본 연구에서는 천년초 분획물에 따른 항산화 및 항염증 효과를 확인하고자 80% MeOH로 추출하여, 추출물을 EtOAc Fr., n-BuOH Fr. 및 $H_2O$ Fr. 로 용매 분획하였다. 각 분획물에 대하여 총 폴리페놀 함량, DPPH 및 ABTS radical scavenging 방법을 이용한 항산화 활성 측정 결과, 모든 분획에서 항산화 활성을 확인하였고, 그 중 OHRE 분획은 가장 높은 총 폴리페놀 함량(179.3 mg/g)을 나타내었고, $IC_{50}$ 값이 DPPH는 $77.0{\pm}1.38{\mu}g/mL$, ABTS는 $26.3{\pm}2.02{\mu}g/mL$으로 가장 높은 항산화 활성을 나타내었다. 또한 항염증 효과는 PMACI로 HMC-1 cells에 염증을 유발시킨 뒤 천년초 뿌리 분획물을 처리하여 TNF-$\acute{\alpha}$를 비롯해 IL-$1{\beta}$, IL-6, IL-8등의 염증 매게 물질을 효과적으로 억제하는 것을 확인하였다. 이상의 결과로부터 천년초 뿌리는 높은 항산화 활성과 및 염증 매게 물질의 생성을 억제하는 우수한 항염증 효과가 있는 것으로 확인되었다.
본 연구에서는 천년초 분획물에 따른 항산화 및 항염증 효과를 확인하고자 80% MeOH로 추출하여, 추출물을 EtOAc Fr., n-BuOH Fr. 및 $H_2O$ Fr. 로 용매 분획하였다. 각 분획물에 대하여 총 폴리페놀 함량, DPPH 및 ABTS radical scavenging 방법을 이용한 항산화 활성 측정 결과, 모든 분획에서 항산화 활성을 확인하였고, 그 중 OHRE 분획은 가장 높은 총 폴리페놀 함량(179.3 mg/g)을 나타내었고, $IC_{50}$ 값이 DPPH는 $77.0{\pm}1.38{\mu}g/mL$, ABTS는 $26.3{\pm}2.02{\mu}g/mL$으로 가장 높은 항산화 활성을 나타내었다. 또한 항염증 효과는 PMACI로 HMC-1 cells에 염증을 유발시킨 뒤 천년초 뿌리 분획물을 처리하여 TNF-$\acute{\alpha}$를 비롯해 IL-$1{\beta}$, IL-6, IL-8등의 염증 매게 물질을 효과적으로 억제하는 것을 확인하였다. 이상의 결과로부터 천년초 뿌리는 높은 항산화 활성과 및 염증 매게 물질의 생성을 억제하는 우수한 항염증 효과가 있는 것으로 확인되었다.
The roots of Opuntia humifusa (OHR) were extracted with 80% aqueous MeOH and the concentrated extract was partitioned with EtOAc, n-butanol and $H_2O$, successively. The fractions were tested using DPPH and ABST radical scavenging method. The all fractions showed potent scavenging effects...
The roots of Opuntia humifusa (OHR) were extracted with 80% aqueous MeOH and the concentrated extract was partitioned with EtOAc, n-butanol and $H_2O$, successively. The fractions were tested using DPPH and ABST radical scavenging method. The all fractions showed potent scavenging effects. The scavenging effect of the EtOAc fraction was higher than the other fractions, with $IC_{50}$ values as DPPH; $77.0{\pm}1.38{\mu}g/mL$, ABTS: $26.3{\pm}2.02{\mu}g/mL$. And, we investigated anti-inflammatory activities by examining the effects of the OHR fractions on pro-inflammatory cytokine release in the human mast cells (HMC-1). Treatment with OHR fractions clearly reduced the release of the proinflammatory cytokines tumor necrosis factor-alpha (TNF-${\alpha}$), interleukin (IL)-$1{\beta}$, interleukin (IL)-6 and interleukin (IL)-8) in PMACI-stimulated HMC-1 cells. The results showed the potential of OHR as an excellent antioxidant substance and inhibiting inflammatory mediators. Therefore, OHR may be used as a therapeutic approach to various inflammatory diseases.
