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문제 정의
- plantarum HD1이 각각 생산한 조항진균 물질의 부분 정제물은 항균물질이 다르고, 항균활성이 다르기 때문에 같이 식품첨가제 혹은 사료첨가제로 동량으로 넣으면 효과가 좋을 것으로 사료되어 동량으로 섞어서 본 연구에서는 사용하였다. 식품의약품안전처에서는 식품원료 사용가능 여부를 판단하기 위한 자료 제출요구시 안전성을 입증할 수 있는 독성시험자료를 제출하도록 되어 있어 조항진균 물질의 독성여부를 확인하기 위하여 연구를 하였다.
제안 방법
- 시험물질 경구 투여 후 30분 이내에 1회 이상 관찰하고, 24시간 이내에 주기적으로 관찰(특히 6시간 이내는 세심하게 관찰)하였으며, 다음날부터는 모든 실험동물에 대하여 매일 1회 이상씩 일반상태와 변화, 중독증상의 발현 등 임상증상 및 사망동물의 유무를 총 14일 동안 관찰하였다. 14일간 시험물질 투여 후 희생하기 전날 12시간 절식시킨후, CO2로 마취시키고, 방혈시킨 후에 주요 내부 장기의 병변을 육안적으로 검사하였다.
- plantarum AF1과 Lb. plantarum HD1이 각각 생산한 조항진균 물질의 부분 정제물은 항균물질이 다르고, 항균활성이 다르기 때문에 같이 식품첨가제 혹은 사료첨가제로 동량으로 넣으면 효과가 좋을 것으로 사료되어 동량으로 섞어서 본 연구에서는 사용하였다. 식품의약품안전처에서는 식품원료 사용가능 여부를 판단하기 위한 자료 제출요구시 안전성을 입증할 수 있는 독성시험자료를 제출하도록 되어 있어 조항진균 물질의 독성여부를 확인하기 위하여 연구를 하였다.
- plantarum AF1와 Lb. plantarum HD1이 생산하는 조항진균 물질의 부분 정제물을 동량으로 섞어 SD 계통의 흰쥐에게 단회투여 및 4주 반복투여 독성시험을 실시하였다. 단회투여 독성시험을 위해 시험물질을 500, 1,000 및 2,000 mg/kg의 용량으로 투여한 결과 모든 시험군에서 사망동물이 관찰되지 않았으며, 일반증상, 체중, 임상증상 및 육안적 소견 모두 시험물질 투여와 관련된 특이할 만한 이상소견은 관찰되지 않았다.
- plantarum AF1과 Lb. plantarum HD1이 생산한 조항진균 물질의 부분 정제물을 식품보존제 혹은 사료첨가제로서 활용하기 위한 기초자료를 얻기 위하여 안전성 평가의 일환으로 Sprague-Dawley 계열 흰쥐를 이용하여 단회투여 (급성) 및 반복투여(아급성)에 의한 독성시험을 실시 하였다.
- 시험물질 투여 당일은 시료물질 경구투여 후 1시간부터 6시간까지 관찰하였고, 투여 다음 날부터 28일간 모든 실험동물에 대하여 매일 1회 이상씩 일정한 시간에 일반상태의 변화, 중독 증상발현, 사망동물의 유무 및 시험물질 투여 후 시험물질에 의하여 나타날 가능성이 있는 증상에 대하여 주의하여 관찰하였고, 일반증상은 식욕부진, 타액분비, 설사, 구토, 다뇨 및 무뇨, 분변의 변화를 중심으로 관찰하였다 (Lorke 1983). 또한 실험기간 중 매일 functional observation battery(FOB) test에 기초(Irwin 1968)하여 실험동물의 행동, 자극에 대한 반응성, 각성도 및 경계성, 자세 및 보행 등에 관한 임상증상도 관찰하였다.
