[국내논문]C57BL/6J 마우스에서 울금(Curcuma longa L.) 추출물이 첨가된 인조쌀의 체내 지질 수준 개선 효과 Improvement Effect of Artificial Rice Containing Curcuma longa L. Extract on Lipid Parameters in C57BL/6J Mice원문보기
본 연구에서는 울금의 메탄올 추출물을 제조하고 3T3-L1 지방세포 모델을 이용하여 세포 수준에서 울금 인조쌀의 지방구 형성 조절을 통한 지질축적 억제능을 평가하였다. 더 나아가 C57BL/6J 마우스에 고지방식이와 함께 인조쌀, 울금 추출물이 첨가된 인조쌀을 공급하였을 때 체중과 지질대사의 변화를 관찰하였다. 세포 실험의 결과로부터 울금 메탄올 추출물을 처리한 후 $20{\mu}g/mL$의 농도에서 유의적인 지방구형성 억제를 관찰하였다. 동물 실험에서는 식이효율을 측정한 결과 인조쌀을 섭취한 군에서 그 효율이 낮아졌으며, 특히 울금 인조쌀을 섭취한 군에서 유의적으로 감소하였다. 부고환 지방 무게는 인조쌀 섭취군에서는 고지방섭취군과 차이를 보이지 않았지만, 울금 인조쌀을 섭취한 군에서는 유의적으로 낮아졌다. 혈청 지질 수준은 인조쌀군과 울금 인조쌀군 모두 고지방식이군에 비하여 개선되는 결과를 보였다. 혈청 중성지방은 인조쌀군과 울금 인조쌀군 모두유의적으로 낮아졌으며, 혈청 콜레스테롤 함량은 고지방식이군에 비해 인조쌀군에서 감소하는 경향을 보였고 울금 인조쌀군에서는 유의적으로 감소되었다. 이러한 결과를 통해 울금 이 첨가된 인조쌀에 다량 함유된 식이섬유소와 여러 생리활성물질이 지질대사를 개선시키고 지방 축적을 억제하여 일상식을 통한 체내 지질 수준 개선 효과를 기대해 볼 수 있을 것이라 사료된다.
본 연구에서는 울금의 메탄올 추출물을 제조하고 3T3-L1 지방세포 모델을 이용하여 세포 수준에서 울금 인조쌀의 지방구 형성 조절을 통한 지질축적 억제능을 평가하였다. 더 나아가 C57BL/6J 마우스에 고지방식이와 함께 인조쌀, 울금 추출물이 첨가된 인조쌀을 공급하였을 때 체중과 지질대사의 변화를 관찰하였다. 세포 실험의 결과로부터 울금 메탄올 추출물을 처리한 후 $20{\mu}g/mL$의 농도에서 유의적인 지방구형성 억제를 관찰하였다. 동물 실험에서는 식이효율을 측정한 결과 인조쌀을 섭취한 군에서 그 효율이 낮아졌으며, 특히 울금 인조쌀을 섭취한 군에서 유의적으로 감소하였다. 부고환 지방 무게는 인조쌀 섭취군에서는 고지방섭취군과 차이를 보이지 않았지만, 울금 인조쌀을 섭취한 군에서는 유의적으로 낮아졌다. 혈청 지질 수준은 인조쌀군과 울금 인조쌀군 모두 고지방식이군에 비하여 개선되는 결과를 보였다. 혈청 중성지방은 인조쌀군과 울금 인조쌀군 모두유의적으로 낮아졌으며, 혈청 콜레스테롤 함량은 고지방식이군에 비해 인조쌀군에서 감소하는 경향을 보였고 울금 인조쌀군에서는 유의적으로 감소되었다. 이러한 결과를 통해 울금 이 첨가된 인조쌀에 다량 함유된 식이섬유소와 여러 생리활성물질이 지질대사를 개선시키고 지방 축적을 억제하여 일상식을 통한 체내 지질 수준 개선 효과를 기대해 볼 수 있을 것이라 사료된다.
; This study investigated the improvement effects of artificial rice containing Curcuma longa L. on lipid parameters in 3T3-L1 cells and C57BL/6J mice. Mice were divided into four groups, normal diet group (ND), high-fat diet group (HD), 20% artificial group (A20), and 20% Curcuma longa L. artificia...