The roots of Opuntia humifusa (OHR) were extracted with 80% aqueous MeOH and the concentrated extract was partitioned with EtOAc, n-butanol and $H_2O$, successively. The fractions were tested using DPPH and ABST radical scavenging method. The all fractions showed potent scavenging effects. The scavenging effect of the EtOAc fraction was higher than the other fractions, with $IC_{50}$ values as DPPH; $77.0{\pm}1.38{\mu}g/mL$, ABTS: $26.3{\pm}2.02{\mu}g/mL$. And, we investigated anti-inflammatory activities by examining the effects of the OHR fractions on pro-inflammatory cytokine release in the human mast cells (HMC-1). Treatment with OHR fractions clearly reduced the release of the proinflammatory cytokines tumor necrosis factor-alpha (TNF-${\alpha}$), interleukin (IL)-$1{\beta}$, interleukin (IL)-6 and interleukin (IL)-8) in PMACI-stimulated HMC-1 cells. The results showed the potential of OHR as an excellent antioxidant substance and inhibiting inflammatory mediators. Therefore, OHR may be used as a therapeutic approach to various inflammatory diseases.
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문제 정의
따라서 본 연구를 통해 천년초 뿌리의 항산화 효과뿐 아니라, PMACI로 염증이 유발된 비만세포(human mast cell-1)를 타겟 세포로하여 염증 유발 매개물질인 tumor necrosis factor(TNF)-α, interleukin (IL)-1β와 IL-6의 변화를 관찰함으로써 이들의 항염증 효과를 확인하여 천년초 뿌리의 항산화 및 염증 예방에 효과적인 생리기능을 갖는 기능성 소재로서의 가치를 평가하고자 본 연구를 수행하였다.
가설 설정
1)IC50 represents the concentration of a sample required for 50% inhibition of the DPPH radical.
제안 방법
ABTS를 7 mM 농도로 증류수에 용해한 다음 2.4 mM의 potassium persulfate를 가하여 ABTS free radical을 생성시켜 실온의 암소에서 12−16시간 동안 방치 후 사용하였다.
1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) 소거능 측정. Free radical 소거활성은 Blois 등(1958)의 방법을 변형하여 DPPH free radical 소거활성으로 측정하였다. 즉, 각 농도별 추출물 0.
5 mL를 넣고 1분간 혼합하였다. 여기에 탄산나트륨 포화용액 1 mL를 넣은 후 혼합하여 실온에서 1시간 방치시키고 760 nm에서 UV/VIS spectrophotometer (Optizen, Korea)를 사용하여 흡광도를 측정하였다. 총 페놀 함량을 정량하기 위해 표준물질 tannic acid를 DMSO에 녹여 일정한 농도별로 조제하고 시료와 동일한 방법으로 실험하여 검량선을 작성하고 각 추출물의 총 페놀 함량을 측정하였다.
음건한 천년초 뿌리 3.8 kg을 잘게 분쇄하여 80% methanol (MeOH, 10 L×3)을 가하여 실온에서 24시간 3회 반복 추출한 후 여과하였다.
이 후 상등액을 취해 세포에서 분비된 TNF-α, IL-1β, IL-6을 ELISA kit (BD Science, Invirtogen)를 이용하여 그 양을 측정하였다.
염증이 유도된 HMC-1에서의 염증 매게 물질 조절. 인체 유래면역담당 세포인 mast cell-1에서의 천년초 뿌리 분획물의 항염증 효과를 확인하기 전 분획물의 세포독성을 확인하기 위해 MTT assay를 이용하여 각각의 분획물 처리에 의한 HMC-1의 생존율을 확인하였다. 그 결과 각 분획물의 1−100 µg/mL 농도에서 100% 이상의 생존율을 나타내 독성이 없는 것으로 확인되었으며, 동일 농도를 사용하여 항염증 효과를 측정하였다(Fig.
즉, 각 농도별 추출물 0.1 mL에 2×10−4 M DPPH용액 0.1 mL를 가하고 10초간 혼합한 뒤 상온에서 60분간 방치 후 525 nm에서 UV/VIS spectrophotometer를 사용하여 흡광도를 측정하였다.
천년초 뿌리(Opuntia humifusa Root; OHR)를 80% MeOH로 추출을 시행한 후, 용매 계통 분획하여 EtOAc (OHRE), n-BuOH (OHRB) 및 H2O (OHRW) 분획물을 얻었다. 각각의 분획물의 총 폴리페놀 함량을 측정한 결과, OHRE (179.