- 모든 동물에 대하여 채혈 전에 약 12시간 이상 절식시킨 실험동물을 isoflurane을 이용하여 마취시킨후 복대동맥으로부터 채혈하였다. 채취한 혈액 중 일부를 EDTA로 항응고 처리한 tube(EDTA 2K, BD vacutainer, NJ, USA)에 혈액을 채취한 후 혈액분석기(ADVIA, 120E, Seimens, USA)를 이용하여 총 백혈구 수(white blood cells, WBC), 총 적혈구수(total erythrocyte count, RBC), 헤모글로빈 함량(hemoglobin, Hb), 혈 중 적혈구 비율(hematocrit, HCT), 평균 적혈구 용적(mean corpuscular volume, MCV), 평균 적혈구 혈색소량(mean corpuscular hemoglobin, MCH), 평균 적혈구 혈색소 농도(mean corpuscular hemoglobin concentration, MCHC), 망상적혈구수 (reticulocytes), 혈소판(platelets), 프로트롬빈 시간 (prothrombin time, PT), 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간(activated partial htromboplastin time, APTT), 호중구(neutrophils), 호산구(eosinophils), 호염기구(basophils), 림프구(lymphocytes) 및 단핵구(monocytes)의 백분율을 측정하였다.
- 시료물질 투여 후 28일 째 까지 생존한 동물은 isoflurane으로 마취하에 채혈 및 안락사 시킨 다음, 체표 및 모든 체공(external surface와 all orifices), 두 개강(cranial cavity), 흉강 및 복강의 모든 장기에 대하여 육안적 검사를 실시하였다. 모든 동물에 대한 육안적 검사를 실시한 후에 장기를 적출한 다음 뇌, 뇌하수체, 폐, 흉선, 비장, 부신, 전립선, 고환, 난소, 자궁, 신장, 심장, 췌장 및 간의 습중량을 측정하고, 절식 체중에 대한 상대 장기 중량비를 산출하였다. 좌우가 있는 장기는 좌우를 별도로 측정하여 무게를 합산 산출하였다.
- 모든 실험동물의 체중은 시험물질 투여 개시 전에 실시하였으며, 투여 개시 후에는 시험기간 중 매주마다 일정한 시간에 1회 및 부검 전에 측정하였다. 사료섭취량은 매주 1회 측정하여 산출하였다.
- 본 연구를 위해 실험동물은 시험물질 투여 전 12시간을 절식시킨 후, 체중을 측정한 다음 예비시험결과를 토대로 독성징후가 관찰되지 않아 식품의약품안전처의 독성시험기준(KFDA 2009a, 2009b)에 근거하여 암·수 모두 최고 용량을 2,000 mg/kg/day로 하고, 등비를 1/2로 하여 체중 kg 당 500, 1,000 및 2,000 mg을 설정하여 저용량 투여군, 중용량 투여군 및 고용량 투여군으로 설정하였다.
- 부검 당일 채혈한 혈액을 3,000rpm에서 20분간 원심분리해서 얻은 혈청에 대하여 혈액생화학적 검사를 자동분석기(Hitachi-747, Hitachi Medical., Tokyo, Japan)를 사용하여 인산분해효소(alkaline phosphatase, ALP), 아스파라진산 아미노전이효소 (aspartate aminotransferase, AST), 알라닌 아미노기전이효소(alanine aminotransferase, ALT), 감마-글루타밀전이효소(gamma(γ)-glutamyl transferase, GGT), 포도당(glucose, GLU), 요소(blood urea nitrogen, BUN), 총 콜레스테롤(total cholesterol, TC), HDL-콜레스테롤(high destiny lipoprotein cholesterol, HDL-C), LDL-콜레스테롤(low destiny lipoprotein cholesterol, LDL-C), 중성지질(triglyceride, TG), 총단백질(total protein, TP), 알부민(albumin), 알부민/ 글로불린 비(albuminglobulin ratio, A/G), 총 빌리루빈(total bilirubin, T-BIL), 크레아티닌(creatinine, CRE), 칼슘(Ca), 무기인(IP), 크레아틴 인산화효소(creatine kinase, CK), 나트륨(Na), 칼륨(K) 및 염소 (Cl)를 측정하였다.
- 실험동물 꼬리에 개별 인식 표시를 한 다음 투여 용량별로 5마리씩 암·수 각각 따로 넣어 사육하였다. 사료는 방사선 멸균된 Laddiet 5L79 (Laddiet, NJ, USA)를, 음수는 R/O수를 UV살균하여 자유급여 하였다.
- 모든 실험동물의 체중은 시험물질 투여 개시 전에 실시하였으며, 투여 개시 후에는 시험기간 중 매주마다 일정한 시간에 1회 및 부검 전에 측정하였다. 사료섭취량은 매주 1회 측정하여 산출하였다.
