유전자 마커를 이용한 하수오, 백수오 및 이엽우피소 종 판별법 개발 Development of Primer Sets for the Detection of Polygonum multiflorum, Cynanchum wilfordii and C. auriculatum원문보기
본 연구에서는 건강기능성 식품원료로서 이용 빈도가 증가하고 있는 하수오, 백수오 및 이엽우피소에 대한 종 특이 프라이머를 개발하였다. 개발된 종 특이 프라이머는 하수오, 백수오 및 이엽우피소에 대해 원물뿐만 아니라 육안 확인이 어려운 가공식품 등을 대상으로 사용원료의 진위여부를 빠르고 정확하게 확인할 수 있었다. 따라서 본 연구에서 개발한 종 특이 PCR방법은 기존의 일반 프라이머를 사용하는 방법이 가지고 있는 식품 적용 한계를 극복할 수 있을 것이라고 판단하였다.
본 연구에서는 건강기능성 식품원료로서 이용 빈도가 증가하고 있는 하수오, 백수오 및 이엽우피소에 대한 종 특이 프라이머를 개발하였다. 개발된 종 특이 프라이머는 하수오, 백수오 및 이엽우피소에 대해 원물뿐만 아니라 육안 확인이 어려운 가공식품 등을 대상으로 사용원료의 진위여부를 빠르고 정확하게 확인할 수 있었다. 따라서 본 연구에서 개발한 종 특이 PCR방법은 기존의 일반 프라이머를 사용하는 방법이 가지고 있는 식품 적용 한계를 극복할 수 있을 것이라고 판단하였다.
The aim of this study was to develop rapid screening method for the identification of Chinese herbal medicine species with similar appearance, Polygonum multiflorum, Cynanchum wilfordii and C. auriculatum, by using genetic markers. As a genetic marker, psbA-trnH gene in chloroplast was selected due ...
The aim of this study was to develop rapid screening method for the identification of Chinese herbal medicine species with similar appearance, Polygonum multiflorum, Cynanchum wilfordii and C. auriculatum, by using genetic markers. As a genetic marker, psbA-trnH gene in chloroplast was selected due to differences in sequence among the three species. Species-specific primers were designed based on the sequences of the marker gene of P. multiflorum, C. wilfordii, and C. auriculatum, and the expected size of PCR products was 160, 147, and 119 bp, respectively. Under the developed conditions, cross-reaction was not detected among these three plant species. To confirm the efficiency of our species-specific primers, the optimized method was applied to a variety of processed products composed of mostly P. multiflorum and C. wilfordii, demonstrating that our method was a rapid and easy screening assay. Our findings suggest this screening method can be utilized to prevent the distribution of economically motivated adulteration food and to improve consumer's right.
The aim of this study was to develop rapid screening method for the identification of Chinese herbal medicine species with similar appearance, Polygonum multiflorum, Cynanchum wilfordii and C. auriculatum, by using genetic markers. As a genetic marker, psbA-trnH gene in chloroplast was selected due to differences in sequence among the three species. Species-specific primers were designed based on the sequences of the marker gene of P. multiflorum, C. wilfordii, and C. auriculatum, and the expected size of PCR products was 160, 147, and 119 bp, respectively. Under the developed conditions, cross-reaction was not detected among these three plant species. To confirm the efficiency of our species-specific primers, the optimized method was applied to a variety of processed products composed of mostly P. multiflorum and C. wilfordii, demonstrating that our method was a rapid and easy screening assay. Our findings suggest this screening method can be utilized to prevent the distribution of economically motivated adulteration food and to improve consumer's right.
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문제 정의
본 연구에서는 하수오, 백수오 및 이엽우피소의 종 판별을 위하여 엽록체 내 psbA-trnH 유전자를 대상으로 종 특이적 프라이머를 개발하였고 최적의 PCR 조건을 확립하였다. 또한, 개발된 판별법을 다양한 형태로 가공된 하수오, 백수오 원료 및 제품에 적용하여 그 효율성을 확인하였다.
시중에 판매되고 있는 백수오 및 하수오 제품을 대상으로 본 연구에서 개발한 진위 판별법을 적용하기 위하여 유전자를 추출하였다. 하지만 가공 공정에 따른 가열 및 강압으로 DNA가 파괴 및 손실 됨에 따라 추출된 DNA양이 0.
