장수풍뎅이(Korean Rhinoceros Beettle, Allomyrina dichotoma)에 Oryctes rhinoceros nudivirus 감염 특이적으로 발현하는 유전자 동정 Identification of Genes Differentially Expressed by Oryctes rhinoceros nudivirus Infection in the Korean Rhinoceros Beetle, Allomyrina dichotoma원문보기
장수풍뎅이(Korean Rhinoceros Beettle, Allomyrina dichotoma)는 관상용으로 인기가 높으며, 애벌레는 식품으로 주목을 받고 있다. 장수풍뎅이의 대량사육 시 발생하는 질병의 원인이 최근에 virus (Oryctes rhinoceros nudivirus)인 것이 보고되었다. 그러나 아직 정확한 발병기전과 치료방법을 알지 못하여 사육농가에 심각한 경제적 손실을 주고 있다. 본 연구에서는 virus에 감염된 장수풍뎅이의 fat body와 장에서 심각한 조직변화가 관찰되었다. 이 때에 유전자발현이 상승하는 것으로 BTF3H4-like, SPS-like, COPB1, T-CP, HSP70를 보고한다. 이 결과는 장수풍뎅이의 대량사육 시 발생하는 질병의 조기진단과 치료에 실마리를 제공할 것이다. 그리고 안정적인 생산성 향상을 통해서 소득증대 효과 및 균일화된 대량사육을 통해서 식품원료로 인정받을 수 있을 것이다.
장수풍뎅이(Korean Rhinoceros Beettle, Allomyrina dichotoma)는 관상용으로 인기가 높으며, 애벌레는 식품으로 주목을 받고 있다. 장수풍뎅이의 대량사육 시 발생하는 질병의 원인이 최근에 virus (Oryctes rhinoceros nudivirus)인 것이 보고되었다. 그러나 아직 정확한 발병기전과 치료방법을 알지 못하여 사육농가에 심각한 경제적 손실을 주고 있다. 본 연구에서는 virus에 감염된 장수풍뎅이의 fat body와 장에서 심각한 조직변화가 관찰되었다. 이 때에 유전자발현이 상승하는 것으로 BTF3H4-like, SPS-like, COPB1, T-CP, HSP70를 보고한다. 이 결과는 장수풍뎅이의 대량사육 시 발생하는 질병의 조기진단과 치료에 실마리를 제공할 것이다. 그리고 안정적인 생산성 향상을 통해서 소득증대 효과 및 균일화된 대량사육을 통해서 식품원료로 인정받을 수 있을 것이다.
The Korean rhinoceros beetle (Allomyrina dichotoma) is popular as a pet and as a food ingredient, and it is commercially distributed in Korea. It is also traditionally regarded as a medicine for liver-related diseases. Recently, the Oryctes rhinoceros nudivirus was introduced from Southeast Asia. Th...
The Korean rhinoceros beetle (Allomyrina dichotoma) is popular as a pet and as a food ingredient, and it is commercially distributed in Korea. It is also traditionally regarded as a medicine for liver-related diseases. Recently, the Oryctes rhinoceros nudivirus was introduced from Southeast Asia. This virus is reported as a disease factor for A. dichotoma in mass-rearing facilities, and economic losses due to this viral infection have been increasing in Korea since the 2010s. In this study, we observed serious structural changes in the fat body and the intestine of virus-infected beetles. We report five genes that are up-regulated by the viral infection in the intestine: BTF3H4-like (transcription factor BTF3 homolog 4-like), SPS-like (serine proteinase stubble-like), COPB1 (coatomer protein complex, subunit beta 1), T-CP (T-complex 1 subunit gamma), and HSP70 HSP70 (heat shock protein 70). The results may provide a clue for the early diagnosis and disease-treatment that occurs in mass-rearing facilities. The improvement of stable productivity will increase the farmers’ income, and quality control of beetle-breeding will help industries to utilize this beetle as a promising food ingredient.