- 시료물질 투여 후 28일 째 까지 생존한 동물은 isoflurane으로 마취하에 채혈 및 안락사 시킨 다음, 체표 및 모든 체공(external surface와 all orifices), 두 개강(cranial cavity), 흉강 및 복강의 모든 장기에 대하여 육안적 검사를 실시하였다. 모든 동물에 대한 육안적 검사를 실시한 후에 장기를 적출한 다음 뇌, 뇌하수체, 폐, 흉선, 비장, 부신, 전립선, 고환, 난소, 자궁, 신장, 심장, 췌장 및 간의 습중량을 측정하고, 절식 체중에 대한 상대 장기 중량비를 산출하였다.
- 시험 동물은 온도 23 ± 1℃, 습도 55 ± 5%, 배기 횟수는 시간당 10~18회, 형광등 명암 12시간 cycle(09:00~21:00), 조도 300~500 Lux의 사육환경에서 폴리카보네이트 사육 상자(220 W × 270 L × 130 H mm) 케이지에 넣어 사육하였다.
- 체중은 도입 시, 군 분리 시, 시험물질 투여 개시 직전, 투여 개시 후 7일 및 14일 째에 측정하였다. 시험물질 경구 투여 후 30분 이내에 1회 이상 관찰하고, 24시간 이내에 주기적으로 관찰(특히 6시간 이내는 세심하게 관찰)하였으며, 다음날부터는 모든 실험동물에 대하여 매일 1회 이상씩 일반상태와 변화, 중독증상의 발현 등 임상증상 및 사망동물의 유무를 총 14일 동안 관찰하였다. 14일간 시험물질 투여 후 희생하기 전날 12시간 절식시킨후, CO2로 마취시키고, 방혈시킨 후에 주요 내부 장기의 병변을 육안적으로 검사하였다.
- 시험물질 투여 당일은 시료물질 경구투여 후 1시간부터 6시간까지 관찰하였고, 투여 다음 날부터 28일간 모든 실험동물에 대하여 매일 1회 이상씩 일정한 시간에 일반상태의 변화, 중독 증상발현, 사망동물의 유무 및 시험물질 투여 후 시험물질에 의하여 나타날 가능성이 있는 증상에 대하여 주의하여 관찰하였고, 일반증상은 식욕부진, 타액분비, 설사, 구토, 다뇨 및 무뇨, 분변의 변화를 중심으로 관찰하였다 (Lorke 1983). 또한 실험기간 중 매일 functional observation battery(FOB) test에 기초(Irwin 1968)하여 실험동물의 행동, 자극에 대한 반응성, 각성도 및 경계성, 자세 및 보행 등에 관한 임상증상도 관찰하였다.
- 본 연구를 위해 실험동물은 시험물질 투여 전 12시간을 절식시킨 후, 체중을 측정한 다음 예비시험결과를 토대로 독성징후가 관찰되지 않아 식품의약품안전처의 독성시험기준(KFDA 2009a, 2009b)에 근거하여 암·수 모두 최고 용량을 2,000 mg/kg/day로 하고, 등비를 1/2로 하여 체중 kg 당 500, 1,000 및 2,000 mg을 설정하여 저용량 투여군, 중용량 투여군 및 고용량 투여군으로 설정하였다. 시험물질은 멸균 증류수로 희석하여 제조하였으며, 대조군은 멸균증류수만 투여하였다. 투여액량은 1일 1회 당일 체중을 기준으로 체중 kg당 10 mL를 경구투여용 존데(zonde) 를 정착한 주사기를 이용하여 위 내에 직접 강제 주입하였다.
- 투여용량 설정은 반복투여 경구 독성시험에서 시험물질의 독성이 매우 적고 중독량을 정하기가 어려운 경우 투여량의 상한선은 기술적으로 투여할 수 있는 최대량으로 하는 것이 기본이여서, 암·수 모두 최고 용량을 2,000 mg/kg/day로 하고, 등비를 1/2로 하여 체중 kg 당 500, 1,000 및 2,000 mg을 설정하여 저용량 투여군, 중용량 투여군 및 고용량 투여군으로 설정하였다. 시험물질의 투여는 투여 개시 전에 잘 현탁시킨 다음 매일 1회 4주간 경구투여용 존데(zonde)를 정착한 주사기를 이용하여 위 내에 직접 투입하였으며, 대조 물질로는 멸균증류수를 사용하였다. 시험동물은 시험물질 투여 후 2시간 동안은 사료를 제한하지 않았으며, 전 시험기간 동안 물은 자유롭게 섭취시켰다.