; This study investigated the improvement effects of artificial rice containing Curcuma longa L. on lipid parameters in 3T3-L1 cells and C57BL/6J mice. Mice were divided into four groups, normal diet group (ND), high-fat diet group (HD), 20% artificial group (A20), and 20% Curcuma longa L. artificial rice group (C20), for 14 weeks. Adipogenesis was significantly suppressed compared with non-treated control at a concentration of $20{\mu}g/mL$. After the animal experiment, food efficiency ratio was elevated in the experimental group due to high-fat diet, whereas it was reduced in the A20 group and significantly reduced in the C20 group. Epididymal fat pad weight was significantly diminished in the C20 group. In addition, serum triglycerides were significantly reduced in the A20 and C20 groups compared to the HD group. Moreover, serum cholesterol level tended to decrease in the A20 group and significantly decreased in the C20 group compared with the HD group. According to these results, we can know that Curcuma longa L.-containing artificial rice has an improvement effect on lipid metabolism.
; This study investigated the improvement effects of artificial rice containing Curcuma longa L. on lipid parameters in 3T3-L1 cells and C57BL/6J mice. Mice were divided into four groups, normal diet group (ND), high-fat diet group (HD), 20% artificial group (A20), and 20% Curcuma longa L. artificial rice group (C20), for 14 weeks. Adipogenesis was significantly suppressed compared with non-treated control at a concentration of $20{\mu}g/mL$. After the animal experiment, food efficiency ratio was elevated in the experimental group due to high-fat diet, whereas it was reduced in the A20 group and significantly reduced in the C20 group. Epididymal fat pad weight was significantly diminished in the C20 group. In addition, serum triglycerides were significantly reduced in the A20 and C20 groups compared to the HD group. Moreover, serum cholesterol level tended to decrease in the A20 group and significantly decreased in the C20 group compared with the HD group. According to these results, we can know that Curcuma longa L.-containing artificial rice has an improvement effect on lipid metabolism.
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문제 정의
현재 curcumin에 대한 연구는 많이 이루어져 있어 울금의 활성뿐만 아니라 curcumin 단독으로의 항비만, 항산화, 항염증, 항동맥경화 활성과 인슐린 민감도 증가의 효과가 보고되었다(22-24). 따라서 본 연구에서는 주식으로 사용되는 곡물에 기능성 소재로 인증 받은 울금을 첨가하여 일상식품의 체내 지질 수준의 개선 효과를 보고자 하였다.
지방세포의 수의 증가와 지방의 과잉축적은 비만의 원인이 되기 때문에 전지방세포가 지방세포로 분화되어 지방 축적을 억제하는 것은 비만을 예방하고 지질대사를 개선시키는 데 중요한 역할을 한다(29). 따라서 세포 수준에서 중성지방 축적 억제 효과가 있는 울금을 첨가한 인조 쌀의 비만관련 질환 개선 가능성을 시사하는 결과로 사료된다.
제안 방법
0.45 μm filter paper를 이용하여 여과된 추출 시료는 감압 농축(N-1000, EYELA, Tokyo, Japan) 및 동결 건조하였다.
2일 후 MDI solution(0.5 mM isobutyl- methylxanthine(IBMX), 1 μM dexamethasone, 10 μg/mL insulin)이 함유된 10% fetal bovine serum(FBS, Gibco)-DMEM 배지로 교환한 뒤 시료를 첨가하여 분화시켰다.
3T3-L1 preadipocyte를 adipocyte로 분화시켜 중성지방 함량을 측정하였다. 세포분화는 계대배양과 동일한 방법으로 탈착시켜 6-well culture plate에서 100% confluence까지 배양하였다.
대조군(adipocyte) 대비 중성지방 축적율(%)은 (시료처리군 TG량/adipocyte 대조군 TG량의 평균)×100으로 계산하였다. Oil Red O staining은 10% formalin으로 고정하고 Oil Red O staining solution을 처리한 다음 30분간 염색 후 세척하여 건조시키고 현미경 관찰하였다.
