Phaeodactylum tricornutum의 (E)-4-Hydroxy-3-methylbut-2-enyl Diphosphate Reductase 유전자의 형질전환 Transformation of the Diatom Phaeodactylum tricornutum with its Endogenous (E)-4-Hydroxy-3-methylbut-2-enyl Diphosphate Reductase Gene원문보기
신복규
(Laboratory of Biomodulation, Natural Products Research Center, KIST Gangneung Institute of Natural Products)
,
정유진
(Laboratory of Biomodulation, Natural Products Research Center, KIST Gangneung Institute of Natural Products)
,
김상민
(Laboratory of Biomodulation, Natural Products Research Center, KIST Gangneung Institute of Natural Products)
,
판철호
(Laboratory of Biomodulation, Natural Products Research Center, KIST Gangneung Institute of Natural Products)
해양 미세조류인 Phaeodactylum tricornutum은 게놈염기서열이 완전히 밝혀진 규조류로서, 형질전환 방법이 개발되어 있고, 여러 가지 분자생물학적 연구 기술이 개발되어 규조류 연구에서 모델 종으로 여겨지고 있다. 본 연구의 목적은 methylerythritol phosphate (MEP) 대사경로의 마지막 효소인 (E)-4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl diphosphate reductase (HDR)를 코딩하는 P. tricornutum의 Pthdr 유전자를 P. tricornutum에 도입하여 형질전환체를 확보하는 것이다. 유전자 도입 방법은 gold microcarrier를 사용한 bombardment 방법을 사용하였고, 형질전환 유무 및 목적 유전자의 전사체 확인에는 각각 genomic DNA-PCR 및 cDNA-PCR 방법을 사용하였다. 양성대조군으로 egfp 유전자를 P. tricornutum에 도입하여 최종적으로 eGFP 단백질이 발현되는 것을 형광 공초점 현미경을 통해 확인하였다. 이를 바탕으로, 확보된 Pthdr 형질전환체에서도 도입한 Pthdr 유전자로부터 발현된 PtHDR 효소도 잘 발현될 것으로 추측할 수 있었다. 이렇게 준비된 Pthdr 형질전환체는 추후 연구를 통해, P. tricornum의 유용물질인 카로티노이드의 생합성 과정 연구 및 고부가가치 카로티노이드 과발현 균주 개발 등에 유용한 정보를 제공할 것으로 기대된다.
해양 미세조류인 Phaeodactylum tricornutum은 게놈 염기서열이 완전히 밝혀진 규조류로서, 형질전환 방법이 개발되어 있고, 여러 가지 분자생물학적 연구 기술이 개발되어 규조류 연구에서 모델 종으로 여겨지고 있다. 본 연구의 목적은 methylerythritol phosphate (MEP) 대사경로의 마지막 효소인 (E)-4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl diphosphate reductase (HDR)를 코딩하는 P. tricornutum의 Pthdr 유전자를 P. tricornutum에 도입하여 형질전환체를 확보하는 것이다. 유전자 도입 방법은 gold microcarrier를 사용한 bombardment 방법을 사용하였고, 형질전환 유무 및 목적 유전자의 전사체 확인에는 각각 genomic DNA-PCR 및 cDNA-PCR 방법을 사용하였다. 양성대조군으로 egfp 유전자를 P. tricornutum에 도입하여 최종적으로 eGFP 단백질이 발현되는 것을 형광 공초점 현미경을 통해 확인하였다. 이를 바탕으로, 확보된 Pthdr 형질전환체에서도 도입한 Pthdr 유전자로부터 발현된 PtHDR 효소도 잘 발현될 것으로 추측할 수 있었다. 이렇게 준비된 Pthdr 형질전환체는 추후 연구를 통해, P. tricornum의 유용물질인 카로티노이드의 생합성 과정 연구 및 고부가가치 카로티노이드 과발현 균주 개발 등에 유용한 정보를 제공할 것으로 기대된다.
Phaeodactylum tricornutum is a model diatom that its genomic information and biological tools are well established. In this study, a gene encoding (E)-4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl diphosphate reductase (PtHDR), a terminal enzyme of the methylerythritol phosphate pathway regulating chlorophyll and ca...