- 실험동물 꼬리에 개별 인식 표시를 한 다음 투여 용량별로 5마리씩 암·수 각각 따로 넣어 사육하였다.
- 모든 동물에 대한 육안적 검사를 실시한 후에 장기를 적출한 다음 뇌, 뇌하수체, 폐, 흉선, 비장, 부신, 전립선, 고환, 난소, 자궁, 신장, 심장, 췌장 및 간의 습중량을 측정하고, 절식 체중에 대한 상대 장기 중량비를 산출하였다. 좌우가 있는 장기는 좌우를 별도로 측정하여 무게를 합산 산출하였다.
- 모든 동물에 대하여 채혈 전에 약 12시간 이상 절식시킨 실험동물을 isoflurane을 이용하여 마취시킨후 복대동맥으로부터 채혈하였다. 채취한 혈액 중 일부를 EDTA로 항응고 처리한 tube(EDTA 2K, BD vacutainer, NJ, USA)에 혈액을 채취한 후 혈액분석기(ADVIA, 120E, Seimens, USA)를 이용하여 총 백혈구 수(white blood cells, WBC), 총 적혈구수(total erythrocyte count, RBC), 헤모글로빈 함량(hemoglobin, Hb), 혈 중 적혈구 비율(hematocrit, HCT), 평균 적혈구 용적(mean corpuscular volume, MCV), 평균 적혈구 혈색소량(mean corpuscular hemoglobin, MCH), 평균 적혈구 혈색소 농도(mean corpuscular hemoglobin concentration, MCHC), 망상적혈구수 (reticulocytes), 혈소판(platelets), 프로트롬빈 시간 (prothrombin time, PT), 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간(activated partial htromboplastin time, APTT), 호중구(neutrophils), 호산구(eosinophils), 호염기구(basophils), 림프구(lymphocytes) 및 단핵구(monocytes)의 백분율을 측정하였다. 혈액응고시간의 측정은 채혈한 후 vacutainer(9NC sodium citrate, BD vacutainer, NJ, USA)에 취하여 냉장원심분리(3000 rpm, 4℃, 10분)하여 얻은 혈장을 혈액응고분석기(ACL 7000, Instrumentation Laboratory, NY, USA)를 이용하여 측정하였다.
- 시험동물은 시험물질 투여 후 2시간 동안은 사료섭취를 제한하였으나, 물은 시험기간 동안 계속적으로 공급하였다. 체중은 도입 시, 군 분리 시, 시험물질 투여 개시 직전, 투여 개시 후 7일 및 14일 째에 측정하였다. 시험물질 경구 투여 후 30분 이내에 1회 이상 관찰하고, 24시간 이내에 주기적으로 관찰(특히 6시간 이내는 세심하게 관찰)하였으며, 다음날부터는 모든 실험동물에 대하여 매일 1회 이상씩 일반상태와 변화, 중독증상의 발현 등 임상증상 및 사망동물의 유무를 총 14일 동안 관찰하였다.
- 투여용량 설정은 반복투여 경구 독성시험에서 시험물질의 독성이 매우 적고 중독량을 정하기가 어려운 경우 투여량의 상한선은 기술적으로 투여할 수 있는 최대량으로 하는 것이 기본이여서, 암·수 모두 최고 용량을 2,000 mg/kg/day로 하고, 등비를 1/2로 하여 체중 kg 당 500, 1,000 및 2,000 mg을 설정하여 저용량 투여군, 중용량 투여군 및 고용량 투여군으로 설정하였다.