여기에 탄산나트륨 포화용액 1 mL를 넣은 후 혼합하여 실온에서 1시간 방치시키고 760 nm에서 UV/VIS spectrophotometer (Optizen, Korea)를 사용하여 흡광도를 측정하였다. 총 페놀 함량을 정량하기 위해 표준물질 tannic acid를 DMSO에 녹여 일정한 농도별로 조제하고 시료와 동일한 방법으로 실험하여 검량선을 작성하고 각 추출물의 총 페놀 함량을 측정하였다.
대상 데이터
Cytokine (human IL-1β, IL-6, IL-8과 TNF-α)과 ELISA Set는 BD Biosciences (USA)에서 구입하여 사용하였으며, 실험에 필요한 모든 시약은 특급 시약을 사용하였다.
HMC-1의 염증 유도 및 세포 생존율의 측정을 위한 phorbol-12-myristate 13-acetate plus calcium ionophore A23187 (PMACI)와 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl) 2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), 항산화 측정을 위한 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), 2,2'-azino-bis-3-ethylbenzo-thiazoline-6-sulfonic acid (ABTS)는 Sigma (USA) 제품을 구입하여 사용하였다.
천년초 뿌리 분획물의 항산화력을 측정하기 위해 유리기와 작용하는 free radical 소거 작용을 측정하는 방법인 DPPH와 ABTS system 방법을 이용하여 측정하였다. 대조군으로는 식품 보존제로 널리 이용되는 butylated hydroxy toluene (BHT)과 우수한 항산화 효과가 검증된 비타민 C (ascorbic acid, AsA)를 사용하였다. Free radical 소거활성을 측정한 결과, DPPH와 ABTS 모두 OHRE > OHRB > OHRW 순으로 항산화력이 증가됨을 확인할 수 있었다.
세포배양에 필요한 Iscove’s Modified Dulbecco’s Media(IMDM)와 fetal bovine serum (FBS)은 HyClon (USA) 제품을 구입하여 사용하였다.
실험 재료. 식물재료로 사용된 천년초 뿌리는 2012년 7월 영덕의 솔발재 천년초 농장으로부터 제공받아 사용하였다.
이론/모형
humifusa fractions (1–100 µM) for 12 h. Cell viability was evaluated by MTT colorimetric assay. OHRW; O.
천년초 뿌리 분획물의 항산화력을 측정하기 위해 유리기와 작용하는 free radical 소거 작용을 측정하는 방법인 DPPH와 ABTS system 방법을 이용하여 측정하였다. 대조군으로는 식품 보존제로 널리 이용되는 butylated hydroxy toluene (BHT)과 우수한 항산화 효과가 검증된 비타민 C (ascorbic acid, AsA)를 사용하였다.
ABTS free radical 소거능 측정. 총 항산화력 측정은 Re 등(1999)의 방법에 따라 ABTS를 이용하여 측정하였다. ABTS를 7 mM 농도로 증류수에 용해한 다음 2.
총페놀 함량 측정. 추출물에 대한 시료의 페놀 함량은 Folin-Ciocalteu법(Minussi 등, 2003)에 따라 분광광도계를 이용하여 760 nm에서 흡광도를 측정하여 분석하였다. 각각의 시료를 dimethylsulfoxide (DMSO)에 일정 농도로 녹인 후 0.
성능/효과
Free radical 소거활성을 측정한 결과, DPPH와 ABTS 모두 OHRE > OHRB > OHRW 순으로 항산화력이 증가됨을 확인할 수 있었다.
IL-6의 생성 억제 효과를 살펴본 결과, PMACI 단독처리군에서는 IL-6의 높은 생성(280.6 pg/mL)을 보였고, OHRW 1 µg/mL 처리 농도에서는 294.5 pg/mL의 생성을 보였으나, 100 µg/mL 농도에서는 85.0 pg/mL로 IL-6의 생성이 억제되는 것을 확인하였다.
OHRB의 TNF-α 생성 저해 효과를 살펴본 결과, 농도 의존적으로 생성량이 감소되었고, 1 µg/mL 농도에서 40.9 pg/mL의 생성량을 보여 같은 농도에서 OHRW, OHRE와 비교시에도 더 낮은 생성량을 보였고, 100 µg/mL에서는 OHRE와 유사한 저해 효과를 나타냈다.
OHRB의 경우도 123.8 pg/mL−68.1 pg/mL로 PMACI 처리로 인한 IL-6의 생성을 농도 의존적으로 억제함을 확인하였다.
