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문제 정의
- 또한 천년초 추출물이 3T3-L1 지방세포의 분화를 억제하고 지방축적과 관련된 PPATγ 및 adipocyte protein2의 mRNA의 발현을 억제하여 항비만 활성을 나타낸다고 보고 되었다(Kim 등, 2011). 따라서 본 연구에서는 천년초에서 추출 분리한 taxifolin이 Lipopolysaccharide(LPS) 에 의해 염증반응이 유도된 대식세포에서 염증작용 및 생리활성에 어떠한 영향을 미치는지를 알아 보고자 하였다.
제안 방법
- 염증성 물질인 PGE2를 합성하는 COX-2에 대한 taxifolin의 저해능을 확인하기 위하여 LPS를 1 µg/mL의 농도가 되도록 처리하고 4시간 배양한 후 추출된 taxifolin을 각 농도별로 처리하였다. 18시간을 배양하여 Western blot을 통해 COX-2 단백질의 발현량을 확인하였다. 그 결과 LPS로 유도된 COX-2의 발현량에 비하여 taxifolin을 500 µM 처리하였을 때 약 66% 이상 감소되는 것을 확인할 수 있었다.
- 18시간 배양 후 배양액의 100 µL와 동일한 Griess reagent를 넣어주고 10분간 상온에서 반응시킨 후 ELISA reader로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. Sodium nitrite의 농도 별 표준곡선을 이용하여 배양액내의 NO 농도를 결정하였다.
- 6 mm, 180Å, C18-A, Varian) 을 사용였다. Taxifolin의 분리는 표준품을 미리 분석하고 동일한 시간대에서 용출되는 분획을 fraction collector를 이용하여 분리하였다. 표준품은 taxifolin (Sigma Co.
- 따라서 No production의 저해효과를 확인하기 위하여 RAW 264.7세포에 염증유발에 주로 사용되는 LPS를 1 µg/mL의 농도가 되도록 처리하고 4시간 배양한 후 추출된 taxifolin을 각 농도별로 처리하였다.
- 또한 taxifolin의 항산화 효과가 α-tocopherol보다 우수하다고 보고하였으며(Lee, 2004), 본 연구에서는 천년초의 taxifolin을 분리하고 항염증 효과를 확인하였다.
- 세포독성. 마우스의 대식세포인 RAW 264.7 세포에 대한 taxifolin이 자극을 일으키지 않는 농도를 확인하기 위하여 MTT assay를 실행하였다. MTT assay는 생존세포의 미토콘드리아의 능력을 이용하는 검사법으로 탈수효소작용에 의하여 노란색의 수용성기질이 청자색을 띄는 비수용성 MTT formazan결정체로 환원된다(Kim 과 Park, 2007).
- NO의 농도는 배양액내의 nitrite 농도를 Griess reagent system을 이용하여 측정하였다(McCartney-Francis 등, 1999). 배양된 RAW 264.7세포에 LPS를 100 ng/mL의 농도가 되도록 처리하고 4시간 배양한 후 추출된 taxifolin을 각 농도 별로 처리 하였다. 18시간 배양 후 배양액의 100 µL와 동일한 Griess reagent를 넣어주고 10분간 상온에서 반응시킨 후 ELISA reader로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 배양이 끝난 후 dimethyl sulfoxide와 ethanol를 1:1 비율이 되도록 섞어준 용액을 150 µL씩 각 well에 분주하고 교반용해시킨 후 550 nm (Benchmark Plus, Bio-Rad)에서 각 well 의 흡광도를 측정하였다.
- 기존의 손바닥 선인장을 이용한 항산화 효과 및 면역계를 활성화시키는 효과 등이 최근 연구에 의해서 밝혀지고 있다(Kwon 과 Song, 2005). 본 실험은 기존의 손바닥 선인장의 한 종류인천년초 추출물 성분 중 taxifolin을 단리하여 LPS에 의해 염증 반응이 유도된 RAW 264.7세포에서 면역관련 인자인 COX-2단백질과 pro-inflammatory cytokine인 TNF-α 및 IL-6의 발현을 유의성 있게 저해하였다. 이 결과를 토대로 천년초의 taxifolin은 염증성 질환의 예방과 치료에 효과적으로 사용할 수 있을 것으로 기대된다.
- 본 연구에서는 RAW 264.7 세포에서 LPS로 염증반응을 유도하였고 taxifolin을 100, 500 µM 처리하였다.
- MTT assay. 세포 독성시험을 통해 천년초에서 추출한 taxifolin의 안정성을 평가하였다. 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide (MTT, Sigma Co.
- 염증성 물질인 PGE2를 합성하는 COX-2에 대한 taxifolin의 저해능을 확인하기 위하여 LPS를 1 µg/mL의 농도가 되도록 처리하고 4시간 배양한 후 추출된 taxifolin을 각 농도별로 처리하였다.
- 2C)을 나타내었다. 이러한 방법으로 천년초 건조분말 50 g에서 26.17 mg의 taxifolin을 회수하였다.
