로 적용하여 제조시간을 단축시키고, 유효 지표사포닌인 ginsenoside Rg₃ 함량을 극대화한 흑삼을 다량 제조할 수 있는 방법을 개발하여 특허등록을 완료하였다.

② Ginsenoside 최적분석 조건 확립
HPLC를 이용한 흑삼의 유효 지표사포닌인 ginsenoside Rg₃ 성분 분석법을 확립하여 표준화된 검사방법으로 제조 흑삼의 품질을 향상시킬 수 있다.

③ 흑삼의 항산화 활성 및 Cholinesterse 억제활성 탐색
■ 백삼, 홍삼과 비교하였을 때, 흑삼은 DPPH 라디컬 소거능 활성, 페놀함량, SOD-유사활성이 유의적으로 높은 활성을 보였다.
■ Acetylcholinesterase (AChE)와 butyrylcholinesterase (BuChE) 억제활성이 백삼, 홍삼보다 높게 나타났다.

④ 흑삼의 단회독성 안전성 평가
흑삼 추출물을 5, 10, 15 g/kg 용량으로 단회 경구독성 실험을 실시한 결과, 어떠한 임상적인 독성증상도 나타나지 않았다.

⑤ 흑삼의 뇌기능 개선 효과 탐색
■ 치매유발 물질인 scopolamine투여 흰쥐의 기억개선 효과
Scopolamine 복강투여 후 실시한 행동실험 즉, passive avoidance test, Y-maze test, Morris water maze test 결과, 흑삼 추출물을 포함한 인삼 투여군에서 정상적으로 기억력이 회복되는 효과를 나타냈다.
■ Cholinergic biomarker 효소 활성 및 발현량 비교
흑삼추출물은 scopolamine투여로 증가된 뇌조직의 AChE 활성을 감소시킬 뿐 아니라, acetylcholine 합성 효소인 ChAT의 활성을 증가시켰다. Western blot 결과에서도 인삼 추출물 투여시 ChAT의 발현량이 현저히 증가되었다.
■ 흑삼은 뇌조직 항산화 효소 활성을 증가시켜 stress에 대한 뇌보호 효과가 뛰어났다.

⑥ 노화 흰쥐의 뇌기능 개선에 미치는 효과
■ 뇌기능 관련 인자의 활성 및 단백질 발현량 증가
노화 흰쥐에 흑삼 추출물을 4개월간 섭취하였을 때, cholinergic marker의 효소활성뿐 아니라, synaptic marker인 GAP-43, SNAP-25, NGF의 단백질 발현이 유의적으로 증가하였다.
■ D-galactose로 유발한 노화 흰쥐의 기억력 개선
D-galactose의 피하주사로 노화를 유발한 실험에서 흑삼을 비롯한 백삼, 홍삼 추출물은 뇌조직의 항산화 활성을 증가시키고, cholinergic marker 효소의 활성조절과 GAP-43 및 SNAP-25의 발현을 증가시켜 신경전달물질의 이용을 촉진하여 기억력 개선 효과가 있음을 보여주었다.

⑦ 흑삼을 이용한 건강기능 식품 개발
흑삼을 이용한 건강기능성 제품으로 파우치, 절편, 엑기스 제품을 개발하여 상품화하였다.

⑧ 두뇌 활성화 제품을 위한 상표출원
본 연구 결과를 바탕으로 흑삼의 뇌기능 개선효과를 부각시킬 제품 생산을 위해 2개의 상표를 출원하였다.

(출처 : 요약문 4p)

Abstract ▼

This study was conducted to develop a new method for enhancing ginsenoside Rg₃, which is abundant in black ginseng (BG) and to evaluate memory enhancing effect of processed BG using amnesic and ageing animals.

BG was prepared according to the traditional manufacfuring method："九蒸九曝"

This study was conducted to develop a new method for enhancing ginsenoside Rg₃, which is abundant in black ginseng (BG) and to evaluate memory enhancing effect of processed BG using amnesic and ageing animals.