- 채취한 혈액 중 일부를 EDTA로 항응고 처리한 tube(EDTA 2K, BD vacutainer, NJ, USA)에 혈액을 채취한 후 혈액분석기(ADVIA, 120E, Seimens, USA)를 이용하여 총 백혈구 수(white blood cells, WBC), 총 적혈구수(total erythrocyte count, RBC), 헤모글로빈 함량(hemoglobin, Hb), 혈 중 적혈구 비율(hematocrit, HCT), 평균 적혈구 용적(mean corpuscular volume, MCV), 평균 적혈구 혈색소량(mean corpuscular hemoglobin, MCH), 평균 적혈구 혈색소 농도(mean corpuscular hemoglobin concentration, MCHC), 망상적혈구수 (reticulocytes), 혈소판(platelets), 프로트롬빈 시간 (prothrombin time, PT), 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간(activated partial htromboplastin time, APTT), 호중구(neutrophils), 호산구(eosinophils), 호염기구(basophils), 림프구(lymphocytes) 및 단핵구(monocytes)의 백분율을 측정하였다. 혈액응고시간의 측정은 채혈한 후 vacutainer(9NC sodium citrate, BD vacutainer, NJ, USA)에 취하여 냉장원심분리(3000 rpm, 4℃, 10분)하여 얻은 혈장을 혈액응고분석기(ACL 7000, Instrumentation Laboratory, NY, USA)를 이용하여 측정하였다.
대상 데이터
- plantarum AF1와 Lb. plantarum HD1을 선별하여 각각 생산한 조항진균 물질을 사용하였다(Yang 2008). 분리 유산균을 5 mL MRS(Difco Laboratories, Detroit, MI, USA) 액체배지에 접종하여 30℃ incubator(Vision Co.
- 시험동물은 중앙실험동물(주)에서 분양받은 특정 병원체 부재(SPF) 5주령의 암·수 Sprague-Dawley (SD) 계통의 흰쥐를 사용하였다. 동물은 한국화학융합시험연구원 헬스케어 연구소(화순, 전남)의 동물사육실의 환경 하에서 1주일간 순회사육 기간 동안 임상관찰 등을 시행하여 건강한 정상적인 동물만 시험에 사용하였으며, 체중 범위에 따른 무작위법에 의하여 군 분리를 실시한 후, 본 실험에 사용하였다. 시험 동물은 온도 23 ± 1℃, 습도 55 ± 5%, 배기 횟수는 시간당 10~18회, 형광등 명암 12시간 cycle(09:00~21:00), 조도 300~500 Lux의 사육환경에서 폴리카보네이트 사육 상자(220 W × 270 L × 130 H mm) 케이지에 넣어 사육하였다.
- 시험동물은 중앙실험동물(주)에서 분양받은 특정 병원체 부재(SPF) 5주령의 암·수 Sprague-Dawley (SD) 계통의 흰쥐를 사용하였다.
데이터처리
- 단회독성시험은 먼저, Levene’s test를 통해 등분산 검정을 수행하였고, 이후 일원배치분산분석(one way, ANOVA test)을 실시하여 각 군 간의 유의성을 확인하였다. 4주간 반복투여 독성시험은 체중, 시료섭취량, 혈액학적 검사, 혈액생화학적 검사 및 장기 중량의 자료에 대하여 일원 배치분산(one way, ANOVA) test를 실시하였다. 그 결과 유의성이 인정된 경우에는 Levene’s test를 실시한 후 분산이 동질성을 갖는 경유 사후검정으로 Scheffe 다중검정을 실시하고, 이질적이면 Dunnett’s T3를 실시하였다.
- 그 결과 유의성이 인정된 경우에는 Levene’s test를 실시한 후 분산이 동질성을 갖는 경유 사후검정으로 Scheffe 다중검정을 실시하고, 이질적이면 Dunnett’s T3를 실시하였다.
- 단회독성시험은 먼저, Levene’s test를 통해 등분산 검정을 수행하였고, 이후 일원배치분산분석(one way, ANOVA test)을 실시하여 각 군 간의 유의성을 확인하였다.
- 본 실험에서 얻은 결과는 SPSS 19.0 P/C package를 이용하여 통계처리 하였다. 단회독성시험은 먼저, Levene’s test를 통해 등분산 검정을 수행하였고, 이후 일원배치분산분석(one way, ANOVA test)을 실시하여 각 군 간의 유의성을 확인하였다.
이론/모형
- plantarum AF1와 Lb. plantarum HD1의 조항진균 물질 분리를 위하여 solid phase extraction(SPE) 정제과정을 통해 실시하였다. Methanol과 10 mM sodium acetate 완충액을 흘려 equilibration 상태인 SPE column(Isolute, C18 EC, 10 g, Unternational Sorbent Technology Ltd, Hengoed, UK)에 제균된 상징액 2.