The Korean rhinoceros beetle (Allomyrina dichotoma) is popular as a pet and as a food ingredient, and it is commercially distributed in Korea. It is also traditionally regarded as a medicine for liver-related diseases. Recently, the Oryctes rhinoceros nudivirus was introduced from Southeast Asia. This virus is reported as a disease factor for A. dichotoma in mass-rearing facilities, and economic losses due to this viral infection have been increasing in Korea since the 2010s. In this study, we observed serious structural changes in the fat body and the intestine of virus-infected beetles. We report five genes that are up-regulated by the viral infection in the intestine: BTF3H4-like (transcription factor BTF3 homolog 4-like), SPS-like (serine proteinase stubble-like), COPB1 (coatomer protein complex, subunit beta 1), T-CP (T-complex 1 subunit gamma), and HSP70 HSP70 (heat shock protein 70). The results may provide a clue for the early diagnosis and disease-treatment that occurs in mass-rearing facilities. The improvement of stable productivity will increase the farmers’ income, and quality control of beetle-breeding will help industries to utilize this beetle as a promising food ingredient.
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문제 정의
이와 함께 장에서 특이적으로 발현이 상승하는 유전자로 BTF3H4-like, SPS-like, COPB1, T-CP, HSP70를 보고한다. 이 결과는 장수풍뎅이의 대량사육 시 발생하는 질병의 조기진단과 치료에 새로운 기회를 제공할 것이다.
본 연구팀은 이문제를 해결하기 위하여 virus에 감염된 장수풍뎅이의 장 (intestine) 특이적으로 발현하는 유전자를 Differential Display (DD)-PCR방법으로 동정하였다. 장수풍뎅이의 질병 관련 유전자에 관한 보고는 본 논문이 최초이다. 이들 유전자에 대한깊은 연구는 질병예찰과 치료에 도움을 줄 수 있는 실마리를제공할 것이다.
가설 설정
Five genes up-regulated by virus infection in the intestine. H; healthy intestine, D; Virus-infect- ed intestine.
제안 방법
4% PFA에 고정한 장 조직을 흐르는 물에 충분히 수세하여 저농도에서 고농도의 에탄올에 순차적으로 담가 탈수시킨 후 자일렌을 이용하여 투명화하였다. 그 다음 파라핀으로 포매하고 마이크로톰을 이용하여 4 ㎛ 두께로 잘라 슬라이드에 올린 후 파라핀을 제거하였다.
3령 larvae의 머리 부분을 해부침으로 고정시킨후 표피를 아래에서 머리 방향으로 한 번에 가른다. Fat body 를 제거한 후 장을 통째로 분리하여 장 내부의 톱밥 등의 내용물을 제거하고, 차가운 phosphate buffered saline (PBS)에 3회 세척하여 불순물질을 모두 제거 후 4% paraformaldehyde (PFA)로 고정 또는 total RNA를 분리하였다. Virus 감염 유무는 아래의 primer를 사용하여 확인하였다.
그 다음 파라핀으로 포매하고 마이크로톰을 이용하여 4 ㎛ 두께로 잘라 슬라이드에 올린 후 파라핀을 제거하였다. Hematoxylin과 eosin을 이용하여 염색한 후 봉입하여 현미경으로 관찰하였다.
Target band를 오려서 Gel elution kit (ELPIS Biotech, Korea)를 이용하여 DNA를 회수한 후 pGEM-T easy vector (Promega, USA)를이용하여 cloning 하였다. Plasmid miniprep kit (ELPIS Biotech, Korea)를 이용하여 DNA를 추출한 후 솔젠트 회사에 의뢰하여 염기서열을 결정하였다(Solgent, Korea).
그런 다음 94℃에서 30초, 65℃에서 30초, 72℃에서 1분씩 40회 반복한 후, 2% agarose gel에서 확인하였다. Target band를 오려서 Gel elution kit (ELPIS Biotech, Korea)를 이용하여 DNA를 회수한 후 pGEM-T easy vector (Promega, USA)를이용하여 cloning 하였다. Plasmid miniprep kit (ELPIS Biotech, Korea)를 이용하여 DNA를 추출한 후 솔젠트 회사에 의뢰하여 염기서열을 결정하였다(Solgent, Korea).
Total RNA 3 ㎍과 oli- go-dT를 섞어 80℃에서 3분 동안 열 변성 시킨 후, 10x buffer, dNTP, MML-V, RNase inhibitor 등이 포함된 용액과 혼합하여 42℃에서 90분간 반응시켜 cDNA를 합성하였다. cDNA를증폭시키기 위해서 해당 primer를 이용하여 95℃에서 30초, 56℃에서 30초, 72℃에서 30초로 28회 반응하여 전기영동으로확인하였다. 사용된 primer는 다음과 같다.