제안 방법
최종 산물의 확인은 반응액 5 µl를 취하여 EtBr이 첨가된(1 µl/ml) 아가로즈 젤로 100 V, 30분간 전기영동 하였다. PCR 산물의 크기 확인은 100 bp DNA ladder (Bioneer, Korea)를 사용하였으며, 전기영동 완료 후 UV 투영기를 이용하여 결과를 확인하였다.
PCR을 위한 반응액의 조성은 추출한 주형 DNA 20~100 ng/µl, dNTPs 200 µM, MgCl2 2.0 mM 그리고 0.5 µM 의 정방향 및 역방향 프라이머 각각 1 µl를 혼합하였으며, 최종 용량은 20 µl가 되도록 증류수를 첨가하였다.
1 ng/µl 이하로 PCR이 불가능 하였다. 따라서, PCR로 증폭이 가능한 DNA 단편들의 양을 증가시키고, PCR 반응을 저해 할 수 있는 물질들의 비율을 감소시키기 위해 유전자의 단순 증폭 실험을 추가 진행 하였다. 본 실험에서는 유전자의 단순 증폭을 하기 위하여 Whole Genome Amplification kit (WGA, Sigma, USA)를 사용하였다.
또한 건강기능식품 등과 같은 가공식품의 경우 고온, 강압 등의 단계를 거쳐 제조·가공되므로 가공 시 발생하는 DNA 절단 및 파괴 등의 손상을 고려하여 PCR 산물의 크기는 200 bp 내외가 되도록 프라이머를 설계하였고, 이를 이용하여 PCR 조건을 최적화 하였다(Table 1).
또한 이엽우피소의 검출 한계를 확인 하기 위하여 이엽우피소 DNA 20 ng/µl 를 10배 단위로 희석하여 PCR실험을 진행하였다.
본 연구에서는 하수오, 백수오 및 이엽우피소의 종 판별을 위하여 엽록체 내 psbA-trnH 유전자를 대상으로 종 특이적 프라이머를 개발하였고 최적의 PCR 조건을 확립하였다. 또한, 개발된 판별법을 다양한 형태로 가공된 하수오, 백수오 원료 및 제품에 적용하여 그 효율성을 확인하였다.
따라서, PCR로 증폭이 가능한 DNA 단편들의 양을 증가시키고, PCR 반응을 저해 할 수 있는 물질들의 비율을 감소시키기 위해 유전자의 단순 증폭 실험을 추가 진행 하였다. 본 실험에서는 유전자의 단순 증폭을 하기 위하여 Whole Genome Amplification kit (WGA, Sigma, USA)를 사용하였다. 실험 방법은 제조사에서 제공하는 방법에 따라 증폭을 수행하였고, 최종 증폭된 산물은 AccuPrep® PCR Purification Kit (Bioneer, Korea)를 이용하여 정제한 후 종 특이 프라 이머를 이용한 진위 판별 PCR실험에 사용하였다.
하지만 유전자 내 변이가 적은 rbcL, ITS의 경우 하수오와 백수오의 종간 구분은 가능했지만, 백수오 및 이엽우피소와 같은 근연종의 경우 염기서열 차이가 적어 종 특이 프라이머 설계에 적용하기가 어려웠다. 본 연구에서는 엽록체 유전자 중 종간 염기서열 차이가 분명하여 하수오, 백수오 및 이엽우피소의 구별이 가능한 psbA-trnH를 마커 유전자로 선택하고 종 특이 프라이머를 설계하였다2,18,22,26). 또한 건강기능식품 등과 같은 가공식품의 경우 고온, 강압 등의 단계를 거쳐 제조·가공되므로 가공 시 발생하는 DNA 절단 및 파괴 등의 손상을 고려하여 PCR 산물의 크기는 200 bp 내외가 되도록 프라이머를 설계하였고, 이를 이용하여 PCR 조건을 최적화 하였다(Table 1).