- 본 시험물질은 한계 용량에 대한 기준이 없기 때문에 시험물질의 투여 용량은 OECD Guideline (OECD, 2001), Principles and Methods of Toxicology(Hayes 1984) 및 미국 환경보호청(US Environmental Protection Agency)에서 무해물질 분류 기준에 근거(De Vuyst & Vandamme 1994)하여 설정하였다.
성능/효과
- plantarum HD1이 생산한 조항진균 물질 부분 정제물 500, 1,000 및 2,000 mg/kg을 암·수 흰쥐에게 4주간 매일 1회 경구투여한 후 사망률, 일반증상을 관찰한 결과, 시험기간 동안 암·수 모든 시험군에서 빈사 및 폐사 동물은 관찰되지 않았다.
- plantarum HD1이 생산한 조항진균 물질 부분 정제물을 동량 섞어 500, 1,000 및 2,000mg/kg씩 1회 경구투여 후 암·수 흰쥐에게 14일간 일반증상 관찰 결과, 시험물질 투여에 의한 사망동물 및 이상소견은 관찰되지 않았다.
- plantarum AF1와 Lb. plantarum HD1이 생산한 조항진균 물질부분 정제물의 안전성을 확인할 수 있었다. 체중의 변화를 관찰한 결과는 Table 1과 같이 정상적인 체중 증가가 관찰되었다.
- 간, 신장, 비장, 고환, 난소, 뇌, 폐, 심장, 흉선, 전립선, 자궁, 부신, 뇌하수체의 무게는 암·수 흰쥐 모두 시료물질 투여에 의한 차이가 발견되지 않았고, 투여 용량 의존적인 이상 변화도 관찰되지 않았다.
- plantarum HD1이 생산하는 조항진균 물질의 부분 정제물을 동량으로 섞어 SD 계통의 흰쥐에게 단회투여 및 4주 반복투여 독성시험을 실시하였다. 단회투여 독성시험을 위해 시험물질을 500, 1,000 및 2,000 mg/kg의 용량으로 투여한 결과 모든 시험군에서 사망동물이 관찰되지 않았으며, 일반증상, 체중, 임상증상 및 육안적 소견 모두 시험물질 투여와 관련된 특이할 만한 이상소견은 관찰되지 않았다. 반복투여 독성시험을 위해 시험물질을 500, 1,000 및 2,000 mg/kg/day의 용량으로 1일 1회 4주간 투여한 결과 모든 시험군에서 임상증상 및 사망 동물이 관찰되지 않았다.
- 체중의 변화를 관찰한 결과는 Table 1과 같이 정상적인 체중 증가가 관찰되었다. 대조군을 포함한 시험물질 투여군 모두에서 유의할 만한 체중 변화는 관찰되지 않았다. 부검 소견 결과도 모든 투여군에서 시험물질 투여와 관련된 특이할 만한 이상 소견은 관찰되지 않았다.
- plantarum HD1이 생산한 조항진균 물질 부분 정제물 500, 1,000 및 2,000 mg/kg을 암·수 흰쥐에게 4주간 매일 1회 경구투여한 후 사망률, 일반증상을 관찰한 결과, 시험기간 동안 암·수 모든 시험군에서 빈사 및 폐사 동물은 관찰되지 않았다. 또한 일반증상 관찰 결과, 특이한 이상증상을 보인 동물은 관찰되지 않았다. 체중의 변화를 관찰한 결과는 Table 2와 같이 정상적인 체중 증가가 관찰되었다.
- 체중의 변화는 4주간 지속적으로 증가되었지만 대조군과 시험물질 투여군과의 유의적 차이는 없었다. 또한 장기의 육안적 소견, 장기 중량변화, 혈액학적, 혈액생화학적 검사에서도 모든 시험물질 투여군이 대조군과 유의성 있는 차이를 보이지 않았으며, 모두 정상 범위내의 수치로 시험물질에 기인하는 이상소견을 발견할 수 없었다. 단회투여 및 4주 반복투여 독성시험 결과, Lb.
- 단회투여 독성시험을 위해 시험물질을 500, 1,000 및 2,000 mg/kg의 용량으로 투여한 결과 모든 시험군에서 사망동물이 관찰되지 않았으며, 일반증상, 체중, 임상증상 및 육안적 소견 모두 시험물질 투여와 관련된 특이할 만한 이상소견은 관찰되지 않았다. 반복투여 독성시험을 위해 시험물질을 500, 1,000 및 2,000 mg/kg/day의 용량으로 1일 1회 4주간 투여한 결과 모든 시험군에서 임상증상 및 사망 동물이 관찰되지 않았다. 체중의 변화는 4주간 지속적으로 증가되었지만 대조군과 시험물질 투여군과의 유의적 차이는 없었다.
