[논문]구강세치제에 함유된 SLS(Sodium lauryl Sulfate)가 HaCaT 세포와 NIH-3T3 세포에 미치는 독성 효과

박상례; 김영민; 최별보라; 김지영

doi:10.13065/jksdh.2015.15.04.719

구강세치제에 함유된 SLS(Sodium lauryl Sulfate)가 HaCaT 세포와 NIH-3T3 세포에 미치는 독성 효과
The effect of the cytotoxicity of sodium lauryl sulfate containing toothpaste on HaCaT and NIH-3T3 cells 원문보기

JKSDH : Journal of Korean Society of Dental Hygiene = 한국치위생학회지, v.15 no.4, 2015년, pp.719 - 725

박상례 (경남정보대학교 치위생과) , 김영민 (부산대학교 치의학전문대학원 구강해부학교실) , 최별보라 (동서대학교 치위생학과) , 김지영 (경남정보대학교 치위생과)

Abstract ▼ AI-Helper

Objectives: The purpose of this study was to determine the toxic effects of sodium lauryl sulfate(SLS) in human keratinocyte HaCaT cells and mouse fibroblast NIH-3T3 cells. Methods: The effect of sodium lauryl sulfate(SLS) cell viability and proliferation were determined by WST-1 assay and changes shape of nucleus were evaluated by Hoechst staining under fluorescence microscopy. Additionally, observation of cell morphological changes under light microscopy. Results: SLS induced cytotoxicity and a marked apoptosis in both HaCaT and NIH-3T3 cell lines. With the result of the WST-1 assay, SLS induced the cytotoxicity of 0.005% and 0.0075%, 0.01% SLS for 24 h after HaCaT and NIH-3T3 cells in time and dose-dependent manner(p<0.005). SLS inhibited cell growth and caused apoptosis as evidenced by nuclear fragmentation and condensation. Thus, determination of the morphological changes to define apoptosis was visualized using inverted phase contrast microscopy. Conclusions: SLS had toxicity of the human keratinocyte cells and mouse fibroblast cells and this study will provide the basic data for the development of proper SLS concentration in dentifrice.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구는 일상생활에서 흔히 사용되는 계면활성제인 SLS를 이용하여 사람 각질형성세포인 HaCaT 세포와 쥐의 섬유모세포인 NIH-3T3를 이용하여 SLS의 처리농도 및 시간에 따른 세포에 미치는 손상에 영향을 미치는지 확인하고자 하였다.
그러므로 구강 세치제에 함유되어 있는 SLS가 포함되어 있는 함유량에 따라 각질형성세포나 섬유모세포를 손상시키지 않는 최적의 농도를 파악하기 위한 연구가 필요하다. 본 연구자는 이러한 근거를 바탕으로 본 실험을 통하여 SLS의 농도가 사람각질형성세포인 HaCaT 세포와 쥐의 섬유모세포 NIH-3T3 세포에 적용하여 세포에 미치는 독성 효과를 확인하고자 하였다. 본 연구에서 SLS를 처리한 HaCaT 세포와 NIH-3T3 세포에서 세포 성장에 대한 저해율 확인 결과 0.
심 등⁴⁾의 연구에 의해 구강 내 타액 분비량에 미치는 영향에 대한 연구는 보고되고 있으나 keratinocyte 세포에 직접 적용하여 세포 내 독성효과를 비교 분석한 논문은 아직 부족한 실정이다. 이에 본 연구에서는 합성 계면활성제인 SLS를 농도별로 처리하여 사람 각질형성세포인 HaCaT 세포와 쥐의 섬유모세포인 NIH-3T3 세포에 미치는 독성효과와 SLS의 처리 시간에 따른 세포의 변화에 미치는 영향을 알아보고자 본 연구를 시행하였다.