곡물가루는 200 mesh 이하로 분쇄하여 사용하였고 압출성형조건은 twin-screw extruder(Model FX100, Milling Ind, Seoul, Korea)를 사용하여 스크류 속도 300~450 rpm, 가수율 25~32%, 압출성형 온도 58~65°C 범위에서 조절, 토출구멍은 3 mm 크기의 2개의 타원형 형태이며, 1개의 절단 칼날을 이용하여 700 rpm의 속도로 칼날과 토출구 간격을 0.2 mm로 유지하여 제조하였다.
대조군(adipocyte) 대비 중성지방 축적율(%)은 (시료처리군 TG량/adipocyte 대조군 TG량의 평균)×100으로 계산하였다.
독성이 없으며 증식 억제의 효과가 있었던 두 농도(20, 500 μg/mL) 중에서 더 낮은 농도에서 효과를 보이며, 24시간 때의 세포성장률이 유의적으로 낮았던 20 μg/mL를 선택하여 분화유도 억제 효과를 관찰하였다.
분화가 유도되면 10% FBS와 insulin(10 μg/mL)이 포함된 DMEM 배지로 교환하고 시료를 처리하여 추가 배양하였고, 배지는 시료를 첨가하여 2일 마다 교환하였다.
세포 증식에 미치는 울금 인조쌀의 효과를 알아보기 위하여 EZ-Cytox(Daeil lab service) 시약을 이용하여 MTT assay를 실시하였다. 96-well culture plate에 2.
지방세포 분화 전 지방전구세포에 다양한 농도(10, 20, 40, 500, 1,000 μg/mL)의 울금 인조쌀 추출물을 처리하였다. 시료를 처리하지 않은 control군의 초기 성장률을 100% 기준으로 하고 시료 처리 후 24시간부터 72시간까지 24시간 간격으로 세포성장률을 측정하였다. 시료 처리 후 72시간 세포 증식률은 500 μg/mL 처리 시 유의적으로 감소하였으나(Fig.
실험 종료 후 희생 전에 12시간 절식시킨 후 안와채혈법으로 채혈하였으며 부고환 주변 지방조직은 채혈 후 즉시 적출하여 중량을 측정하였다. 채취한 혈액은 1시간 동안 실온 방치 후 1,200×g, 4℃에서 15분간 원심분리시켜 혈청을 분리하였다.
사육실의 온도는 22~24℃, 습도는 50~60%로 유지하였으며 명암은 12시간 주기(06:00~18:00)로 조절하여 관리하였다. 실험군은 정상식이군(ND), 고지방식이군(HD), 고지방+20% 인조쌀군(A20), 고지방+20% 울금 인조쌀군(C20)으로 나누었다. 실험사육기간 중 실험동물의 체중은 1주일에 한 번 측정하고 14주 동안 물과 식이를 자유롭게 섭취하도록 하였다.
실험군은 정상식이군(ND), 고지방식이군(HD), 고지방+20% 인조쌀군(A20), 고지방+20% 울금 인조쌀군(C20)으로 나누었다. 실험사육기간 중 실험동물의 체중은 1주일에 한 번 측정하고 14주 동안 물과 식이를 자유롭게 섭취하도록 하였다. 모든 실험은 전북대학교 실험동물윤리위원회의 승인을 얻어 실시하였다(CBNU 2015-034).
10월경 수확된 30 kg 생울금 원물(울금영농조합, 전남, 한국)을 세척한 뒤 1톤 추출탱크에서 물 300 L와 함께 65℃에서 24시간 추출한 후 농축하였고, 농축물 23 L를 동결건조기에 투입하여 분말을 획득하였다. 울금 분말은 울금 인조쌀을 섭취하였을 때 이전의 인체실험에서 효과가 있었던 수준인 하루 6 g이 섭취될 수 있게 하여 인조쌀에 2%를 첨가하였다(25).
이를 위해 분화 유도 시 울금 인조쌀 20 μg/mL를 처리하여 중성지방 농도를 측정함으로써 지방세포 분화에서의 영향을 평가하였다.
지방세포 분화 전 지방전구세포에 다양한 농도(10, 20, 40, 500, 1,000 μg/mL)의 울금 인조쌀 추출물을 처리하였다.