실험 방법은 제조사에서 제공하는 방법에 따라 증폭을 수행하였고, 최종 증폭된 산물은 AccuPrep® PCR Purification Kit (Bioneer, Korea)를 이용하여 정제한 후 종 특이 프라 이머를 이용한 진위 판별 PCR실험에 사용하였다.
종 특이 프라이머 설계를 위해 미국 국립보건원에서 운영하는 유전자 은행에 등록되어 있는 하수오, 백수오 및 이엽우피소에 대한 엽록체와 핵 내 유전 정보를 확인하였다. 유전자 은행에 유전 정보가 없는 백수오의 ITS유전자, 이엽우피소의 trnH-psbA유전자의 경우 일반 프라이머(universal primer)를 이용하여 유전자를 증폭한 후 염기서열을 결정하고 그 결과를 비교하여 종 특이 프라이머를 설계하였다. 설계한 프라이머는 바이오니아(Bioneer, Korea)에 의뢰하여 합성하였다(Table 1).
종 특이 프라이머 설계를 위해 미국 국립보건원에서 운영하는 유전자 은행에 등록되어 있는 하수오, 백수오 및 이엽우피소에 대한 엽록체와 핵 내 유전 정보를 확인하였다. 유전자 은행에 유전 정보가 없는 백수오의 ITS유전자, 이엽우피소의 trnH-psbA유전자의 경우 일반 프라이머(universal primer)를 이용하여 유전자를 증폭한 후 염기서열을 결정하고 그 결과를 비교하여 종 특이 프라이머를 설계하였다.
최종 산물의 확인은 반응액 5 µl를 취하여 EtBr이 첨가된(1 µl/ml) 아가로즈 젤로 100 V, 30분간 전기영동 하였다.
표준시료를 이용하여 혼합 시 결과를 확인하기 위해 가루 형태의 백수오에 이엽우피소를 0%, 0.5%, 1%, 2%, 5%, 10%, 50% 비율(w/w)로 혼합하여 각각의 유전자를 추출하였고, 제품 중 즙 형태의 경우 20,000 × g에서 5분간 원심분리하여 상등액을 제거한 후 침전물만을 건조하여 시료로 사용하였다.
하수오, 백수오 및 이엽우피소의 종 특이 프라이머를 설계하기 위하여 식물의 분자계통분류학적 연구에 유전자 마커로 주로 이용되고 있는 rbcL, psbA-trnH 그리고 ITS 등의 유전자 염기서열을 비교 하였다. 하지만 유전자 내 변이가 적은 rbcL, ITS의 경우 하수오와 백수오의 종간 구분은 가능했지만, 백수오 및 이엽우피소와 같은 근연종의 경우 염기서열 차이가 적어 종 특이 프라이머 설계에 적용하기가 어려웠다.
대상 데이터
유전자증폭을 위해 Taq. DNA polymerase 및 dNTPs, MgCl2은 Takara사(Japan)에서 구매하였고, PCR 장비는 C1000 TouchTM Thermal Cycler (Bio-RAD Laboratories, Inc. USA)을 사용하였다. 본 연구에서 개발된 종 특이 프라이머의 염기서열 및 검출을 위한 최적의 PCR 반응조건은 Table 2에 나타내었다.
본 연구에서 사용된 하수오(P. multiflorum), 백수오(C. wilfordii) 및 이엽우피소(C. auriculatum) 3종은 식품의약품안전평가원 생약연구과에서 제공받아 표준시료로 사용하였으며, 프라이머의 적용 실험에 사용된 하수오 제품(4종), 백수오 제품(5종)은 제품 형태별 무작위 선별 후 구입하여 이용하였다. 표준시료를 이용하여 혼합 시 결과를 확인하기 위해 가루 형태의 백수오에 이엽우피소를 0%, 0.
하수오, 백수오 및 이엽우피소 종 특이 판별법의 가공식품 적용성을 확인하기 위해 시중에 판매중인 가공식품 9건(하수오 제품 4건, 백수오 제품 5건)을 무작위 선별 후 구매하여 분석하였다. 제조공정 중 발생할 수 있는 고온 및 고압으로 인하여 소량의 유전자가 추출 되었으며(0.
이론/모형
유전자 추출은 DNeasy Plant mini kit (Qiagen GmbH, Hilden, Germany)를 사용하였고, 추출 방법은 제조사에서 제공하는 방법에 따라 추출하였다.