발현차이를 보인 유전자에 해당하는 primer를 이용하여 re- verse transcription-PCR을 수행하였다. Total RNA 3 ㎍과 oli- go-dT를 섞어 80℃에서 3분 동안 열 변성 시킨 후, 10x buffer, dNTP, MML-V, RNase inhibitor 등이 포함된 용액과 혼합하여 42℃에서 90분간 반응시켜 cDNA를 합성하였다.
그러나 아직 정확한 발병기전과 치료방법을 알지 못하여사육농가에 심각한 경제적 손실을 주고 있다. 본 연구팀은 이문제를 해결하기 위하여 virus에 감염된 장수풍뎅이의 장 (intestine) 특이적으로 발현하는 유전자를 Differential Display (DD)-PCR방법으로 동정하였다. 장수풍뎅이의 질병 관련 유전자에 관한 보고는 본 논문이 최초이다.
Total RNA 3 ㎍과 dT-ACP1 oligomer 를 섞어 80℃에서 3분 동안 열변성 시킨 후, 10x buffer, dNTP, MML-V, RNase inhibitor 등이 포함된 용액과 혼합하여 42℃에서 90분간 반응시켜 cDNA를 합성하였다. 이 cDNA를 주형으로 하여 dT-ACP2와 20가지의 arbitrary ACP를 이용하여 95℃에서 1분, 50℃에서 3분, 72℃ 에서 1분 동안 반응하여 double-strand cDNA 를 합성하였다. 그런 다음 94℃에서 30초, 65℃에서 30초, 72℃에서 1분씩 40회 반복한 후, 2% agarose gel에서 확인하였다.
이와 같은 결과는 정상적인 신진대사가 일어나지않아서 탈장이 유도되는 것을 생각된다. 이때에 장(intestine) 의 구조적인 변화를 관찰하기 위하여 각각의 장을 HE염색하여 조직학적인 구조변화를 현미경하에서 관찰하였다. 정상적인 장구조에 비하여 virus감염된 장구조는 기저층에 있는 근육층(lamina musclaris)이 아주 얇아져 있고 점막(tunica mu- sclaris)층이 빈약해져 있다.
이처럼 virus감염에 의해서 장의 정상적인 기능이 작동할 수 없는 상태가 질병유발의 주요 원인인 것으로 생각된다. 장수풍뎅이가 Oryctes rhinoceros nudivirus에 감염되었을 때에 장에서 일어나는 분자기전을 이해하기 위하여 DD-PCR 방법을 이용하여, 특이적으로 발현하는 유전자를 탐색하였다. GeneFishing DEG kit (Seegene, Korea)는 포유동물의 특이유전자 탐색에 사용되는 것이지만, 곤충을 상대로 했을 때에도 잘 적용되는 것을 확인하였다.
결국 virus감염에 의해서 fat body가 방어시스템을 작동하였기에 정상적인 fat body보다가 크게 팽창한 것으로 생각된다. 해부하여 각각의 fat body를 HE염색하여 현미경하에서 조직을 관찰하였다. Virus에 감염된 것의 fat body가 아주팽창되어 있고 부분적으로 터져있는 것을 확인할 수 있었다 (Fig.
대상 데이터
GeneFishing DEG kit (Seegene, Korea)는 포유동물의 특이유전자 탐색에 사용되는 것이지만, 곤충을 상대로 했을 때에도 잘 적용되는 것을 확인하였다. Virus에 감염된 장과 비 감염된 장으로부터 total RNA를 얻어서 사용하였다. 그 결과 다수의 1차 결과를 얻었지만 reverse PCR결과 많은 false가 확인되었지만 특이적인 DNA단편이 확인되었다(Fig.
본 연구에 이용된 장수풍뎅이는 표준 사육기준에 따라 사육된 3령 larvae를 경기도 시흥시 아이벅스캠프(영농조합법인) 로부터 구입한 후, 약 25℃, 40%의 습도 조건의 발효 톱밥에 보관 하였다. 3령 larvae의 머리 부분을 해부침으로 고정시킨후 표피를 아래에서 머리 방향으로 한 번에 가른다.