BG was prepared according to the traditional manufacfuring method："九蒸九曝".
Ginsenoside Rg₃ was not detected in white ginseng (WG) and its content in S9WG, 6.44 mg/g, was about 53.7, 11.9, 5.0 times higher than that in 2-, 3-, 6-time repeatedly steamed ginsengs, respectively. However, the current method for preparing BG has several disadvantages such as long-term consuming production, limit to mass production, etc, which lead to the high price and poor acceptance. In order to make BG more popular and more accessible, several variables including steaming temperature, time, steaming number, etc. that affect the quality of BG were investigated. As a result, a process was developed for preparing a novel BG (6.56 mg/g). Moreover, the PAHs contamination was not detected by GC-MS in the finished BG products.
BG was also found to be fairly nontoxic when oral acute toxicity was examined in rats. However, a chronic toxicity study is needed to further support the safe use of BG.

Subsequently, it was conducted to compare antioxidant activity and effect of cholinesterases inhibition for WG, red ginseng (RG), and BG extract. RG and BG showed high inhibitory activity to both cholinesterases, such as AChE and BChE. BG exhibited the highest total phenolic content followed by WG, RG. BG showed significantly stronger activity than WG and RG on DPPH radical scavenging. BG also had the greatest XO inhibitory effect, followed by the RG, WG.

It was investigated whether administration of Korean WG, RG, and BG extracts (200 mg/kg, p.o., respectively) could protect against SCOP-induced memory impairment (2 mg/i.p.). WG, RG, and BG significantly reversed SCOP-induced memory impairment in the passive avoidance test and also reduced escape latency in training trials of the Morris water maze test. The increased AChE activity produced by SCOP was significantly inhibited by WG and RG. RG and BG significantly increased ChAT activity. SCOP administration increased oxidative damage in the brain. Treatment of amnesic mice with ginseng extracts decreased MDA levels and restored SOD and CAT activity to control levels. Treatment with WG, RG, and BG showed not only significant decrease of AChE protein expression, but also increase of ChAT protein expression in the cerebral cortex and the hippocampus of amnesic mice induced by SCOP.

It was undertaken to investigate whether long-term high (3%) and low dose (1%) of WGE, RGE and BGE diets consumption for 8 months in middle-aged mice would alter serum cholesterol levels. Especially, the 3% BG diet group showed significantly increased levels of HDL-cholesterol by 30.9% compared to the control group. ChAT activity was significantly increased to 20% in the 3% BG diet group compared with the control group. Western blot analysis revealed a significant increase of cholinergic marker (ChAT and VAChT) and synaptic marker (GAP-43 and SANP-25) and NGF protein in the 3% ginseng extract diet group compared with the control group.

This study evaluated to check whether long-term treatment with RG and BG extracts (200 mg/kg, p.o.) would result in the prevention of the memory impairment in aged mice. Ageing induces DNA damage, but RG and BG may protect DNA from damage or allow recovery of DNA in mice lymphocyte. Western blot analysis showed that the AChE, ChAT, and VAChT protein expression in the hippocampus of the RG and BG-treated mice were significantly increased as compared with the aged control mice. Significant increase in synaptic marker (GAP-43, SNAP-25) and neurotrophic factor (NGF, BDNF) protein levels were showed in the RG and BG treated group by comparison to the control group.

Ginseng extracts markedly reversed the D-galactose induced learning and memory impairment by behavioral test in Morris water maze. In order to seek the genes responsible for learning and memory, 12,060 genes were investigated in the rat hippocampus of all groups using cDNA microarray techniques. Among these genes, 276 genes were at least two-fold different compared D-galactose group to other ginseng groups and 324 genes were related to neuronal activities. The effect of ginseng extracts on improvement of cognitive deficit were related to its ability to inhibit the biochemical changes in the brain of D-galactose treated rats. Ginsengs restored SOD, catalase, GPx, Na+-K+ ATPase, ChAT activities, but decreased MAO-B, AChE activities and MDA levels in brain of D-galactose treated groups.

These results suggest that the processed BG may be useful for the cognitive improvement via regulation of the cholinergic marker, synaptic proteins and neurotrophic factors and the antioxidant defense system.