제안 방법

0.0075%의 SLS를 HaCaT 세포와 NIH-3T3 세포에 처리 후 시간변화에 따른 각 세포의 형태학적 변화를 관찰하기 위하여 24, 48, 72 시간 후에 100배의 광학 현미경하에서 관찰하였다. 그 결과 HaCaT 세포의 대조군에서는 다각형의 전형적인 세포의 형태를 보이고 있으며, NIH-3T3 세포의 대조군에서는 전형적인 섬유모세포의 형태인 긴 방추형의 형태로 증식하는 것을 확인 하였다.
HaCaT 세포와 NIH-3T3 세포의 24 Well plate에 1×105로 Seeding하고, 37℃, 5%의 CO2배양기에서 24 시간 배양 후, 0.0075%의 SLS를 처리하였다.
96-well plate에서 1ⅹ10⁴의 HaCaT 세포와 NIH-3T3 세포를 접종하여 24 시간 동안 배양하였다. HaCaT 세포와 NIH-3T3 세포의 IC50 을 측정하기 위하여 각각의 well에 SLS를 농도별로 0.005%, 0.0075%, 0.01%의 농도로 24, 48, 72시간 동안 배양하였다. 세포의 생존율을 측정하기 위해 WST-1(Roche Applied Science, Mannheim, Germany) 시약을 37℃ 배양기에서 2시간 동안 반응 시켜 ELISA Reader(Sunrise Remote Control, Tecan, Austria)로 450nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
0075%의 SLS를 처리하였다. SLS 처리 후 24, 48, 72 시간 동안 처리하여, 광학현미경(OLYMPUS optical Co., Melville, NY, USA)으로 100배의 배율로 세포를 관찰하였다.
SLS가 HaCaT 세포와 NIH-3T3 세포에 세포자멸사를 유도하는지 확인하기 위하여 Hoechst 염색을 진행하였다. 0.
SLS의 독성 농도를 알아보기 위해 각 농도별로 SLS를 사람 각질형성세포 HaCaT 세포와 쥐의 섬유모세포 NIH3T3 세포에 24 시간 동안 처리하여 세포 생존률을 비교하였다. 본 실험에서 사용된 HaCaT 세포와 NIH-3T3 세포에 SLS 를 처리하지 않은 대조군은 각각 100±0%의 생존율을 나타내었으며, 0.
세포의 생존율을 측정하기 위해 WST-1(Roche Applied Science, Mannheim, Germany) 시약을 37℃ 배양기에서 2시간 동안 반응 시켜 ELISA Reader(Sunrise Remote Control, Tecan, Austria)로 450nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 각각의 분석은 독립적으로 세 번씩 반복처리 하였다.
0075%의 농도에서 각 세포에 대한 50%의 저해농도(IC50)를 나타내는 것을 확인하였다. 본 결과를 바탕으로 0.0075%의 농도를 IC50으로 하여, 처리 시간에 따른 세포 생존율을 확인하기 위해 WST-1 Assay 방법을 이용하여 24, 48, 72 시간 SLS 처리 후 각 세포에 대한 세포성장 억제 효과를 확인 하였다. 그 결과 HaCaT 세포의 대조군에서는 100±0%, 24 시간 처리 시 45.
01%의 농도로 24, 48, 72시간 동안 배양하였다. 세포의 생존율을 측정하기 위해 WST-1(Roche Applied Science, Mannheim, Germany) 시약을 37℃ 배양기에서 2시간 동안 반응 시켜 ELISA Reader(Sunrise Remote Control, Tecan, Austria)로 450nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 각각의 분석은 독립적으로 세 번씩 반복처리 하였다.
24 시간 동안 SLS를 처리한 HaCaT 세포와 NIH-3T3 세포를 수거하여 Hoechst 33258(Sigma, St, Louis, Mo, USA) 시약을 4 μg/ml의 농도로 처리한 후 37℃ humidity chamber 내에서 10분간 반응시켰다. 염색된 세포를 3회 phosphate buffered saline(PBS)로 세척하여, 형광현미경(Axioskop, Carl Zeiss, Germany)를 이용하여 관찰 후 400배의 배율로 촬영을 시행하였다.
합성계면활성제 SLS가 세포의 생존율에 미치는 효과를 확인하기 위하여 water soluble tetrazolium salts(WST)-1을 이용하였다. 96-well plate에서 1ⅹ10⁴의 HaCaT 세포와 NIH-3T3 세포를 접종하여 24 시간 동안 배양하였다.