이론/모형
GeneFishing DEG kit (Seegene, Korea)를 사용하여 PCR- based differential display 방법으로 선별하였다. Total RNA 3 ㎍과 dT-ACP1 oligomer 를 섞어 80℃에서 3분 동안 열변성 시킨 후, 10x buffer, dNTP, MML-V, RNase inhibitor 등이 포함된 용액과 혼합하여 42℃에서 90분간 반응시켜 cDNA를 합성하였다.
1A). 본 실험에서는 virus sequence를 이용하여 RT-PCR 방법으로 감염유무를 확인하였다(Fig. 1B). 곤충의 fat body는포유동물의 liver와 같이 지질대사와 해독작용에 관여하는 기관이다.
성능/효과
장수풍뎅이가 Oryctes rhinoceros nudivirus에 감염되었을 때에 장에서 일어나는 분자기전을 이해하기 위하여 DD-PCR 방법을 이용하여, 특이적으로 발현하는 유전자를 탐색하였다. GeneFishing DEG kit (Seegene, Korea)는 포유동물의 특이유전자 탐색에 사용되는 것이지만, 곤충을 상대로 했을 때에도 잘 적용되는 것을 확인하였다. Virus에 감염된 장과 비 감염된 장으로부터 total RNA를 얻어서 사용하였다.
Virus에 감염된 장과 비 감염된 장으로부터 total RNA를 얻어서 사용하였다. 그 결과 다수의 1차 결과를 얻었지만 reverse PCR결과 많은 false가 확인되었지만 특이적인 DNA단편이 확인되었다(Fig. 1E). 그러나 Fig.
본 연구 결과는 장수풍뎅이(Korean Rhinoceros Beetle, Allomyrina dichotoma)가 Oryctes rhinoceros nudivirus에 감염되면 fat body와 장에서 조직적인 구조변화가 일어나는 것을 관찰되었다. 이와 함께 장에서 특이적으로 발현이 상승하는 유전자로 BTF3H4-like, SPS-like, COPB1, T-CP, HSP70를 보고한다.
후속연구
이 결과는 장수풍뎅이의 대량사육 시 발생하는 질병의 조기진단과 치료에 새로운 기회를 제공할 것이다. 그리고 안정적인 생산성 향상을 통해서 소득증대 효과 및 균일화된 대량사육을 통해서 식품원료로 인정받을 수 있을 것이다.
이와 함께 장에서 특이적으로 발현이 상승하는 유전자로 BTF3H4-like, SPS-like, COPB1, T-CP, HSP70를 보고한다. 이 결과는 장수풍뎅이의 대량사육 시 발생하는 질병의 조기진단과 치료에 새로운 기회를 제공할 것이다. 그리고 안정적인 생산성 향상을 통해서 소득증대 효과 및 균일화된 대량사육을 통해서 식품원료로 인정받을 수 있을 것이다.
이들 유전자에 대한깊은 연구는 질병예찰과 치료에 도움을 줄 수 있는 실마리를제공할 것이다. 이는 장수풍뎅이의 안정적인 대량생산을 통해서 생산성 향상과 소득증대 효과 및 균일화된 대량사육을 통해서 곤충식품원료의 품질관리 가능하게 할 것이다.
참고문헌 (9)
Bhaskar, Kumari, N. and Goyal N. 2012. Cloning, characterization and sub-cellular localization of gamma subunit of T-complex protein-1 (chaperonin) from Leishmania donovani. Biochem. Biophys. Res. Commun. 429, 70-74.
Lee, S., Park, K. H., Nam, S. H., Kwak, K. W. and Choi, J. Y. 2015. First report of Oryctes rhinoceros nudivirus (Coleoptera: Scarabaeidae) causing severe disease in Allomyrina dichotoma in Korea. J. Insect Sci. 15: DOI: 10.1093/jisesa/iev002.
Manley, R., Boots, M. and Wilfert, L. 2015. Emerging viral disease risk to pollinating insects: ecological, evolutionary and anthropogenic factors. J. Appl. Ecol. 52, 331-340.
Suh, H. J., Kim, S. R., Lee, K. S., Park, S. and Kang, S. C. 2010. Antioxidant activity of various solvent extracts from Allomyrina dichotoma (Arthropoda: Insecta) larvae. J. Photochem. Photobiol. B. 99, 67-73.
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