(출처 : SUMMARY 7p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 2
• 요약문 ... 3
• SUMMARY ... 7
• CONTENTS ... 9
• 목차 ... 10
• 제1장 연구개발과제의 개요 ... 16
• 제1절 연구개발의 필요성 ... 16
• 1. 기술적 측면 ... 16
• 2. 경제·산업적 측면 ... 16
• 3. 사회·문화적 측면 ... 17
• 가. 실버건강제품의 필요성 ... 17
• 나. 건강 및 기능성 식품에 대한 관심의 증가 ... 18
• 제2절 연구개발의 목적 ... 19
• 1. 연구의 목적 및 범위 ... 19
• 가. 연구의 목적 ... 19
• 나. 연구의 범위 ... 19
• 제2장 국내외 기술개발 현황 ... 20
• 제1절 국내외 연구개발 현황 ... 20
• 1. 국외의 연구개발 현황 ... 20
• 2. 국내의 연구개발 현황 ... 20
• 3. 국내·외 「기억능력 향상」 표기 건강기능식품의 예 ... 21
• 제3장 연구개발수행 내용 및 결과 ... 22
• 제1절 연구수행방법 ... 22
• 1. 구증구포 흑삼 제조와 HPLC 분석조건 확립 ... 22
• 가. 구증구포 흑삼의 제조 ... 22
• 나. 인삼 사포닌 분석 ... 22
• 2. 새로운 흑삼제조 기술 탐색 ... 22
• 가. 과일 유기산 침지방법을 이용한 흑삼의 제조 ... 22
• 나. 추출 조건에 따른 사포닌 함량 비교 ... 22
• 다. 증숙온도 및 증숙시간에 따른 혹삼의 사포닌 함량 변화 ... 22
• 라. 염기 용액 침지법을 이용한 흑삼의 제조 ... 23
• 마. 제조흑삼의 PHAs 안전성 평가 ... 23
• 3. 흑삼의 항산화 및 Cholinesterase 억제활성 탐색 ... 23
• 가. 흑삼의 제조 ... 23
• 나. 흑삼 엑기스 제조 ... 23
• 다. 흑삼 엑기스의 항산화 활성 ... 23
• (1) DPPH 라디컬 소거 활성 ... 23
• (2) SOD 유사 활성 ... 24
• (3) 폴리페놀 함량 ... 24
• 라. Cholinesterase (ChE) 억제 활성 ... 24
• 4. 화기삼, 전칠삼을 이용한 흑삼 제조 ... 25
• 가. 흑삼제조 ... 25
• 나. 화기흑삼, 전칠흑삼, 고려흑삼의 사포닌측정, 항산화 및 Cholinesterase 억제활성 ... 25
• 5. 단회투여에 의한 AChE의 억제 효과 ... 25
• 가. 실험동물 ... 25
• 나. 뇌조직의 AChE 활성 측정 ... 25
• 6. 흑삼의 독성 안전성 평가 ... 25
• 가. 실험 동물 및 처치 ... 25
• 나. Hematolgical, biochemical analyses ... 26
• 다. 뇨 검사 ... 26
• 라. 간, 신장의 조직검사 ... 26
• 7. Scopolamine에 의한 치매 동물모델에 대한 흑삼의 기억력 개선 효과 탐색 ... 26
• 가. 인삼추출물 제조 ... 26
• 나. Scopolamine을 이용한 치매 동물 유발 ... 26
• 다. 수동회피실험-Passive avoidance test ... 27
• 라. 수중미로 실험-Morris water maze ... 27
• 마. Y-미로 실험 ... 28
• 바. 뇌조직의 AChE, ChAT, 및 항산화 효소활성 ... 28
• 사. 뇌조직의 Cholienrgic marker 단백질의 발현 ... 28
• 8. 인삼 추출물의 장기 섭취가 뇌기능 개선에 미치는 흑삼의 효과 탐색 ... 29
• 가. 실험 동물 ... 29
• 나. 혈청 분석 ... 29
• 다. 뇌조직의 AChE, ChAT, 및 항산화 효소활성 ... 29
• 라. 뇌조직의 Cholienrgic marker, Synaptic plasticity, Nerve growth factor 단백질의 발현 ... 29
• 9. 노화 흰쥐의 뇌기능 개선에 미치는 흑삼의 효과 탐색 ... 29
• 가. 실험 동물 ... 29
• 나. 뇌조직의 AChE, ChAT, 및 항산화 효소활성 ... 29
• 다. 뇌조직의 Cholienrgic marker, Synaptic plasticity, Nerve growth factor 단백질의 발현 ... 30