대상 데이터

본 실험에 사용한 HaCaT 세포는 사람 각질형성세포로서 부산대학교 치의학전문대학원 구강해부학교실에서 분양 받아 사용되었다. 쥐의 섬유모세포인 NIH-3T3 세포는 한국 세포주은행(KCLB No.
사람 각질 형성세포인 HaCaT 세포는 10% fetal bovine serum(FBS), 쥐의 섬유모세포인 NIH-3T3 세포는 10% bovine calf serum(BCS), 항생제(100 μg/ml penicillin/streptomycin)을 첨가하고, 사용된 배지는 각각 Dulbecco’s modified eagle’s medium(DMEM) 배지와 Roswell Park Memorial Institute(RPMI) 1640 배지를 이용하여, 37℃, 5% CO2 배양기를 이용하여 배양 하였다.
세포의 핵 변화를 관찰하기 위하여 100mm dish에 1×106의 HaCaT 세포와 NIH-3T3 세포에 0.0075%의 농도로 SLS 처리 후 24 시간 동안 배양하였다.
본 실험에 사용한 HaCaT 세포는 사람 각질형성세포로서 부산대학교 치의학전문대학원 구강해부학교실에서 분양 받아 사용되었다. 쥐의 섬유모세포인 NIH-3T3 세포는 한국 세포주은행(KCLB No.21658)에서 분양 받아 사용 하였다. 사람 각질 형성세포인 HaCaT 세포는 10% fetal bovine serum(FBS), 쥐의 섬유모세포인 NIH-3T3 세포는 10% bovine calf serum(BCS), 항생제(100 μg/ml penicillin/streptomycin)을 첨가하고, 사용된 배지는 각각 Dulbecco’s modified eagle’s medium(DMEM) 배지와 Roswell Park Memorial Institute(RPMI) 1640 배지를 이용하여, 37℃, 5% CO₂배양기를 이용하여 배양 하였다.

데이터처리

05로 하였다. 통계처리 방법은 비모수 검정 방법인 KruskalWallis test를 사용하였으며, 사후검정법인 Tukey test를 사용하였다.

이론/모형

1. 사람 각질형성세포인 HaCaT 세포와 쥐의 섬유모세포 NIH-3T3세포에 세포 독성을 측정하기 위하여 WST-1 assay법을 이용하여 세포의 생존율을 측정하였다. WST-1 assay를 통하여 SLS 농도가 0.