OHRE는 1 µg/mL 농도에서 49.5 pg/mL로 같은 농도의 OHRW와 유사한 생성 저해효과를 보였으나, 10−100 µg/mL에서는 TNF-α 생성이 현저히 감소(22.2−25.1 pg/mL)되어 분획물 중 가장 낮은 TNF-α 생성을 나타냈으며, PMACI로 염증이 활성화된 HMC-1에서 OHRE가 염증 매개 물질인 TNF-α를 효과적으로 억제하는 것을 확인 할 수 있었다.
OHRE의 IL-6 생성 억제 효과를 살펴본 결과, 1 µg/mL의 농도에서 106.4 pg/mL로 감소됨을 확인할 수 있었고, 10 µg/mL (78.6 pg/mL)와 100 µg/mL (54.0 pg/mL) 농도에서는 PMACl 비처리군(54.2 pg/mL)에 가까운 IL-6생성 억제 효과를 나타내었다.
IL-8은 비만세포를 포함하여 T 세포, B 세포, neutrophil의 migration에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다(Gracie 등, 1999). PMACI 처리로 인해 IL-8 생성이 현저히 증가(51.5 pg/mL)됨을 확인할 수 있었고, 천년초 뿌리 분획물의 처리에 따 라IL-8의 생성량이 효과적으로 감소되어 PMACl 비처리군(13.2 pg/mL)과 유사한 생성량을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
각 분획물에 대하여 총 폴리페놀 함량, DPPH 및 ABTS radical scavenging 방법을 이용한 항산화 활성 측정 결과, 모든 분획에서 항산화 활성을 확인하였고, 그 중 OHRE 분획은 가장 높은 총 폴리페놀 함량(179.3 mg/g)을 나타내었고, IC50 값이 DPPH는 77.0±1.38µg/mL, ABTS는 26.3±2.02 µg/mL으로 가장 높은 항산화 활성을 나타내었다.
O (OHRW) 분획물을 얻었다. 각각의 분획물의 총 폴리페놀 함량을 측정한 결과, OHRE (179.3 mg/g)에서 가장 높게 측정되었고, OHRB에서도 94.8 mg/g으로 비교적 높은 총 폴리페놀 함량을 나타내었다(Table 1). 자생식물 및 약용식물의 총 폴리페놀 함량을 분석한 연구 논문을 살펴보면 비수리가 228.
그 중 OHRE 분획물은 DPPH의 IC50값이 77.0±1.38 µg/mL으로 가장 높은 free radical소거 활성을 나타내었고, ABTS의 IC50 값은26.3±2.02 µg/mL으로 BHT(ABTS: 49.5±0.24 µg/mL) 보다 매우 우수한 소거활성을 나타내었다.
또한 항염증 효과는 PMACI로 HMC-1 cells에 염증을 유발시킨 뒤 천년초 뿌리 분획물을 처리하여 TNF-á를 비롯해 IL-β, IL-6, IL-8등의 염증 매게 물질을 효과적으로 억제하는 것을 확인하였다.
본 실험 결과 천년초 뿌리의 각 분획물(OHRE, OHRB, OHRW)은 PMACI처리로 HMC-1 cells에 염증이 활성화되었을 때, TNF-α를 비롯해 IL-β, IL-6, IL-8등의 염증 매게 물질을 효과적으로 억제하는 것을 확인할 수 있었고, 그 중 OHRE는 PMACI 비처리군에 가까운 염증 억제 효과가 있는 것을 확인하여 천년초 뿌리는 염증성 질환에 매우 효과가 있을 것으로 사료된다.
염증이 활성화된 HMC-1에서 각각의 분획물 처리에 따른 IL-1β 생성량을 확인한 결과, PMACI 단독 처리군(7.9 pg/mL)은 PMACI 비처리군(2.3 pg/mL)에 비해 IL-1β 생성이 증가되었고, 반면 OHRE (4.0−3.7 pg/mL), OHRB (3.2−2.8 pg/mL), OHRW(5.2−3.6 pg/mL)의 처리로 IL-β 생성이 억제되었으며 분획물간의 유의적인 차이는 없었다.
또한 항염증 효과는 PMACI로 HMC-1 cells에 염증을 유발시킨 뒤 천년초 뿌리 분획물을 처리하여 TNF-á를 비롯해 IL-β, IL-6, IL-8등의 염증 매게 물질을 효과적으로 억제하는 것을 확인하였다. 이상의 결과로부터 천년초 뿌리는 높은 항산화 활성과 및 염증 매게 물질의 생성을 억제하는 우수한 항염증 효과가 있는 것으로 확인되었다.