Phaeodactylum tricornutum is a model diatom that its genomic information and biological tools are well established. In this study, a gene encoding (E)-4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl diphosphate reductase (PtHDR), a terminal enzyme of the methylerythritol phosphate pathway regulating chlorophyll and carotenoid biosynthesis, was isolated from P. tricornutum. The isolated gene was cloned into pPha-T1 vector containing fcpA promoter to prepare pPha-T1-HDR plasmid. As a positive control, pPha-T1-eGFP plasmid was constructed with egfp gene. Stable nuclear transformation was carried out with these plasmids by particle bombardment method and zeocin resistant colonies of P. tricornutum were selected on f/2 agar plate. In result, transformation efficiency was evaluated according to the amount of plasmid DNA coated with gold particles. Integration of introduced plasmids was confirmed with genomic DNA of each transformant by polymerase chain reaction. The eGFP fluorescence was visible in the cytoplasm, indicating that eGFP was successively expressed in P. tricornutum system. The transcript level of exogenous Pthdr gene was evaluated with the obtained transformants. The results presented here demonstrated that introduction of Pthdr gene into P. tricornutum chromosome succeeded and expression of PtHDR was enhanced under the fcpA promoter.
Phaeodactylum tricornutum is a model diatom that its genomic information and biological tools are well established. In this study, a gene encoding (E)-4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl diphosphate reductase (PtHDR), a terminal enzyme of the methylerythritol phosphate pathway regulating chlorophyll and carotenoid biosynthesis, was isolated from P. tricornutum. The isolated gene was cloned into pPha-T1 vector containing fcpA promoter to prepare pPha-T1-HDR plasmid. As a positive control, pPha-T1-eGFP plasmid was constructed with egfp gene. Stable nuclear transformation was carried out with these plasmids by particle bombardment method and zeocin resistant colonies of P. tricornutum were selected on f/2 agar plate. In result, transformation efficiency was evaluated according to the amount of plasmid DNA coated with gold particles. Integration of introduced plasmids was confirmed with genomic DNA of each transformant by polymerase chain reaction. The eGFP fluorescence was visible in the cytoplasm, indicating that eGFP was successively expressed in P. tricornutum system. The transcript level of exogenous Pthdr gene was evaluated with the obtained transformants. The results presented here demonstrated that introduction of Pthdr gene into P. tricornutum chromosome succeeded and expression of PtHDR was enhanced under the fcpA promoter.
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문제 정의
Genomic DNA-PCR을 통한 유전자 삽입 확인. 본 실험에서 P. tricornutum에 형질전환시킨 세 종의 플라스미드가 크로모좀에 안정적으로 도입되었는지를 확인하기 위해서 genomic DNAPCR을 수행하였다. 배양된 각 형질전환체로부터 genomic DNA를 추출한 후 크로모좀에 도입된 플라스미드 DNA를 검출할 수 있는 PCR을 수행하였다.
tricornutum은 fucoxanthin이라는 유용한 최종 산물을 다량 함유하고 있고 그 생합성 기작이 명확하지 않기 때문에 연구의 가치가 높으며, 게놈 염기서열이 밝혀진 점 및 형질전환 방법이 개발된 점 때문에 이러한 연구 목적에 알맞다(Apt 등, 1996; Siaut 등, 2007; Bowler 등, 2008; De Riso 등, 2009). 본 연구에서는 미세조류에서 HDR 단백질 발현 증대와 카로티노이드 등의 최종 대사산물과의 상관관계를 연구하기 위한 첫 단계로 P. tricornutum의 HDR 단백질 과발현 형질 전환체를 확보하는 것을 진행하였다.
해양 미세조류인 Phaeodactylum tricornutum은 게놈 염기서열이 완전히 밝혀진 규조류로서, 형질전환 방법이 개발되어 있고, 여러 가지 분자생물학적 연구 기술이 개발되어 규조류 연구에서 모델 종으로 여겨지고 있다. 본 연구의 목적은 methylerythritol phosphate (MEP) 대사경로의 마지막 효소인 (E)-4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl diphosphate reductase (HDR)를 코딩하는 P. tricornutum의 Pthdr 유전자를 P. tricornutum에 도입하여 형질전환체를 확보하는 것이다. 유전자 도입 방법은 gold microcarrier를 사용한 bombardment 방법을 사용하였고, 형질전환 유무 및 목적 유전자의 전사체 확인에는 각각 genomic DNA-PCR 및 cDNA-PCR 방법을 사용하였다.