성능/효과

SLS가 HaCaT 세포와 NIH-3T3 세포에 세포자멸사를 유도하는지 확인하기 위하여 Hoechst 염색을 진행하였다. 0.0075% SLS를 24 시간 처리 후 핵의 형태 확인 결과 HaCaT 세포와 NIH-3T3 세포의 대조군은 세포핵의 형태는 둥근 모양을 유지하면서 정상적인 형태를 나타내고 있으나, SLS를 처리한 실험군에서 핵의 형태가 응축되고 쪼개진 형태의 apoptotic body를 관찰할 수 있었다. 본 실험 결과 0.
0.0075%의 SLS 처리 시 HaCaT 세포와 NIH3T3 세포에서 각각 45±1.15%, 43±2.0%의 생존율을 보였으며, 0.01%의 SLS 처리 시 HaCaT 세포와 NIH-3T3 세포에서 세포 생존율이 각각 2.9±0.55%와, 0±0.28%로 농도 의존적으로 생존율이 감소하였다(p<0.05) [Fig. 1].
2. SLS가 세포의 형태에 미치는 영향을 알아보기 위해 광학 현미경을 이용하여 세포의 형태를 확인한 결과, 대조군과 비교 시 세포의 형태학적 변화가 나타남을 확인하였다.
3. SLS 처리 시 HaCaT 세포와 NIH-3T3 세포에 미치는 손상과 세포자멸사를 알아보기 위해 Hoechst 33258 염색을 실시하여 핵의 변화를 관찰한 결과, 계면활성제인 SLS 0.0075% 처리 후 시간이 증가함에 따라 핵의 응축 및 쪼개짐의 현상이 나타나며, 세포의 손상을 유도한다는 것을 확인 하였다.
NIH-3T3 세포에서 각 시간대별로 SLS 처리결과 대조군은 100±0%, 24 시간 처리 시 43.1±1.22%, 48 시간 처리 시 36.4±1.54%, 72 시간 처리 시15.5±0.57%의 생존율을 보였다(p<0.05) [Fig. 2].
SLS를 HaCaT 세포와 NIH3T3 세포에 0%, 0.005%, 0.0075%, 0.01%의 농도로 24 시간 처리 시 0.0075%의 농도에서 각 세포에 대한 50%의 저해농도(IC50)를 나타내는 것을 확인하였다. 본 결과를 바탕으로 0.
사람 각질형성세포인 HaCaT 세포와 쥐의 섬유모세포 NIH-3T3세포에 세포 독성을 측정하기 위하여 WST-1 assay법을 이용하여 세포의 생존율을 측정하였다. WST-1 assay를 통하여 SLS 농도가 0.0075%에서 IC50을 나타내는 것을 확인 하였으며, HaCaT 세포 및 NIH-3T3 세포에서 24, 48, 72 시간의 처리시간에 따라 시간 의존적으로 세포 생존율이 감소하는 것을 확인 하였다.
그 결과 HaCaT 세포의 대조군에서는 100±0%, 24 시간 처리 시 45.3±1.0%, 48 시간 처리 시 13±0.57%, 72 시간 처리 시 10.7±0.57%의 생존율을 보였다.
0075%의 SLS를 HaCaT 세포와 NIH-3T3 세포에 처리 후 시간변화에 따른 각 세포의 형태학적 변화를 관찰하기 위하여 24, 48, 72 시간 후에 100배의 광학 현미경하에서 관찰하였다. 그 결과 HaCaT 세포의 대조군에서는 다각형의 전형적인 세포의 형태를 보이고 있으며, NIH-3T3 세포의 대조군에서는 전형적인 섬유모세포의 형태인 긴 방추형의 형태로 증식하는 것을 확인 하였다. 그러나 24 시간 SLS 처리 후 형태학적 변화가 나타났으며, 48, 72 시간 처리시간이 증가함에 따라 대조군과 비교 시 세포의 부착률이 감소하여 세포의 위축과 불규칙한 형태가 확인되었다[Fig.
그 결과 HaCaT 세포의 대조군에서는 다각형의 전형적인 세포의 형태를 보이고 있으며, NIH-3T3 세포의 대조군에서는 전형적인 섬유모세포의 형태인 긴 방추형의 형태로 증식하는 것을 확인 하였다. 그러나 24 시간 SLS 처리 후 형태학적 변화가 나타났으며, 48, 72 시간 처리시간이 증가함에 따라 대조군과 비교 시 세포의 부착률이 감소하여 세포의 위축과 불규칙한 형태가 확인되었다[Fig. 4, Fig. 5].
2%의 농도보다 훨씬 낮은 농도임을 감안할 때, 피부 보호 작용을 하는 각질형성세포와 세포의 증식과 이주에 중요한 역할을 하는 섬유모세포에 손상을 주는 것을 알 수 있다. 또한, SLS를 0.0075%의 농도로 HaCaT 세포와 NIH-3T3 세포에 처리 후 광학 현미경하에서 세포의 형태를 확인한 결과 24시간 이후 세포의 부착률이 현저히 감소되고[Fig.4, Fig.5], 세포의 형태가 대조군에 비해 수축되어 있는 것이 확인되었다. 이러한 양상은 세포의 수축이나 응축 등이 세포 자멸사의 대표적인 형태임을 감안할 때^17-18), 0.
0075% SLS를 24 시간 처리 후 핵의 형태 확인 결과 HaCaT 세포와 NIH-3T3 세포의 대조군은 세포핵의 형태는 둥근 모양을 유지하면서 정상적인 형태를 나타내고 있으나, SLS를 처리한 실험군에서 핵의 형태가 응축되고 쪼개진 형태의 apoptotic body를 관찰할 수 있었다. 본 실험 결과 0.0075% SLS 처리 시 HaCaT 세포와 NIH-3T3 세포에 대한 독성 효과가 나타나는 것을 확인하였다[Fig. 3].
본 실험에서 사용된 HaCaT 세포와 NIH-3T3 세포에 SLS 를 처리하지 않은 대조군은 각각 100±0%의 생존율을 나타내었으며, 0.005% SLS 처리 시 HaCaT 세포에서 100±0.5%, NIH-3T3 세포에서 100±0.57%의 정상적인 생존율을 나타내었다.
2]. 본 연구 결과 HaCaT 세포와 NIH-3T3세포에서 0.0075% SLS 처리 시 시간 의존적인 형태로 세포의 성장을 억제시키는 것을 확인하였다.
본 연구자는 이러한 근거를 바탕으로 본 실험을 통하여 SLS의 농도가 사람각질형성세포인 HaCaT 세포와 쥐의 섬유모세포 NIH-3T3 세포에 적용하여 세포에 미치는 독성 효과를 확인하고자 하였다. 본 연구에서 SLS를 처리한 HaCaT 세포와 NIH-3T3 세포에서 세포 성장에 대한 저해율 확인 결과 0.0075% SLS 처리 시 HaCaT 세포에서 45.2%, NIH-3T3 세포에서 43.1%의 생존율을 보였다 [Fig. 1]. 이러한 결과는 치약에서 흔히 사용되는 2.
1]. 이러한 결과는 치약에서 흔히 사용되는 2.2%의 농도보다 훨씬 낮은 농도임을 감안할 때, 피부 보호 작용을 하는 각질형성세포와 세포의 증식과 이주에 중요한 역할을 하는 섬유모세포에 손상을 주는 것을 알 수 있다. 또한, SLS를 0.

