[논문]포공영(蒲公英)이 유방암 세포의 사멸에 미치는 영향

서국장; 박경미; 조성희; 양승정

doi:10.15204/jkobgy.2015.28.2.001

포공영(蒲公英)이 유방암 세포의 사멸에 미치는 영향
Effects of Taraxaci Herba on Cell Death in Breast Cancer Cells 원문보기

大韓韓方婦人科學會誌 = The Journal of Korean obstetrics & gynecology, v.28 no.2, 2015년, pp.1 - 14

서국장 (동신대학교 부인과학교실) , 박경미 (동신대학교 부인과학교실) , 조성희 (동신대학교 부인과학교실) , 양승정 (동신대학교 부인과학교실)

Abstract ▼ AI-Helper

Objectives : This study was designed to investigate the effects of Taraxaci Herba (TH) on cell death in breast cancer cells. Methods : In this experiment, the effects of TH on proliferation rates, cell morphology and growth pattern, intracellular reactive oxygen species (ROS) production. In addition, the effects on nuclear condensation, fragmentation and formation of acidic vesicular organelles (AVO) in MCF-7 cells were also investigated. Finally, autophagy related with protein was observed by using western blot method. Results : TH inhibited proliferation of MCF-7 cells, TH elevated intracellular ROS levels significantly. Treatment with TH did not affect nuclear morphologies such as condensation or fragmentation. On the other hand, TH treatment effectively induced AVO. Finally, one of autophagy related with protein, Microtubule-associated proteins 1A/1B light chain 3A (MAP1LC3A, LC3) level was elevated by treatment with TH. Conclusions : These data indicate that TH is able to be used for patient with breast cancer and mechanisms are involved in autophagy through ROS generation.

주제어

AI 본문요약
AI-Helper

문제 정의

포공영에 대한 최근 연구 발표를 살펴보면 항염 및 면역활성 등의 연구가 보고되고 있으며14-16), 간암, 폐암 등에 대한 항암 효과에 대한 연구가 보고 되고 있으나17,18) 유방암에 대한 항암 효과에 대한 기전 연구는 없었다. 이에 본 저자는 유옹치료에 쓰였던 귤엽산 처방의 구성약물이면서 청열해독작용이 있고 항염, 항산화 및 면역활성 효과가 있는 蒲公英(TH)에 대하여 유방암 세포주에 대한 항암효과와 기전을 살펴보기 위하여 본 연구를 진행하였다.
이에 저자는 蒲公英(TH)의 유방암 세포주에서의 항암효과를 살펴보기 위하여 본 연구를 진행하였으며, TH가 유방암 세포주의 증식률과 세포 증식 형태에 미치는 영향, Reactive oxygen species(ROS)에 의한 산화적 스트레스의 발생 정도, 형광 물질인 Hoechst 33342와 acridine orange를 이용하여 세포 사멸의 형태 확인, 자가포식(autophagy) 관련 단백질의 생성에 미치는 영향을 western blot법으로 관찰하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.

제안 방법

산화적 스트레스에 의하여 세포예정사가 일어날 수 있다는 사실은 잘 알려져 있다. 따라서, 본 저자는 TH에 의하여 유발되는 세포 사멸의 형태가 어떤 것인지 알아보기 위하여 형광 물질을 이용하여 세포핵의 형태와 산성 구조물의 유무를 관찰하였다. 형광 염색에 사용된 Hoechst 33342는 bisbenzimide라고 하며, 일종의 organic compound로 DNA를 염색할 수 있다.
2. 유방암 세포의 사멸을 유도하고, 형태를 비정상적으로 만들었다.3. 유방암 세포 내에서 ROS 생성을 유의한 수준으로 증가시켰으나 세포핵의 응축, 단절 등의 변화에는 특별한 영향을 미치지 않았다.

대상 데이터

Fetal bovine serum(Gibco, USA) 및 DMEM(Dulbecco’s odified Eagle Medium, high glucose, Gibco, USA)은 Life technologies(서울, 한국)를 통해 구입하여 사용하였으며, 2,7-Dichloro-fluorescein diacerate(DCFH-DA)은 Eastman Kodak(Rochester, NY, USA)에서 구입하여 사용하였다. Penicillin-streptomycin(100 units/ml, 100 μg/μl), Trypsin-EDTA, Hoechst 33342 및 기타 시약은 Sigma(St.
본 실험에 사용된 蒲公英(Taraxaci Herba, TH)은 국화과에 속한 민들레 Taraxacum mongolicum Hand Nazz.의 전초로 동신한방병원을 통하여 구입, 정제하여 사용하였다.
유방암 세포주인 MCF-7의 생육 배지로는 DMEM(Dulbecco’s odified Eagle Medium, high glucose, Gibco) 배지에 10% fetal bovine serum(Gibco, FBS)와 penicillin-streptomycin(100 units/ml, 100 μg/μl)을 첨가하여 사용하였고, 세포주의 계대 배양은 2일 간격으로 시행하였다. 부착세포의 탈착을 위해서 Trypsin-EDTA(Sigma)를 사용하였으며, 5% CO2가 공여되는 배양기 속에서 37℃를 유지하며 배양되었다.
인간 유래 악성 유방암 세포주(breast cancer cell line)인 MCF-7 cell은 한국세포주은행(서울, 한국)으로부터 냉동상태로 구입하여 사용하였다. 분주 받은 세포주는 해동되어 배양액 속에 분주된 후, 3회 이상 계대 배양하여 실험실 환경 및 기타 배양 환경에 충분히 적응시킨 후 증식률(Doubling Time)이 구입처에서 제공한 자료와 거의 일치하게 되었을 때, 충분히 적응하였다고 생각하고 실험에 사용하였다.