분화가 유도되면 10% FBS와 insulin(10 μg/mL)이 포함된 DMEM 배지로 교환하고 시료를 처리하여 추가 배양하였고, 배지는 시료를 첨가하여 2일 마다 교환하였다. 최종 분화 유도 후 배지를 완전히 제거하고 phosphate buffered saline으로 2회 세척하고 5% triton-X100으로 homogenize한 후 heating과 실온에서 식히기를 2회 반복하여 원심분리하고 상등액을 취한 뒤 희석하여 protocol에 따라 triglyceride quantification kit(Biovision Inc., Mountain View, CA, USA)으로 지방구 생성량을 측정하였다. 대조군(adipocyte) 대비 중성지방 축적율(%)은 (시료처리군 TG량/adipocyte 대조군 TG량의 평균)×100으로 계산하였다.
대상 데이터
선별, 석발 공정을 거친 현미, 쌀보리(농협 하나로 마트, 전주, 한국)를 각각 3배수의 정제수로 세척하여 탈수한 것을 롤러밀로 1차 조분쇄 후 ACM pulverizer(Model HKA 185, 한국분체기계, 인천, 한국)를 이용하여 150 mesh pass 90~98%의 입도로 분쇄하여 사용하였다. 10월경 수확된 30 kg 생울금 원물(울금영농조합, 전남, 한국)을 세척한 뒤 1톤 추출탱크에서 물 300 L와 함께 65℃에서 24시간 추출한 후 농축하였고, 농축물 23 L를 동결건조기에 투입하여 분말을 획득하였다. 울금 분말은 울금 인조쌀을 섭취하였을 때 이전의 인체실험에서 효과가 있었던 수준인 하루 6 g이 섭취될 수 있게 하여 인조쌀에 2%를 첨가하였다(25).
본 실험에서 개발한 인조쌀은 쌀보다 식이섬유 함량이 높고 칼로리가 낮은 현미가루, 보릿가루 등을 이용하여 재 성형한 쌀이다. 생강과에 속하는 다년생 초본인 울금(Curcuma longa L.
선별, 석발 공정을 거친 현미, 쌀보리(농협 하나로 마트, 전주, 한국)를 각각 3배수의 정제수로 세척하여 탈수한 것을 롤러밀로 1차 조분쇄 후 ACM pulverizer(Model HKA 185, 한국분체기계, 인천, 한국)를 이용하여 150 mesh pass 90~98%의 입도로 분쇄하여 사용하였다. 10월경 수확된 30 kg 생울금 원물(울금영농조합, 전남, 한국)을 세척한 뒤 1톤 추출탱크에서 물 300 L와 함께 65℃에서 24시간 추출한 후 농축하였고, 농축물 23 L를 동결건조기에 투입하여 분말을 획득하였다.
실험동물은 4주령의 수컷 C57BL/6J 마우스 32마리를 (주)중앙실험동물(Seoul, Korea)로부터 구입하여 1주일 동안 식이 및 동물실에 대한 적응 기간을 둔 후 난괴법(rando-mized block design)에 의해 8마리씩 4개의 군으로 나누었다. 사육실의 온도는 22~24℃, 습도는 50~60%로 유지하였으며 명암은 12시간 주기(06:00~18:00)로 조절하여 관리하였다.
정상식이(10% fat diet, D12450B)와 고지방식이(60% fat diet, D12492)는 Research Diet사(New Brunswick, NJ, USA)에서 구입하여 사용하였고, 인조쌀을 함유한 식이는 60% fat diet에 Table 1과 같이 각각의 시료를 섞은 pellet을 제작하여 동물의 식이로 사용하였다.
항비만 활성 분석에 사용되는 대표적인 cell line인 3T3-L1 preadipocyte를 American Type Culture Collection(ATCC, Manassas, VA, USA)으로부터 구입하여 10% bovine serum(BS, Gibco, Grand Island, NY, USA)과 100 U/mL penicillin-streptomycin이 포함된 DMEM 배지로 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양하였다. Confluence 80%가 되면 1 mM trypsin-EDTA(HyClone, Logan, UT, USA) 용액으로 탈착시켜 계대배양 하였으며, 배지는 2일마다 교환하였다.
데이터처리
Data are expressed as mean±SD and different letters indicate a significant difference among groups (24 h or 72 h), according to ANOVA with Duncan's multiple range test (P<0.05).