성능/효과
각각의 종 특이 프라이머를 사용하여 최적화 된 조건으로 PCR을 수행한 결과, 하수오(P. multiflorum), 백수오(C. wilfordii), 이엽우피소(C. auriculatum)에서 각각 160, 147, 119 bp의 예상된 크기의 증폭 산물을 확인 할 수 있었고, 각각의 대상 종 이외의 비교 종에서 비 특이적 밴드는 생성되지 않았다(Fig. 1). 또한, 백수오와 이엽우피소 혼합 실험에서는 2% 이상의 이엽우피소가 혼합 되었을 때 개발된 종 특이 PCR방법으로 이엽우피소 유전자를 검출할 수 있었으며(Fig.
하수오 제품의 경우 즙 형태 및 분말형태에서 모두 하수오의 유전자가 확인되었는데, 2개의 제품에서 백수오 유전자도 확인이 되었다. 또한, 모든 백수오 제품에서 백수오 유전자가 확인 되었으며 1개의 즙 형태 제품에서 하수오 유전자가 확인 되었다. 반면, 모든 하수오 및 백수오 제품에서 이엽우피소 유전자는 확인되지 않았다.
또한, 백수오와 이엽우피소 혼합 실험에서는 2% 이상의 이엽우피소가 혼합 되었을 때 개발된 종 특이 PCR방법으로 이엽우피소 유전자를 검출할 수 있었으며(Fig. 2), 최적화된 PCR 조건하에서 이엽우피소의 검출 한계는 0.2 ng/µl 이었다.
반면, 모든 하수오 및 백수오 제품에서 이엽우피소 유전자는 확인되지 않았다. 본 연구를 통하여 개발된 종 특이 프라이머는 하수오, 백수오 및 이엽우피소의 원료 및 가공품을 대상으로 향상된 종 판별법을 보였으나, 정성분석법의 한계상 일부 백수오 및 하수오 가공품에서 보여진 교차 확인 사례의 원인은 동일한 생산라인의 사용으로 인한 비의도적 혼입인지 또는 단가를 절감하기 위한 의도적 혼합인지는 판단 할 수 없었다.
하수오, 백수오 및 이엽우피소 종 특이 판별법의 가공식품 적용성을 확인하기 위해 시중에 판매중인 가공식품 9건(하수오 제품 4건, 백수오 제품 5건)을 무작위 선별 후 구매하여 분석하였다. 제조공정 중 발생할 수 있는 고온 및 고압으로 인하여 소량의 유전자가 추출 되었으며(0.1 ng/ul 이하), 추출된 DNA 양은 제품의 유형(즙, 분말 등)에 따라 차이가 있었다. 때문에 WGA kit를 이용하여 추출된 DNA를 단순 증폭 후 종 특이 PCR실험에 사용하였으며 결과를 Table 3에 정리하였다.
때문에 WGA kit를 이용하여 추출된 DNA를 단순 증폭 후 종 특이 PCR실험에 사용하였으며 결과를 Table 3에 정리하였다. 하수오 제품의 경우 즙 형태 및 분말형태에서 모두 하수오의 유전자가 확인되었는데, 2개의 제품에서 백수오 유전자도 확인이 되었다. 또한, 모든 백수오 제품에서 백수오 유전자가 확인 되었으며 1개의 즙 형태 제품에서 하수오 유전자가 확인 되었다.
후속연구
하지만 본 연구에서 개발한 유전자 분석법은 의도적/비의도적 혼입에 대한 정확한 판단이 어렵다는 한계가 있어, 추후 종 특이 프라이머를 이용한 정량분석법 개발 등의 보안이 필요하다. 따라서 이러한 사항이 보안되어 개발된 판별법을 활용한다면, 건전한 식품제조업체를 보호하고 정확한 표시사항 준수를 통한 소비자 보호와 불량식품 근절에 적극 활용될 수 있을 것으로 사료된다.