제안 방법
tricornutum 배양액 50 mL를 3,500 rpm에서 15분간 원심분리하여 미세조류 세포를 회수한 후, 액체 질소에 얼려서 갈고, 앞서 기술한 바와 같이 RNA를 추출하고, cDNA를 합성하였다. Genomic DNA에 도입된 각 플라스미드에서 각 유전자의 전사체(transcript)가 만들어지는지 확인하기 위하여 PCR을 수행하였다. Pthdr 유전자의 경우는 endogenous Pthdr 전사체와 도입된 플라스미드 유래 Pthdr 전사체를 구별하기 위해 PtHDR-F/pPha-T1-R 프라이머 조합을 사용하였고, 전체 Pthdr 전사체를 검출하기 위해 PtHDR-F/-R 프라이머를 사용하였다(Table 1).
Microcarrier는 직경 1 µm gold 입자에 1 µg의 목적 유전자가 포함된 플라스미드를 코팅하여 사용하고, 유전자 발사 시점으로부터 P.tricornutum까지의 거리는 6 cm, 발사압력은 1,350 psi로 하였다.
P. tricornutum 형질전환체 배양액 50 mL를 취하여 원심분리 (3,500 rpm, 15분) 를 통해 세포를 모은 후, 액체 질소에 얼려서 분쇄한 후, DNeasy® Plant Mini Kit (QIAGEN)로 genomic DNA를 추출하였다.
추출한 genomic DNA를 사용하여 PCR을 수행하였다. P. tricornutum의 게놈에 Pthdr 유전자가 이미 존재하기 때문에 pPha-T1-HDR 플라스미드의 형질전환 유무에는 PtHDR-F 프라이머와 pPha-T1 벡터의 multi cloning 지역에 위치한 pPha-T1-R 프라이머를 사용하였다(Table 1). egfp 유전자의 경우는 eGFP-F/-R 프라이머를 사용하였고, pPhaT1 벡터 형질전환체의 확인에는 zeocin 항생제 유전자를 검출하기 위해 Shble-F/-R 프라이머를 사용하였다.
PCR은 Taqpolymerase를 사용하였으며, 95°C에서 30초, 60°C에서 30초, 그리고 72℃에서 2분 주기로 35회 순환 시켰다.
PtHDR 효소의 1차 구조를 분석하기 위하여 다른 미세조류 및 식물, 박테리아 유래 HDR 효소의 아미노산 서열과 비교해보았다(Fig. 3). HDR에서는 활성자리의 Fe/S 클러스터를 잡는 3개의 Cys 잔기(C114, 206, 337), 기질 결합과 관련이 있는 2개의 His 잔기(H144, 234) 및 1개의 Ser (S370), 1개의 Asn(N372), 그리고 수소전달과 관련 1개의 Glu (E236)와 1개의 Thr (T299) 등, 총 9개의 염기서열이 공통 염기 서열로 알려져있다(Gräwert 등, 2004; Gräwert 등, 2009; Gräwert 등, 2010; Span 등, 2012).
Pthdr 유전자 형질전환체를 얻기 위해, 형질전환 시 두 가지조건을 변경하여 실험을 진행하였다. 첫째로, gold microcarrier에 코팅하는 플라스미드 양을 1 µg부터 4 µg까지 다르게 하였다.
Genomic DNA에 도입된 각 플라스미드에서 각 유전자의 전사체(transcript)가 만들어지는지 확인하기 위하여 PCR을 수행하였다. Pthdr 유전자의 경우는 endogenous Pthdr 전사체와 도입된 플라스미드 유래 Pthdr 전사체를 구별하기 위해 PtHDR-F/pPha-T1-R 프라이머 조합을 사용하였고, 전체 Pthdr 전사체를 검출하기 위해 PtHDR-F/-R 프라이머를 사용하였다(Table 1). egfp 유전자의 경우는 eGFP-F/-R 프라이머를 사용하였다.
Pthdr 유전자 정보 및 클로닝. The Diatom EST Database 및 Diatom Cyc: Encyclopedia of Diatom Genes and Metabolism에서 Pthdr 유전자의 염기 서열을 확인하였다. 현재까지 알려진 정보에 의하면 P.
공초점 현미경은 서울대학교 농생명과학공동기기원의 SP8XSTED (Leica)를 사용하였다. eGFP 단백질의 형광 발현을 확인하기 위해, excitation 파장은 488 nm로 하였고, 507 nm에서 형광파장을 측정하였다.