각 군 간의 통계적 유의성 검정을 위해 ANOVA를 실시하였고, 군 간의 차이는 P<0.05 수준에서 Duncan's multiple range test를 통해 검증하였다.
또한 두 그룹 간의 비교를 위하여 Independent t-tests를 실시하였다(P<0.05).
모든 실험 결과는 SPSS 12.0 package program(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하여 평균±표준편차로 표시하였다.
이론/모형
혈중 및 간 중의 중성지방(TG) 및 총 콜레스테롤(TC)은 효소법(Asan Phamaceutical Co., Seoul, Korea)으로 분석하였다.
성능/효과
14주 동안 실험 식이를 급여한 마우스의 부고환 주변 지방량을 측정한 결과는 Fig. 3과 같이 HD군이 ND군보다 유의적으로 증가하여 고지방식이로 체지방량이 유의적으로 증가함을 확인하였다. 반면 C20군에서는 고지방식이로 인해 증가된 부고환 지방량이 HD군에 비해서 유의적으로 15% 감소하였고, 인조쌀을 섭취한 A20군에서는 HD군과 유의적 차이가 없었다.
이를 위해 분화 유도 시 울금 인조쌀 20 μg/mL를 처리하여 중성지방 농도를 측정함으로써 지방세포 분화에서의 영향을 평가하였다. Fig. 2와 같이 울금 인조쌀 처리 시 대조군에 비해 유의적으로 중성지방 축적량이 감소하였고, 약 20%의 지방구 형성 감소를 나타냈다. 이는 울금에서 추출된 분획물과 curcu- min의 지방형성 억제 효과를 보고한 선행연구(27,28)와 일치하는 결과이다.
모든 실험군의 식이섭취량을 보았을 때 C20군에서 가장 높은 식이섭취량을 보였으나 고지방 섭취군 간의 체중증가량에는 유의 차이가 없었다(Table 2). 따라서 C20군의 식이 효율은 고지방식이 대조군에 비해 유의적으로 감소하였으며, A20군은 인조쌀 섭취로 식이효율이 감소하는 경향을 보였다. 이는 비만･당뇨 마우스를 이용한 실험에서 울금의 주성분인 curcumin을 경구로 섭취한 군이 고지방식이군에 비해 식이효율이 개선된 연구와 일치한 결과였다(30).
모든 실험군의 식이섭취량을 보았을 때 C20군에서 가장 높은 식이섭취량을 보였으나 고지방 섭취군 간의 체중증가량에는 유의 차이가 없었다(Table 2). 따라서 C20군의 식이 효율은 고지방식이 대조군에 비해 유의적으로 감소하였으며, A20군은 인조쌀 섭취로 식이효율이 감소하는 경향을 보였다.
시료 처리 후 72시간 세포 증식률은 500 μg/mL 처리 시 유의적으로 감소하였으나(Fig. 1), 20 μg/mL 처리 시에는 배양시간별로 증식률이 각 91%, 96%, 93%이고, 500 μg/mL 처리 시 99%, 90%, 86%로 나타났다.
인조쌀은 현미 69%, 쌀보리 26%, 구아검 1%, 비타민 4%, 그리고 울금 인조쌀은 현미 69%, 쌀보리 24%, 구아검 1%, 비타민 4%와 울금 2%의 비율로 배합한 후 믹서기에 교반하여 혼합된 원료를 쌍축압출성형기를 사용하여 성형하였다. 곡물가루는 200 mesh 이하로 분쇄하여 사용하였고 압출성형조건은 twin-screw extruder(Model FX100, Milling Ind, Seoul, Korea)를 사용하여 스크류 속도 300~450 rpm, 가수율 25~32%, 압출성형 온도 58~65°C 범위에서 조절, 토출구멍은 3 mm 크기의 2개의 타원형 형태이며, 1개의 절단 칼날을 이용하여 700 rpm의 속도로 칼날과 토출구 간격을 0.