- 1% tween20을 함유한 PBS-T 용액으로 10분씩 5회 세척 후 secondary antibody로 반응시켰다. 이어서 ECL detection kit (Pierce Biotechnology, USA)으로 반응시킨 후 X-ray film 상에서 단백질을 확인하였다. 각 시료의 단백질정량은 BCA protein assay kit (Intron, Korea)를 사용하여 정량하였다.
- Taxifolin의 추출. 천년초 50 g에서 추출한 조추출물을 이용하여 taxifolin을 HPLC를 이용하여 순수분리 하였다. 분리조건은 Table 1에 표시하였다.
- 천년초의 항산화효과를 측정하기 위하여 DPPH 라디칼을 이용하여 측정하였다(Blois, 1958). 천년초는 잎과 열매로 구성되어 있으며 이 중 더욱 효과가 좋은 부분을 확인하기 위하여 나누어 측정하였다. 측정방법은 0.
- 천년초의 항산화활성. 천년초는 잎과 열매의 형태로 구분되어 있으며 각각의 항산화 활성을 측정하였다(Fig. 1). 항산화활성은 IC50값으로 나타내었다.
- Taxifolin 추출. 천년초는 잎과 열매형태로 구분되어 있으며 각각 열매와 잎의 분쇄된 천년초가루 50 g를 메탄올 500 mL를 이용하여 교반하여 상온에서 24시간 동안 추출하였다. 이와 같은 과정을 2회 반복해준 뒤 n-Hexane 용매를 이용하여 수층만을 분리하여 실험에 사용하였다.
- 추출 및 분석을 위해 사용되는 용매는 모두 J.T. baker (USA) 사의 high performance liquid chromatography(HPLC)용 제품을 사용하였으며 천년초로 부터 taxifolin을 분리하기 위하여 사용된 HPLC는 Varian사(USA)의 Pro Star system으로 Prostar 230 pump와 Pro Star 410 auto sampler (10µL sample loop)를 통하여 연결되었고 HPLC에서 얻은 chromatography는 PC에 연결된 STAR STATION (Version 6.41)과 Pro Star 335 Photodiode array detector를 사용하여 분석하였다.
대상 데이터
- 또한 실험에 사용된 1차 항체인 β-actin monoclonal antibody와 cyclooxygenase(COX)-2는 Cell signalling technology (USA)에서 구입하였다. Cytokine assay를 위한 시약은 Koma biotech (Korea) 제품을 사용하였다. Taxifolin 표준품으로는 Sigma Co.
- Cytokine assay를 위한 시약은 Koma biotech (Korea) 제품을 사용하였다. Taxifolin 표준품으로는 Sigma Co. (USA)의 제품을 사용하였다. 그리고 실험에 사용된 모든 시약은 특급시약을 사용하였다.
- 또한 실험에 사용된 1차 항체인 β-actin monoclonal antibody와 cyclooxygenase(COX)-2는 Cell signalling technology (USA)에서 구입하였다.
- 마우스의 대식세포(RAW 264.7, mouse macrophage)는 한국세포주은행(Korean Cell Line Bank)에서 구입하였으며, 이 세포를 37oC, 5% CO2의 조건에서 10% FBS, 50 units/mL의 streptomycin, 100 U/mL의 penicillin (Hyclone, USA)을 첨가하고 Dulbecco’s Modified Eagle Medium (Hyclone)에서 배양하였다.
- 반응 후 흡광광도계를 이용하여 517 nm (Benchmark Plus, Bio-Rad, USA)에서 흡광도를 측정하였다. 모든 실험은 3회 반복 실험하였으며 대조군으로 ascorbic acid를 사용하였고 공시료는 메탄올을 사용하였다. DPPH 라디칼 소거능은 50%를 저해하는 IC50값으로 전환하여 나타내었다.
- 실험재료. 본 실험에 사용된 천년초(Opuntia humifusa)는 충청남도 아산에서 재배된 것으로 (주)패션푸드(Korea)에서 잎과 열매가 분리된 건조분말형태로 구매하여 사용하였다.
- 분석용 컬럼은 Varian사의 Polaris 5 C18-A 250×4.6 mm를 사용하였다.
- 세포배양으로 Dulbecco’s Modified Eagle Medium, fetal bovine serum (FBS), Streptomycin-penicillin 등 세포배양용 시약은 모두 Hyclone (USA) 제품을 사용하였다.
데이터처리
- 대조군과 실험군간의 결과는 mean ± SD로 나타냈으며 t-test로 통계처리의 유의성을 검정하였다.
이론/모형
- 세포 독성시험을 통해 천년초에서 추출한 taxifolin의 안정성을 평가하였다. 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide (MTT, Sigma Co.) assay로 측정하였다. 세포를 96-well plate의 각 well에 1×105 cells/well의 농도로 분주한 다음 24시간 동안 배양하고 taxifolin을 1 µM에서 500µM까지 농도 별로 처리하였다.
- 7 cells were treated with various concentrations (1–500 µM) of taxifolin. Cell viability was measured by MTT assay. Data points and bar represent arithmetic mean ± SD (n =3).