Confocal Microscopy. egfp 유전자가 도입된 P. tricornutum 형질전환체 내의 eGFP 발현 여부는 공초점 현미경을 통해 확인하였다. 공초점 현미경은 서울대학교 농생명과학공동기기원의 SP8XSTED (Leica)를 사용하였다.
각 플라스미드가 포함된 E. coli는 200 mL LB배지(amplicilin 50 µg/mL 포함)에서 배양 후, HiSpeed® Plasmid Midi Kit (QIAGEN)로 플라스미드를 회수한 후, phenol/chloroform 방법으로 정제하여 최종 농도가 1.0 µg/mL이 되도록 제조하여 P. tricornutum 형진전환에 사용하였다.
유전자 발현 확인. 도입된 각각의 플라스미드가 정상적으로 목적 유전자의 전사체를 만드는지 확인하기 위하여 cDNA-PCR을 통해 전사체를 확인하였다. pPha-T1 벡터는 목적 유전자의 발현을 위해 미세조류 유래 fcpA 프로모터를 사용하여 항상 안정적인 전사체를 만들도록 디자인되었다(Zaslavskaia 등, 2000).
첫째로, gold microcarrier에 코팅하는 플라스미드 양을 1 µg부터 4 µg까지 다르게 하였다. 둘째는 bombardment 후 P. tricornutum의 회복시간을 1일에서 3일까지 변화하였다. P.
배양 시 박테리아 오염을 제거하기 위해 ampicillin(50 µg/mL), kanamycin (10 µg/mL), 그리고 streptomycin (50 µg/mL)을 첨가하였다.
tricornutum에 형질전환시킨 세 종의 플라스미드가 크로모좀에 안정적으로 도입되었는지를 확인하기 위해서 genomic DNAPCR을 수행하였다. 배양된 각 형질전환체로부터 genomic DNA를 추출한 후 크로모좀에 도입된 플라스미드 DNA를 검출할 수 있는 PCR을 수행하였다. DiatomCyc database에서 확인한 바에 의하면 Pthdr 유전자의 경우 217 bps의 intron을 지니고 있을 것으로 추측되어 PCR을 통해 endogenous Pthdr 유전자와 플라스미드 유래 Pthdr 유전자를 구별할 수 있을 것으로 기대하였으나, PCR 결과 이의 구별이 명확하지 않았다.
본 실험에 사용한 Pthdr 유전자는 P. tricornutum (UTEX646)의 cDNA 로부터 PCR (PtHDR-F/-R) 을 통해 증폭하였고, egfp 유전자는 pEGFP-C2 벡터로부터 eGFP-F/-R primer를 사용하여 PCR로 증폭하였다(Fig. 2). 증폭한 Pthdr 및 egfp 유전자는 제한효소 처리 후 pPha-T1 벡터에 클로닝 하였다.
선별배지 위에 형성된 각각의 콜로니를 f/2 배지에서 200 µL,2.0 mL, 20 mL, 그리고 200 mL 순으로 부피를 늘리면서 배양하였다.
유전자 도입 방법은 gold microcarrier를 사용한 bombardment 방법을 사용하였고, 형질전환 유무 및 목적 유전자의 전사체 확인에는 각각 genomic DNA-PCR 및 cDNA-PCR 방법을 사용하였다. 양성대조군으로 egfp 유전자를 P. tricornutum에 도입하여 최종적으로 eGFP 단백질이 발현되는 것을 형광 공초점 현미경을 통해 확인하였다. 이를 바탕으로, 확보된 Pthdr 형질전환체에서도 도입한 Pthdr 유전자로부터 발현된 PtHDR 효소도 잘 발현될 것으로 추측할 수 있었다.
coli (DH5a)에 형질전환 된 후 ampicillin (50 µg/mL)이 포함된 LB 배지에서 스크리닝되어 최종적으로 pPha-T1-HDR 플라스미드를 확보하였다. 양성대조군으로 사용할 Enhanced green fluorescence protein (egfp) 유전자는 pEGFP-C2 벡터로부터 PCR을 통하여 분리되었고, 위와 같은 방법으로 pPha-T1 벡터에 클로닝되어 최종적으로 pPha-T1-eGFP 플라스미드를 확보하였다. 각 플라스미드가 포함된 E.