8 mg/g으로 비교적 높은 총 폴리페놀 함량을 나타내었다(Table 1). 자생식물 및 약용식물의 총 폴리페놀 함량을 분석한 연구 논문을 살펴보면 비수리가 228.9 mg/kg으로 가장 높았고, 양파 187.6 mg/g, 오이 171.9 mg/kg 순으로 나타난 결과(Kim 등, 2012)와 비교하여도 천년초 뿌리의 EtOAc 분획의 총 폴리페놀 함량은 179.3 mg/g으로 비교적 높은 것을 확인하였다.
천년초 뿌리 분획물의 PMACI로 염증이 활성화된 비만세포(HMC-1)에서 분비되는 TNF-α의 생성 억제효과를 측정한 결과, TNF-α 생성은 PMACI 비처리군(9.2 pg/mL)에 비해 PMACI 단독처리군(76.8 pg/mL)은 현저히 높게 증가 되었고, 각각의 분획물을 처리함에 따라 유의적으로 생성이 감소됨을 확인할 수 있었다(p <0.05).
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
천년초에 함유된 성분은?
천년초의 가시를 제외한 줄기, 열매, 뿌리, 꽃은 각각의 영양성분 및 색소가 함유되어 있어 상품가치가 뛰어나며, 각각의 특성을 살려 제품화가 가능하다. 특히 천년초는 페놀성 물질과 플라보노이드, 식이섬유, 비타민 C, 칼슘, 무기질 및 아미노산, 복합 다당류 등과 인체에 중요한 각종 영양성분을 함유하고 있으며(Cho 등, 2009), 그 중에서도 식이섬유소와 칼슘은 다른 식물에 비해 다량 함유되어 있다(Choi, 2010). 천년초의 생리활성에 관한 연구로는 항산화 및 병원성 미생물에 대한 항균효과(Lee 등, 2004a; Lee 등, 2005), 자궁경부암 및 유방암에 대한 항암효과(Choi 등, 2005; Yoon 등, 2009), 간 보호 효과(Park 등, 2005) 등이 진행되었고, 천년초를 이용한 가공제품에 관한 연구는 우리 밀 식빵 등 일반 식품 형태로 연구보고 되어 있다 (Kim 등, 2007; Kim과 Hong, 2009).
손바닥선인장의 생리활성에 관한 연구로는 어떤 것들이 있는가?
특히 천년초는 페놀성 물질과 플라보노이드, 식이섬유, 비타민 C, 칼슘, 무기질 및 아미노산, 복합 다당류 등과 인체에 중요한 각종 영양성분을 함유하고 있으며(Cho 등, 2009), 그 중에서도 식이섬유소와 칼슘은 다른 식물에 비해 다량 함유되어 있다(Choi, 2010). 천년초의 생리활성에 관한 연구로는 항산화 및 병원성 미생물에 대한 항균효과(Lee 등, 2004a; Lee 등, 2005), 자궁경부암 및 유방암에 대한 항암효과(Choi 등, 2005; Yoon 등, 2009), 간 보호 효과(Park 등, 2005) 등이 진행되었고, 천년초를 이용한 가공제품에 관한 연구는 우리 밀 식빵 등 일반 식품 형태로 연구보고 되어 있다 (Kim 등, 2007; Kim과 Hong, 2009). 천년초의 생리활성 및 가공제품에 관한 연구는 주로 천년초의 열매와 줄기로 이루어졌으며, 뿌리는 민간에서 혈액순환, 불면증, 심장병 등에 효과가 있는 것으로 알려져 있으며 특히 삼 냄새와 비슷하여 태삼이라 불리기도 한다.
비만세포가 관여하는 염증 반응은?
염증 반응은 생체에 이물질이 감염 또는 침입하였거나 물리화학적 손상을 입었을 때 이를 방어하기 위한 국소적 현상이지만, 과잉의 생체 방어 반응은 염증 국소 주위에 있는 정상 조직을 손상시켜 염증 질환을 일으킨다(Stuehr 등, 1991). 비만세포는 아토피 피부염, 기관지 천식, 알레르기성 비염 같은 염증 반응에 관련되는 주요 세포 중 하나(Baggiolini, 2001)로써 IgE 매개 면역반응과 관련되어 있으며, 특히 외부자극으로부터 활성화된 비만세포는 histamine과 같은 혈관확장물질들을 분비하며, 염증유발물질인 다양한 IL-6, IL-8, TNF-α와 같은 cytokine 분비를 자극한다(Seo 등, 2008).
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