인조쌀의 주 구성물질인 현미와 쌀보리의 높은 식이섬유 함량으로 인하여 고지방식이만을 먹은 마우스보다 인조쌀을 섭취한 마우스에서 중성지방이 낮아지고 감소하는 경향의 콜레스테롤의 수치를 보였으며, 울금을 첨가한 인조쌀은 울금의 생리활성으로 인하여 혈중 콜레스테롤 수치가 인조쌀 섭취군보다 감소하는 데 영향을 준 것으로 사료된다. 또한 울금 인조쌀을 섭취한 마우스의 중성지질 농도는 Kang 등(38)이 보고한 울금의 혈중지질개선 효과와도 유사한 결과를 보였다.
혈청 중성지질 수준은 HD군이 ND군에 비하여 유의적으로 증가하였고, A20군과 C20군은 HD군에 비하여 유의적으로 각각 12%, 15% 감소하였다(Fig. 4). 혈청 총 콜레스테롤 또한 ND군에 비하여 HD군에서 유의적으로 높아졌으나, HD군과 비교하였을 때 A20군에서 낮아지는 경향을 보였으며 C20군에서는 12% 감소하여 유의적으로 낮아지는 결과를 보였다(Fig.
4). 혈청 총 콜레스테롤 또한 ND군에 비하여 HD군에서 유의적으로 높아졌으나, HD군과 비교하였을 때 A20군에서 낮아지는 경향을 보였으며 C20군에서는 12% 감소하여 유의적으로 낮아지는 결과를 보였다(Fig. 5).
후속연구
) 메탄올 추출물을 3T3-L1 세포에 0~50 μg/mL의 농도로 처리하였을 때 50 μg/mL의 농도까지 세포독성이 나타나지 않았으므로(25) 앞의 두 농도에서는 세포독성 영향은 없는 것으로 사료된다. 독성이 없는 수준 내에서 지방전구세포 증식 억제는 지방분화 초기에 발현되는 전사인자의 억제와도 관련이 있으나(26), 울금 인조쌀이 지방분화 초기 전사인자에 미치는 영향에 대해서는 추후 연구가 필요하다.
또한 울금 인조쌀을 섭취한 마우스의 중성지질 농도는 Kang 등(38)이 보고한 울금의 혈중지질개선 효과와도 유사한 결과를 보였다. 이 결과는 울금을 활용한 기능성 식품 개발 연구에 적극 활용될 수 있을 것으로 사료된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
어떤 종류의 기능성 쌀들이 개발되고 있는가?
이와 같은 추세에 따라 기능성 쌀이 개발되고 있는데 기능성 쌀은 쌀에 기능성 물질을 첨가하거나 일부 영양성분을 강화하고 취반의 간편성을 추구한 새로운 형태의 쌀 제품군으로 정의할 수 있다(1). 현재 기능성 쌀은 품종형 기능성 쌀, 게르마늄 쌀 등과 같은 재배농법 개발을 통한 기능성 쌀, 홍국쌀과 같은 기능성 물질을 코팅한 기능성 쌀, 그리고 가공형 기능성 쌀 등이 개발되어 있다(2).
웰빙 문화와 관련된 기능성 쌀에 대한 수요가 증가하는 이유는 무엇인가?
이러한 현상은 웰빙 문화의 확산으로 두드러지게 되었다. 이는 소비자가 식품을 단순한 배를 채우기 위한 1차적인 수단으로 생각하는 것이 아니라 건강 증진을 위한 수단이라 생각하기 때문에 소비자의 심리가 쌀 시장 형태 변화의 근본적인 원인이 된 것이다(1). 이와 같은 추세에 따라 기능성 쌀이 개발되고 있는데 기능성 쌀은 쌀에 기능성 물질을 첨가하거나 일부 영양성분을 강화하고 취반의 간편성을 추구한 새로운 형태의 쌀 제품군으로 정의할 수 있다(1).
비만은 어떤 이차적인 질병을 일으키는가?
최근 트렌드에 따른 소비자 요구 및 성인병 유병률 증가 등의 이유로 건강에 대한 관심이 증대하면서 기능성 식품에 대한 수요가 지속적으로 증가하고 있다(3-5). 전 세계적으로 비만 인구는 지속적으로 증가하고 있으며(6-9), 비만은 고지혈증, 고혈압, 동맥경화증, 당뇨병 등의 2차적인 질병을 초래한다(10). 또한 고지혈증은 동맥경화증을 포함하여 심혈관질환을 유발하는 주요 원인 중 하나로 꼽히고 있다(11).
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