유전자 도입 후, P. tricornutum은 f/2 한천배지에서 그대로 1−3일 동안 5,000 LUX 형광등 빛, 18°C에서 회복을 위한 배양을 하였다.
DNA가 코팅 된 gold microcarrier는 70, 100% 에탄올 순으로 씻은 후에 100% 에탄올에 현탁하여 사용하였다. 유전자도입은 1,350 psi에서 발사 지점부터 형질전환 대상 세포 간의 거리 6 cm에서 실시하였다.
이 결과를 토대로 본 연구에서도 형질전환체 선별을 위해 50% 인공해수를 사용하여 100 µg/mL 농도의 zeocin이 함유된 f/2 배지를 사용하였다.
이 후 QuantiTect® Reverse Transcription Kit (QIAGEN)의 프로토콜에 따라 cDNA를 합성하였다.
이에 PCR시 자가 유전자의 증폭을 제한하고 도입 유전자만 확인하기 위해, Pthdr 유전자 ORF 5' 말단 부분(PtHDR-F)과, pPha-T1 vector의 multi cloning 지역(pPha-T1-R)을 기준으로 프라이머를 제작하여 PCR을 진행하였다(Table 1).
이후 E. coli (DH5a)에 형질전환 된 후 ampicillin (50 µg/mL)이 포함된 LB 배지에서 스크리닝되어 최종적으로 pPha-T1-HDR 플라스미드를 확보하였다.
정지기까지 키운 1.5×107 cells/mL 농도의 P. tricornutum 배양액 50 mL를 3,500 rpm에서 15분간 원심분리하여 미세조류 세포를 회수한 후, 액체 질소에 얼려서 갈고, 앞서 기술한 바와 같이 RNA를 추출하고, cDNA를 합성하였다.
첫째로, gold microcarrier에 코팅하는 플라스미드 양을 1 µg부터 4 µg까지 다르게 하였다.
tricornutum 형질전환체 배양액 50 mL를 취하여 원심분리 (3,500 rpm, 15분) 를 통해 세포를 모은 후, 액체 질소에 얼려서 분쇄한 후, DNeasy® Plant Mini Kit (QIAGEN)로 genomic DNA를 추출하였다. 추출한 genomic DNA를 사용하여 PCR을 수행하였다. P.
형질전환 콜로니는 100 µg/mL zeocin이 첨가된 f/2 액체 배지에 200 µL, 2.0 mL, 20 mL 그리고 200 mL순으로 20°C, 5,000 LUX 형광등 빛에서 교반 배양하였다.
형질전환 후 안정화를 위해 24시간 동안 18°C, 5,000 LUX 형광등 빛에서 배양한 후, 100 µg/mL zeocin을 사용하여 형질전환체를 선별하였다.
tricornutum을 20°C, 5,000 LUX 형광등 빛에서 24시간 동안 배양한 후, bombardment를 통한 형질전환에 사용하였다. 형질전환에는 pPha-T1-HDR, pPha-T1-eGFP 플라스미드와 음성 대조군으로 pPha-T1 벡터를 사용하였다(Table 1). 형질전환은 Biolistic® PDS-1000/He Particle Delivery System (BIO-RAD, USA)을 사용하였다.
Genomic DNA-PCR. 확보한 P. tricornutum의 형질전환체로부터 유전자 도입을 통해 크로모좀(chromosome)에 각 플라스미드가 안정적으로 도입되었는지를 genomic DNA-PCR을 통하여 확인하였다. P.
대상 데이터
배양. P. tricornutum Bohlin은 UTEX The Culture Collection of Algae at The University of Texas at Austin (UTEX646)으로부터 분양 받아 사용하였다. 배양에는 f/2 배지를 사용하였고(Guillard and Ryther, 1962; Guillard, 1975), 20°C에서 통기(aeration)배양하였다.