본 연구에서 개발된 하수오, 백수오 및 이엽우피소에 대한 종 특이 프라이머는 육안으로 사용원료의 확인이 어려운 가공식품 등을 대상으로 간단하고 정확하게 특정 사용 원료의 진위 여부를 확인할 수 있다. 또한 식품의 가공 중 발생 할 수 있는 유전자 손상을 고려하여, 최종 증폭 산물의 크기를 200 bp 내외가 되도록 프라이머를 설계하였으며, 이는 일반 프라이머가 가지고 있는 가공식품 적용 한계를 극복할 수 있을 것이라 판단된다. 하지만 본 연구에서 개발한 유전자 분석법은 의도적/비의도적 혼입에 대한 정확한 판단이 어렵다는 한계가 있어, 추후 종 특이 프라이머를 이용한 정량분석법 개발 등의 보안이 필요하다.
본 연구에서 개발된 하수오, 백수오 및 이엽우피소에 대한 종 특이 프라이머는 육안으로 사용원료의 확인이 어려운 가공식품 등을 대상으로 간단하고 정확하게 특정 사용 원료의 진위 여부를 확인할 수 있다. 또한 식품의 가공 중 발생 할 수 있는 유전자 손상을 고려하여, 최종 증폭 산물의 크기를 200 bp 내외가 되도록 프라이머를 설계하였으며, 이는 일반 프라이머가 가지고 있는 가공식품 적용 한계를 극복할 수 있을 것이라 판단된다.
multiflorum Thunberg)와 식물분류학적 위치와 유효성분이 서로 다름에도 불구하고 우리나라의 생약시장, 민간요법 및 임상에서 하수오라는 이름으로 혼용됨으로써 큰 혼란이 야기되는 생약이다. 뿐만 아니라 백수오(은조롱)와 이엽우피소는 박주가리(Metaplexis japonica Makino)와 성숙기의 열매와 종자가 매우 유사하여 생약에 관심을 갖는 이들에게 혼동을 야기시키므로 이들을 정확히 구분할 수 있는 식별방법(識別方法) 개발이 필요하다. 백수오의 이명을 백하수오라 하여 하수오로 오용되기도 했으나 백수오와 하수오는 기원과 함유 성분이 전혀 다르므로 혼동해서는 안 된다.
또한 식품의 가공 중 발생 할 수 있는 유전자 손상을 고려하여, 최종 증폭 산물의 크기를 200 bp 내외가 되도록 프라이머를 설계하였으며, 이는 일반 프라이머가 가지고 있는 가공식품 적용 한계를 극복할 수 있을 것이라 판단된다. 하지만 본 연구에서 개발한 유전자 분석법은 의도적/비의도적 혼입에 대한 정확한 판단이 어렵다는 한계가 있어, 추후 종 특이 프라이머를 이용한 정량분석법 개발 등의 보안이 필요하다. 따라서 이러한 사항이 보안되어 개발된 판별법을 활용한다면, 건전한 식품제조업체를 보호하고 정확한 표시사항 준수를 통한 소비자 보호와 불량식품 근절에 적극 활용될 수 있을 것으로 사료된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
종 특이 프라이머를 이용한 PCR법은 어떤 목적으로 이용되는가?
분자생물학 및 유전자 분석 기술의 발달로 Polymerase Chain Reaction (PCR)을 통해 DNA 염기서열 차이를 이용한 종 판별이 가능하게 되었다. 특히, 종 특이 프라이머를 이용한 PCR법은 종간 판별은 물론 동종 내에서의 판별이 가능한 방법으로 식품원료 진위 판별에 주로 이용되고 있다16,23-25). 유전자는 모든 동·식물의 조직 내에 존재하며 식품 제조·공정 중 처리되는 압력, 고열 등에 대한 안정성이 단백질 보다 비교적 높은 장점이 있다.
식품 진위 판별에 유전자는 단백질과 다른 어떤 장점을 갖는가?
특히, 종 특이 프라이머를 이용한 PCR법은 종간 판별은 물론 동종 내에서의 판별이 가능한 방법으로 식품원료 진위 판별에 주로 이용되고 있다16,23-25). 유전자는 모든 동·식물의 조직 내에 존재하며 식품 제조·공정 중 처리되는 압력, 고열 등에 대한 안정성이 단백질 보다 비교적 높은 장점이 있다. 유전자를 이용하는 방법 중 일반 프라이머를 이용하여 특정 유전자 영역을 증폭한 후 염기서열 분석을 통해 정확한 종 판별하는 것이 가장 일반적인 방법이지만, 염기서열 분석 시간이 비교적 길고, 유전자은행과 같은 데이터베이스에 염기서열 정보가 등록되어 있지 않으면 정확한 시료 동정이 어렵다.