- 복대정맥 혈액으로부터 분리한 혈장으로부터 혈액 생화학적 분석기를 이용하여 혈액생화학적 지표인 알칼리성 인산분해효소(ALP), 아스파라진산 아미노전이효소(AST), 알라닌 아미노기전이효소(ALT), 감마-글루타밀전이효소(GGT), 포도당(GLU), 요소(BUN), 총 콜레스테롤(TC), HDL-콜레스테롤(HDL-C), LDL-콜레스테롤(LDL-C), 중성지질(TG), 총 단백질(TP), 알 부민(albumin), 알부민/글로불린 비(A/G), 총 빌리루빈(T-BIL), 크레아티닌(CRE), 칼슘(Ca), 무기인(IP), 크레아틴 인산화효소(CK), 나트륨(Na), 칼륨(K) 및 염소(Cl)를 측정한 결과, Table 7에서와 같이 암·수 모든 투여군은 대조군에 비하여 시험물질 투여에 기인한 유의성 있는 혈청 생화학적 변화가 관찰되지 않았다.
- 신장 손상에 의해 CRE, BUN 등은 혈액으로 유리된다(Plaa & Charbonneau 1994). 본 혈액생화학적 검사 결과 대조군과 시험물질 투여군 모두 정상 수치 (Wolford et al. 1986)를 나타내어 시험물질 투여로 인한 독성학적 작용은 나타나지 않는 것으로 사료된다.
- 부검 후 혈구 측정기를 이용하여 백혈구수(WBC), 적혈구수(RBC), 혈색소량(Hb), 헤마토크리트치(Hct), 평균 적혈구 용적(MCV), 평균 적혈구 혈색소량(MCH), 평균 적혈구 혈색소 농도(MCHC), 망상적혈구수(reticulocytes), 혈소판(platelets), 프로트롬빈 시간(PT), 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간(APTT), 호 중구(neutrophils), 호산구(eosinophils), 호염기구(basophils), 림프구(lymphocytes) 및 단핵구(monocytes)의 백분위를 측정한 결과, Table 6과 같이 암·수 모두 대조군과 시험물질 투여군 간에는 유의성 있는 변화가 관찰되지 않았다.
- 대조군을 포함한 시험물질 투여군 모두에서 유의할 만한 체중 변화는 관찰되지 않았다. 사료섭취량의 경우 Table 3과 같이 투여 2주차에 수컷 1000 mg/kg 군에서 대조군에 비해 유의하게 감소하였고, 암컷에서는 대조군과 시험 물질 투여군 간의 유의적 차이가 관찰되지 않았다. Lee et al.
- 실험동물을 부검 시 암·수 모든 동물의 외관 및 주요장기에 대한 육안적 검사를 실시하였는데, 암·수 흰쥐 모두 대조군과 시험물질 투여군 모두에서 시험물질 투여로 인한 용량 의존적인 특이할 만한 외관상 이상 증상이나 부검소견은 관찰되지 않았다.
- 반복투여 독성시험을 위해 시험물질을 500, 1,000 및 2,000 mg/kg/day의 용량으로 1일 1회 4주간 투여한 결과 모든 시험군에서 임상증상 및 사망 동물이 관찰되지 않았다. 체중의 변화는 4주간 지속적으로 증가되었지만 대조군과 시험물질 투여군과의 유의적 차이는 없었다. 또한 장기의 육안적 소견, 장기 중량변화, 혈액학적, 혈액생화학적 검사에서도 모든 시험물질 투여군이 대조군과 유의성 있는 차이를 보이지 않았으며, 모두 정상 범위내의 수치로 시험물질에 기인하는 이상소견을 발견할 수 없었다.
후속연구
- plantarum AF1와 Lb. plantarum HD1이 생산하는 조항진균 물질의 부분 정제물은 저독성의 안전한 물질로 판정되었으며, 안전성 확인을 통하여 천연 식품보존제로서 실제 식품에 적용시킬 수 있는 방법에 대한 연구가 필요할 것으로 사료된다.
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