• 10. D-galactose로 손상된 뇌기능 개선에 미치는 흑삼의 효과 ... 30
• 가. 실험 동물 ... 30
• 나. 수중 미로 실험 ... 30
• 다. 혈청과 뇌적출 ... 30
• 라. RNA 추출과 Microarray analysis ... 30
• 마. Real time-PCR를 통한 synaptic plasticity 활성 ... 30
• 바. 뇌조직의 효소 활성 및 지질 과산화물 함량 ... 31
• 11. 뇌신경세포 생성과 기억력 개선에 미치는 Ginsegnoside Rb₁의 효과 ... 31
• 가. Ginsenoside Rb₁ 투여 ... 31
• 나. Morris water maze test ... 31
• 다. BrdU protocol ... 31
• 라. 면역조직화학법 ... 31
• 마. BrdU positive cell 정량 ... 31
• 12. 통계처리 ... 32
• 제3절 연구 수행 결과 ... 33
• 1. 인삼의 뇌기능 개선 관련자료 수집 및 분석 ... 33
• 가. 주요 사포닌의 화학적 구조 ... 33
• 나. 주요 인삼 사포닌의 약리학적 기능과 기전 ... 35
• 다. Ginseng polysaccharides의 약리학적 기능 ... 38
• 라. 사포닌 전환 원리 ... 38
• 마. Ginsenoside biotransformation에 사용되는 미생물과 대사물 ... 40
• 2. 구증구포 방법에 의한 흑삼 제조 및 HPLC 사포닌 분석조건 확립 ... 42
• 가. 흑삼제조 ... 42
• 나. Ginsenoside Rg₃ 분석을 위한 HPLC 분석 조건 확립 ... 42
• (1) TLC 분석을 통한 사포닌 패턴 비교 ... 42
• ① 인삼 추출물 제조 ... 42
• ② TLC 분석 ... 43
• ③ TLC 전개용매 ... 43
• (2) Ginsenoside Rg₃의 최적 분석 조건 확립 ... 44
• 다. 증숙 횟수에 따른 사포닌 함량 변화 ... 48
• 라. 증숙횟수에 따른 ginsenoside Rg₃ 함량의 변화 ... 51
• 3. 새로운 흑삼제조 기술 탐색 ... 51
• 가. 과일 유기산 침지방법을 이용한 흑삼의 제조 ... 51
• (1) 흑삼제조 ... 51
• (2) 과일주스 침지에 따른 흑삼의 사포닌 함량 변화 ... 51
• (3) 과일주스 침지에 따른 흑삼의 ginsenoside Rg₃ 함량 비교 ... 54
• 나. 포도주스 침지를 이용한 흑삼 제조의 최적 조건 탐색 ... 54
• (1) 최적온도 조건 탐색 ... 54
• (2) 증숙온도 120℃에서 최적의 증숙시간 탐색 ... 57
• (3) 증숙 횟수에 따른 흑삼제조 (12℃, 60 min) ... 60
• 다. 염기용액에 침지하여 제조한 흑삼 (121℃, 15min) ... 62
• (1) NaHCO₃ 용액을 이용한 흑삼 제조 ... 62
• (2) 포도주스와 0.4% Citric acid에 침지 후 흑삼 제조 ... 63
• 라. 제조 흑삼의 잔류농약 안전성 평가 ... 64
• 3. 흑삼 추출물의 항산화 및 Cholinesterase 억제 효과 탐색 ... 65
• 가. 백삼, 홍삼, 흑삼의 사포닌 변화 ... 65
• 나. 흑삼 추출물의 항산화 활성 ... 67
• (1) 총 페놀 함량 ... 67
• (2) DPPH 라디컬 소거능과 Xanthine oxidase (XO) 억제활성 ... 67
• 다. 흑삼 추출물의 Cholinesterase 억제활성 ... 68
• 4. 화기삼, 전칠삼을 이용한 흑삼제조 ... 69
• 가. 흑삼제조 ... 69
• 나. 각 국 인삼 (백삼)의 사포닌 분석 ... 69
• 다. 각 국 흑삼의 사포닌 분석 ... 71
• 라. 각 국 인삼 (백삼, 흑삼)의 항산화 활성 비교 ... 73
• (1) 총 폴리페놀 함량 ... 73
• (2) DPPH 라디컬 소거활성 ... 73
• (3) Xanthine oxidase (XO) 억제활성 ... 73
• 마. 각 국 인삼의 Cholinesterase 억제활성비교 ... 75
• (1) AChE 억제활성 ... 75