열처리 가공식품에서의 식품원료 종 판별 시 일반 프라이머를 이용하면 어떤 한계점이 있는가?
유전자를 이용하는 방법 중 일반 프라이머를 이용하여 특정 유전자 영역을 증폭한 후 염기서열 분석을 통해 정확한 종 판별하는 것이 가장 일반적인 방법이지만, 염기서열 분석 시간이 비교적 길고, 유전자은행과 같은 데이터베이스에 염기서열 정보가 등록되어 있지 않으면 정확한 시료 동정이 어렵다. 또한 비교적 긴 주형 DNA를 요구하기 때문에 열로 인해 DNA 손상 가능성이 있는 열처리 가공식품에서의 식품원료 종 판별에 한계가 있다. 최근 종 특이 프라이머를 이용한 종 판별법에 대한 관심이 높아지고 있는데, 특정 유전자 염기서열에만 반응하여 증폭시키는 프라이머를 개발하여 식품 중 식물성 원료의 진위 여부를 판단하는데 이용된다1,17,19,20,26,27).
참고문헌 (27)
Chase M.W., Cowan R.S., Holling sworth P.M., Van den Berg C. and Madrinan S.: A proposal for a standardised protocol to barcode all land plants. Taxon, 56, 295-299 (2007).
Chen S., Yao H., Han J., Liu C., Song J., Shi L., Zhu Y., Ma X., Gao T., Pang X., Luo K., Li Y., Li X., Jia X., Lin Y. and Leon C.: Validation of the ITS2 region as a Novel DNA barcode for identifying medicinal plant species., PLoS One, 5, e8613 (2010).
Choi H.S., Zhu M.F., Kim C.S. and Lee J.H.: Studies of name and herbal origins of Ha-Soo-Oh. Korean Journal of Oriental Medicine, 9, 81-91 (2003).
Focke F., Haase I. and Fischer M.: DNA-Based identification of Spices: DNA Isolation, Whole Genome Amplification, and Polymerase Chain Reaction. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 59, 513-520 (2011).
Han J., Luan D.H.: Sow abortion caused by feeding Cynanchum auriculatum. Anim Husb Vet Med Xumu yu Shouyi, 16(6), 266 (1984).
Harmer J.E., Farrall L., Ortach M.J., Valent B. and Chunmley F.G.: Host species-specific conservation of a family of repeated sequence in the genomic of a fungal plant pathogen. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 86, 9981-9985 (1989).
Hebert P.D.N., Cywinska A., Shelley L.B. and Jeremy R.: Biological identifications through DNA Barcodes. Proceedings of the Royal Society of London, Series B, 270, 313-321 (2003).
Herbert P.D.N., Retnasingham S., and DeWaard J.R.: Barcoding animal life: cytochrome c oxidase subunit 1 divergences among closely related species., Proceedings of the Royal Society of London, Series B, 270, 96-99 (2003).
Hwang T.Y., Seo M.J., Lee S.K., Park H.M., Jeong K.H., Lee Y.Y., Kim S.L., Yuu H.T., Lee J.E. and Kim D.W.: Discrimination of 110 Korean soybean cultivars by sequence tagged sites(STS)-CAPS markers. Korean Journal of Breeding Science, 3, 258-272 (2012).
Innocenzo M., Massimiliano P. and Enzo P.: Detection of DNA in virgin olive oils extracted from destoned fruits. European Food Research and Technology, 224, 469-475 (2007).
Jo I.H., Bang K.H., Kim Y.C., Kim J.U., Shin M.R., Moon J.Y., Noh B.S., Hyun D.Y., Kim D.H., Cha S.W. and Kim H.S.: Analysis of mitochondrial DNA sequence and molecular marker development for identification of Panax species. Korean Journal of Medicinal Crop Sciences, 21, 91-96 (2013).