- NO assay. NO의 농도는 배양액내의 nitrite 농도를 Griess reagent system을 이용하여 측정하였다(McCartney-Francis 등, 1999). 배양된 RAW 264.
- 이어서 ECL detection kit (Pierce Biotechnology, USA)으로 반응시킨 후 X-ray film 상에서 단백질을 확인하였다. 각 시료의 단백질정량은 BCA protein assay kit (Intron, Korea)를 사용하여 정량하였다.
- Cytokine assay. 세포 배양액 내의 cytokine의 양을 측정하기 위하여 Enzyme Linked Immunospecific Assay (ELISA, Komabiotech)를 이용하였다. 세포를 96 well plate의 각 well에 1×105 cells/well의 농도로 분주한 다음 24시간 동안 배양하였다.
- Cytokine assay. 염증반응의 지표인 염증성 사이토카인의 생성을 확인하기 위하여 LPS로 염증반응을 유도한 RAW 264.7 cell에서 ELISA 법을 이용하여 측정하였다(Fig. 4). RAW 264.
- DPPH 라디칼 소거능측정. 천년초의 항산화효과를 측정하기 위하여 DPPH 라디칼을 이용하여 측정하였다(Blois, 1958). 천년초는 잎과 열매로 구성되어 있으며 이 중 더욱 효과가 좋은 부분을 확인하기 위하여 나누어 측정하였다.
성능/효과
- 특히 IL-6의 발현량은 대조군 대비 47%까지 감소 하였지만 TNF-α의 발현량은 큰 변화를 보이지는 않았다. LPS가 대식세포의 염증반응을 유도하여 발현된 cytokine 중 IL-6의 발현을 유의성 있게 억제하였다.
- TNF-α의 생성량은 세포만 배양한 무처리군에서는 0.99±1.74 pg/mL로 매우 낮게 측정된 반면, LPS 처리 후 1126.31±45.28 pg/mL로 매우 높게 측정되었다.
- 따라서 이후의 실험은 세포성장률에 영향을 주지 않는 500 µM 농도까지 진행하였다. taxifolin의 항염증효과는 세포생존율의 감소가 아니라 taxifolin의 효과임을 확인할 수 있었다.
- 활성산소종인 NO는 주로 대식세포에서 L-arginine으로부터 iNOS에 의해 합성되는 자유라디칼 물질로서 외부 세균의 침입으로부터 방어하거나 항암작용 또는 독성에 관여하는 전달자로, 과량의 NO 형성은 염증반응을 유도하여 조직의 침윤, 신경손상 등을 유발한다(Stuehr 등, 1991; McCartney Francis 등, 1993). 강한 항산화 활성을 갖는 천년초의 추출물인 taxifolin에서 LPS에 의해 염증반응이 유도된 RAW 264.7 세포는 NO의 생성을 저해함을 확인하였다. 또한 iNOS의 발현억제는 NO 발현억제와 유사한 경향을 나타냄으로 taxifolin에 의한 NO 형성억제는 iNOS의 발현저해를 경유한 것임을 간접적으로 알 수 있었다.
- 그 결과 LPS 처리구(40.38±0.91 µM)에 비하여 taxifolin 50 µM 처리구(27.88±0.15 µM)에선 유의적인 효과를 보여주었으며 500 µM 처리구(17.43±0.27 µM)에서는 NO의 양이 50%이상 줄어드는 것을 확인할 수 있었다.
- 그 결과 LPS로 유도된 COX-2의 발현량에 비하여 taxifolin을 500 µM 처리하였을 때 약 66% 이상 감소되는 것을 확인할 수 있었다.
- 대조군으로 사용된 ascorbic acid의 경우 54.69±1.37 µg/mL로 측정 되었으며 천년초의 열매와 잎추출물의 항산화활성은 40.23±2.21과 38.33±1.07 µg/mL로 측정되었으며 이는 대조군 보다도 더욱 높은 효과를 보였다.
- 7 세포는 NO의 생성을 저해함을 확인하였다. 또한 iNOS의 발현억제는 NO 발현억제와 유사한 경향을 나타냄으로 taxifolin에 의한 NO 형성억제는 iNOS의 발현저해를 경유한 것임을 간접적으로 알 수 있었다.
- 이러한 특성을 이용하여 24시간 동안 처리한 결과 taxifolin은 500 µM 농도에서 1.2% 가량 감소되었지만 매우 적은 수치로 이후 측정 결과에는 영향을 주지 않았다(Fig. 3).
- 특히 IL-6의 발현량은 대조군 대비 47%까지 감소 하였지만 TNF-α의 발현량은 큰 변화를 보이지는 않았다.
후속연구
- 7세포에서 면역관련 인자인 COX-2단백질과 pro-inflammatory cytokine인 TNF-α 및 IL-6의 발현을 유의성 있게 저해하였다. 이 결과를 토대로 천년초의 taxifolin은 염증성 질환의 예방과 치료에 효과적으로 사용할 수 있을 것으로 기대된다.
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