데이터처리

)를 이용하였다. 실험 성적은 평균±표준편차(mean±SD)로 나타내었으며, 각 실험군 간 평균의 차이를 검정할 때에는 Student’s t-test로 검정하여 p-값이 0.05 미만일 때 유의한 차이가 있는 것으로 판정하였다.

이론/모형

Autophagy 관련 유전자(autophagy-related genes, ATG)에 의하여 만들어지는 단백질 중 하나인 Microtubule-associated proteins 1A/1B light chain 3A(MAP1LC3A, LC3)의 세포내 발현 정도를 측정하기 위해 western blot 방법을 사용하였다. 먼저 100 mm dish에 1×105개의 분량으로 분주하고, 37℃, 5% CO2가 공여되는 환경에서 24시간을 배양하여 부착 및 안정화를 시행하였다.
세포 증식률에 미치는 영향은 세포수 측정 kit(Cell Counting Kit-8 kit, CCK-8, dojindo, Japan)를 이용하여 진행되었다. 먼저 96-well plate에 측정하고자 하는 대상 세포주를 웰당 5×103개의 분량으로 분주하고, 37℃, 5% CO2가 공여되는 환경에서 24시간을 배양하여 부착 및 안정화를 시행하였다.
형광 염색 물질인 Hoechst 33342를 이용하여 세포핵의 응축이나 분절을 관찰하였다. 실험 과정을 간단히 요약하면, 멸균된 cover glass(12 mm, Deckglaser, Germany)를 24-well plate에 넣고, 웰 당 1×105개의 분량으로 분주하고, 37℃, 5% CO2가 공여되는 환경에서 24시간을 배양하여 부착 및 안정화를 시행하였다.

성능/효과

또한, 1999년 이후 연평균 여성의 유방암 증가율은 6.1%로서 그 증가속도도 갑상선암 다음으로 높다1).
Hoechst 33342는 DNA의 A-T(아데닌-티민) 결합이 풍부한 곳에 결합하며 파란색 형광을 띄기 때문에 세포핵의 형태를 관찰할 수 있다36). 본 연구의 결과를 살펴보면, 농도 의존적으로 세포의 개수가 감소하였을 뿐, 세포고사의 전형적인 특징인 세포핵의 응축, 분절 등이 관찰되지 않았다(Fig. 4).
이러한 AVO는 형광 물질인 acridine orange에 의하여 형광 염색이 가능하다37,38). 본 연구의 결과에서 100 μg/ml 과 400 μg/ml 투여군에서 AVO가 관찰되었으며, 400 μg/ml에서 더 많은 AVO가 관찰되었다(Fig. 5).
본 연구의 결과에서 TH는 100 μg/ml 이상 처리에 의하여 농도 의존적으로 유방암 세포주의 증식률을 감소시켰다(Fig. 1).
5. 세포 내에서 autophagy related protein의 일종인 LC3의 발현을 증가시켰다.
1. 유방암 세포의 증식률을 유의한 수준으로 감소시켰다.2. 유방암 세포의 사멸을 유도하고, 형태를 비정상적으로 만들었다.
TH는 시험관 내에서 그리고, 인간 유래 피부 각질화 세포에서 항산화 효과를 발휘하는 것이 알려져 있다32,33). 이러한 결과를 종합적으로 고려하면, TH의 항암 효과는 산화적 스트레스에 기인하며, 저농도에서 발생하는 항산화 효과는 암세포와 정상세포에 또 다른 다양한 영향을 미칠 것임을 알 수 있다. 이는 한약재의 경우 많은 활성성분이 상호 복합적으로 작용하기 때문에 생체 내에서 다양한 반응을 보일 수 있다는 측면 때문인 것으로 생각된다.
이상의 결과로 蒲公英 추출물(TH)의 항암효과를 볼 수 있었으며, 蒲公英의 항암효과는 ROS의 생성을 통한 자가포식(autophagy)과 관련 있음을 알 수 있었다.
이상의 실험 결과에서 볼 때, TH는 유방암 세포의 증식률을 감소시키고, 유방암 세포의 세포예정사를 촉진시킬 수 있는 약물로 생각할 수 있다. 이러한 경과는 추후 유방암 환자의 치료에 참고할 수 있을 것이며, 아울러 이의 명확한 기전 탐구를 위한 후속연구가 진행되어야 할 것이다.
대표적으로 ROS에 의한 산화적 스트레스가 정상세포 및 암세포의 세포예정사에 직접적으로 관여하며, 세포고사 및 자가포식을 유발할 수 있음이 알려져 있다30,31). 이에, 본 연구에서도 TH의 세포사멸 기전과 산화적 스트레스의 연관성을 살펴본 결과 200 μg/ml 이상 농도에서 유의한 수준으로 ROS의 수준이 상승함이 관찰되었다(Fig. 3).

후속연구

이상의 실험 결과에서 볼 때, TH는 유방암 세포의 증식률을 감소시키고, 유방암 세포의 세포예정사를 촉진시킬 수 있는 약물로 생각할 수 있다. 이러한 경과는 추후 유방암 환자의 치료에 참고할 수 있을 것이며, 아울러 이의 명확한 기전 탐구를 위한 후속연구가 진행되어야 할 것이다.

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표제어: PCR

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용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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