Kim H.K., Kim Y.A., Lee A.Y. and Ko B.S.: Pattern analysis of Cynanchi wilfordi Radix and Polygoni multiflori Radix. Korea Journal of Pharmacognosy, 34(4), 278-281 (2003).
Kim M.J., Song B.H., Nam S.Y, Kim I.J., Lee C.H. and Yun T.: Effects of non-supporting methods on growth and yield of Cynanchum auriculatum Royle ex Wight. Korean Journal of Medicinal Crop Sciences, 13, 268-272 (2005).
Kim M.J., Kim I.J., Choi S.Y., Han D.H., Kim Y.H., Lim S.C., Kim T.J., Nam S.Y., Song B.H., Oh B.U. and Park C.G.: Comparison of Cynanchum wilfordii, C. auriculatum, Metaplexis japonica and Polygonum multiflorum by morphological characters. Korean Journal of Medicinal Crop Sciences, 22, 113-120 (2014).
Kim M.K., Wang H., Kim Y.j., Sathiyamoorthy S., Kwon W.S. and Yang D.C.: Molecular authentication by multiplex-PCR of three similar medicinal plant species:Cynanchum wilfordii, Cynanchum auriculatum and Polygonum multiflorum (Fallopia multiflorum). Journal of Medicinal Plants Research, 7(35), 2584-2589 (2013).
Kocher T.D., Thomas W.K., Meyer A., Edwards S.V., Paabo S. and Vellablanca F.X.: Dynamics of mitochondrial DNA evolution in animals: amplification and sequencing with conserved primers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 86, 6196-6200 (1989).
Kress W.J., Wurdack K.J., Zimmer E.A., Weigt L.A. and Janzen D.H.: Use of DNA barcodes to identify flowering plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 102, 8369-8374 (2005).
Kress W.J. and Erickson D.L.: A two-locus global DNA barcode for land plants: the coding rbcL gene complements the non-coding trnH-psbA spacer region. PLoS One, 2, e508 (2007).
Kress W.J. and Erickson D.L.: DNA barcodes : genes, genomics, and bioinformatics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 105, 2761-2762 (2008).
Lahaye R., Van der Bank M., Bogarin D., Warner J. and Pupulin F.: DNA barcoding the floras of biodiversity hotspots. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 105, 2923-2928 (2008).
Moon B.C. and Choo B.G.: Gene marker for classification of Polygonum multiflorum Thungerg, Cynanchum wilforid Max. Hemsl and Cynanchum auriculatum Royle ex Wight. KR, 10-2009-0123113 (2009).
Olmstead R.G., Reeves P.A.: Evidence for the polyphyly of the Scropulariaceae based in chloroplast rbcL and ndhF sequence. Ann. Missouri Bot. Gard., 82, 176-193 (1995).
Park Y.C., Jin S.O., Kim M.R., Kim K.H., Lee J.H., Cho T.Y., Lee H.J. and Han S.B.: Detection Method for Identification of Pueraria mirifica (Thai kudzu) in Processed Foods. Journal of Food Hygiene and Safety, 27, 466-472 (2012).
Park Y.C., Jin S.O., Lim J.Y., Kim K.H., Lee J.H., Cho T.Y., Lee H.J., Han S.B., Lee S.J., Lee K.H. and Yoon H.S.: Application for identification of food raw materials by PCR using universal primer. Journal of Food Hygiene and Safety, 27, 317-324 (2012).
Park Y.C., Lim J.Y., Kim M.R., Park Y.E., Lim J.D., Hwang C.R., Kim K.H., Lee J.H., Cho T.Y., Lee H.J., Lee S.J. and Han S.B.: Identification of faulty red pepper powder containing seasoned red-pepper sauce. Journal of Food Hygiene and Safety, 27, 182-187 (2012).
Tomoaki M., Atsushi A., Takuma T., Sumitaka Y., Yutaka O. and Yoshida M.: Identification of animal species using the partial sequences in the mitochondrial 16S rRNA Gene. Legal Medicine, 11, 449-450 (2009).
White J.J., Bruns J., Lee S. and Taylor J.: Amplification and direct sequencing of fungus ribosomal RNA genes for phylogenics. A guide to methods and application. Academic press, 315-322 (1990).
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