• (2) BuChE 억제활성 ... 75
• 바. 흑삼 추출물의 단회 투여에 의한 뇌조직의 AChE 억제 효과 ... 77
• 5. 흑삼의 급성 독성 안전성 평가 ... 77
• 가. 실험동물의 체중 및 장기무게 ... 77
• 나. 혈액학적 분석 ... 79
• 다. 혈청학적 분석 ... 80
• 라. 뇨 검사 ... 81
• 마. 조직학적 분석 ... 81
• 6. Scopolamine에 의한 치매 동물모델에 대한 흑삼의 기억력 개선 효과 탐색 ... 82
• 가. 시료 인삼 추출물의 사포닌 함량 ... 82
• 나. Passive avoidane test -흑삼추출물의 용량별 효과 탐색 ... 83
• 다. 인삼추출물의 Passive avoidance test 효과 ... 83
• 라. Morris water maze (수중미로) 실험 ... 85
• 마. Y-maze 실험 ... 86
• 바. 뇌조직의 acetylcholinesterase (AChE), choline acetycholinesterase (ChAT) 활성 ... 87
• 사. 뇌조직의 항산화 활성 ... 88
• 아. Cholinergic marker 발현에 미치는 흑삼의 효과 - Western blot assay ... 89
• 자. Cholinergic marker 발현에 미치는 흑삼의 효과; RT-PCR ... 90
• 7. 인삼 추출물의 장기 섭취가 뇌기능 개선에 미치는 흑삼의 효과 탐색 ... 91
• 가. 체중 및 장기 무게 ... 91
• 나. 혈청학적 분석 결과 ... 92
• 다. 뇌조직의 acetylcholinesterase, choline acetyltransferase 활성 ... 93
• 라. 뇌조직의 항산화 효소 활성에 미치는 효과 ... 94
• 마. Cholinergic marker protein 발현에 미치는 효과 ... 95
• 바. GAP-43, SNAP-25, NGF 발현에 미치는 효과 ... 96
• 8. 노화 흰쥐의 뇌기능 개선에 미치는 흑삼의 효과 탐색 ... 97
• 가. 수동회피실험 ... 97
• 나. Comet assay를 통한 혈액 lymphocyte의 DNA damage ... 97
• 다. Cholinergic protein 발현에 미치는 효과 ... 98
• (1) AChE, ChAT 효소 활성 ... 98
• (2) Cholinergic protein- AChE, ChAT, VAChT 단백질 발현에 미치는 효과 ... 99
• 9. D-galactose로 유발한 노화 흰쥐의 뇌기능에 미치는 흑삼의 효과 ... 101
• 가. Morris water maze test ... 101
• 나. 뇌조직의 항산화 효소 활성 ... 101
• (1) 뇌조직의 지질과산화물 형성 ... 101
• (2) 항산화 효소 활성 ... 101
• (3) Na+-K+-ATPase activity(이미지참조) ... 101
• 다. 뇌조직의 cholinergic enzyme 및 MAO-B 활성 ... 104
• 라. Real-time PCR를 통한 GAP-43, SNAP-25의 발현 비교 ... 105
• 마. Microarray 분석결과 ... 106
• 10. 뇌신경세포 생성과 기억력 개선에 미치는 Ginsegnoside Rb₁의 효과 ... 114
• 가. Morris water maze test ... 114
• 나. 해마조직에서 세포증식에 미치는 Rb₁의 효과 ... 115
• 11. 흑삼을 이용한 건강기능 식품 개발 ... 116
• 가. 흑삼제품 개발 ... 116
• 나. 파우치 제품의 사포닌 분석 ... 116
• 다. 저장 기간 중 파우치 제품의 세균수 측정 ... 117
• 라. 제품의 관능평가 ... 117
• 바. 파우치 제품의 이화학적 특성 ... 117
• 제4장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 118
• 제5장 연구개발 성과 및 성과활용 계획 ... 121
• 제6장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 123
• 제7장 참고문헌 ... 127
• 끝페이지 ... 132