후속연구

그러므로 본 연구는 세포에 손상을 일으키지 않고 구강 세치제에 함유될 수 있는 SLS의 적정농도에 대한 기초자료서 제시할 수 있을 것으로 생각된다. 그러나 본 연구의 한계점으로서 어떠한 기전에 의해 세포가 손상되는지에 대한 자세한 세포생물학적 연구가 수반되어야 하며 in vitro에서 시행한 실험 결과를 바탕으로 하여 동물실험을 통한 in vivo 실험 등을 시행하여 보다 면밀한 분석을 통해 SLS의 인체 내 안전성에 대한 연구가 지속적으로 수행되어야 할 것이다.
그러므로 본 연구는 세포에 손상을 일으키지 않고 구강 세치제에 함유될 수 있는 SLS의 적정농도에 대한 기초자료서 제시할 수 있을 것으로 생각된다. 그러나 본 연구의 한계점으로서 어떠한 기전에 의해 세포가 손상되는지에 대한 자세한 세포생물학적 연구가 수반되어야 하며 in vitro에서 시행한 실험 결과를 바탕으로 하여 동물실험을 통한 in vivo 실험 등을 시행하여 보다 면밀한 분석을 통해 SLS의 인체 내 안전성에 대한 연구가 지속적으로 수행되어야 할 것이다.
물론 현재 시판중인 구강 세치제의 경우 구성성분 및 함유량 및 농도에 대한 안전성을 충분히 검증 후 판매가 되고 있으나 시중에 나와 있는 치약의 종류가 많아 일반인들이 치약에 포함되어 있는 계면활성제의 종류나 농도를 제대로 인지하기가 어려운 실정이다. 그러므로 치약에 포함되어 있는 계면활성제의 종류나 용량을 엄격하게 지도하고, 사용방법과 함께 치약 사용 후 주의 사항에 대한 충분한 홍보가 수반되어야 할 것이다.
이상의 연구 결과 최근 연구에서 계면활성제가 인체에 영향을 미치는 연구가 보고되고 있으나, 본 연구를 통하여 손상을 일으키는 농도의 확인과 SLS가 사람 각질형성세포 및 쥐의 섬유모세포에 손상을 일으킨다는 것을 확인함으로써 인체의 계면활성제 사용의 적정 농도의 기준점을 제시할 것으로 사료된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	우리가 일상에서 사용하는 화장품 및 다양한 세정제 중에서 어떠한 것들에 계면활성제가 포함되어 있는가?	오늘날 산업 발달로 인한 소득 및 생활수준의 향상으로 인해 사람들의 미(美)에 대한 관심도는 급격히 증가하고 있다. 이러한 미에 대한 관심을 충족시키기 위하여 화장품 및 다양한 세정제가 개발되기 시작하였으며, 우리가 일상생활에서 흔히 사용되는 화장품, 샴푸, 바디 클렌져, 비누, 치약 등에는 다양한 계면활성제가 함유되어 있다1). 계면활성제는 계면의 장력을 저하시키며 물에 녹는 친수성과 기름에 녹는 소수성의 특징을 가지고 있는 화학물질로 이루어져 있다2).
	계면활성제는 무엇으로 이루어져있나?	이러한 미에 대한 관심을 충족시키기 위하여 화장품 및 다양한 세정제가 개발되기 시작하였으며, 우리가 일상생활에서 흔히 사용되는 화장품, 샴푸, 바디 클렌져, 비누, 치약 등에는 다양한 계면활성제가 함유되어 있다1). 계면활성제는 계면의 장력을 저하시키며 물에 녹는 친수성과 기름에 녹는 소수성의 특징을 가지고 있는 화학물질로 이루어져 있다2). 또한, 구강세치제로 매일 사용하고 있는 치약의 주성분인 세제(detergent)에도 계면활성제가 포함되어 있으며, 이러한 계면 활성제는 치면에 부착되어 있는 치면세균막에 침투하여 부화시키거나 부유시켜 유기물을 제거하는 역할을 한다3).
	Sodium lauryl sulfate의 문제점은 무엇인가?	SLS는 음이온 계면 활성제로서 치면세균막의 표면에 흡착하여 표면장력을 감소시켜 이물질이 잘 떨어지게 하여 치아 표면을 깨끗하게 하는 역할을 한다4,5). 그러나 미국 독성학 연구 보고서에 의하면 SLS는 피부를 통하여 쉽게 흡수되며, 심장, 간, 폐 등의 주요 장기에 일정 기간 머무는 것으로 알려져 있으며, 화학 계면활성제인 SLS가 오랜 시간 사용하여 체내에 축적될 경우 체내 유전자 변형이나 만성질환 등을 일으킬 수 있다고 보고되고 있다6). 여기서 주목해야 할 점은 대부분의 치약에서 계면활성제인 SLS가 함유되어 있는 점이라 할 수 있다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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