P. tricornutum의 HDR 효소에 대한 유전자 정보는 ‘The Diatom EST Database (http://www.diatomics.biologie.ens.fr/EST3/index.php)’ 및 ‘Diatom Cyc: Encyclopedia of Diatom Genes and Metabolism (http://www.diatomcyc.org/)’으로부터 확보하였다(EST data; G41845, DiatomCyc; PHATRDRAFT_50808).
org/)’으로부터 확보하였다(EST data; G41845, DiatomCyc; PHATRDRAFT_50808). P. tricornutum의 형질전환에 사용할 pPha-T1 vector는 Peter Kroth 박사로부터 분양받았다(Zaslavskaia 등, 2000). P.
f/2 한천배지에 도말한 P. tricornutum을 20°C, 5,000 LUX 형광등 빛에서 24시간 동안 배양한 후, bombardment를 통한 형질전환에 사용하였다.
tricornutum 형질전환체 내의 eGFP 발현 여부는 공초점 현미경을 통해 확인하였다. 공초점 현미경은 서울대학교 농생명과학공동기기원의 SP8XSTED (Leica)를 사용하였다. eGFP 단백질의 형광 발현을 확인하기 위해, excitation 파장은 488 nm로 하였고, 507 nm에서 형광파장을 측정하였다.
또한 규소가 결핍된 배지에서 배양하면 규소 기반의 세포벽 생성을 최소화하여 bombardment시 형질전환 효율이 증가한다는 보고가 있다(Niu 등, 2012). 따라서 형질전환을 위한 P. tricornutum의 배양에서는 f/2에서 규소 성분을 제외한 f/2-Si 배지를 사용하였다. 형질전환 이후 선별과정에서, 100% 해수를 사용할 때보다 50% 해수를 사용할 경우 zeocin 항생제에 대한 민감도가 증가하는 것으로 알려져 있다(Falciatore 등, 1999).
배양 시 박테리아 오염을 제거하기 위해 ampicillin(50 µg/mL), kanamycin (10 µg/mL), 그리고 streptomycin (50 µg/mL)을 첨가하였다. 형질전환을 위한 배양에는 f/2 배지 성분 중 Na2SiO3를 제외한 배지 f/2-Si를 사용하였다.
이론/모형
tricornutum의 게놈에 Pthdr 유전자가 이미 존재하기 때문에 pPha-T1-HDR 플라스미드의 형질전환 유무에는 PtHDR-F 프라이머와 pPha-T1 벡터의 multi cloning 지역에 위치한 pPha-T1-R 프라이머를 사용하였다(Table 1). egfp 유전자의 경우는 eGFP-F/-R 프라이머를 사용하였고, pPhaT1 벡터 형질전환체의 확인에는 zeocin 항생제 유전자를 검출하기 위해 Shble-F/-R 프라이머를 사용하였다. PCR은 Taqpolymerase를 사용하였으며, 95°C에서 30초, 60°C에서 30초, 그리고 72℃에서 2분 주기로 35회 순환 시켰다.
tricornutum에 도입하여 형질전환체를 확보하는 것이다. 유전자 도입 방법은 gold microcarrier를 사용한 bombardment 방법을 사용하였고, 형질전환 유무 및 목적 유전자의 전사체 확인에는 각각 genomic DNA-PCR 및 cDNA-PCR 방법을 사용하였다. 양성대조군으로 egfp 유전자를 P.
형질전환은 Biolistic® PDS-1000/He Particle Delivery System (BIO-RAD, USA)을 사용하였다.
성능/효과
배양된 각 형질전환체로부터 genomic DNA를 추출한 후 크로모좀에 도입된 플라스미드 DNA를 검출할 수 있는 PCR을 수행하였다. DiatomCyc database에서 확인한 바에 의하면 Pthdr 유전자의 경우 217 bps의 intron을 지니고 있을 것으로 추측되어 PCR을 통해 endogenous Pthdr 유전자와 플라스미드 유래 Pthdr 유전자를 구별할 수 있을 것으로 기대하였으나, PCR 결과 이의 구별이 명확하지 않았다. 이에 PCR시 자가 유전자의 증폭을 제한하고 도입 유전자만 확인하기 위해, Pthdr 유전자 ORF 5' 말단 부분(PtHDR-F)과, pPha-T1 vector의 multi cloning 지역(pPha-T1-R)을 기준으로 프라이머를 제작하여 PCR을 진행하였다(Table 1).
pPha-T1 벡터는 목적 유전자의 발현을 위해 미세조류 유래 fcpA 프로모터를 사용하여 항상 안정적인 전사체를 만들도록 디자인되었다(Zaslavskaia 등, 2000). Pthdr 형질전환체의 경우, genomic DNA-PCR과 마찬가지로, 자가 유전자 증폭을 제한하기 위해 PtHDR-F/pPha-T1-R 프라이머 조합을 사용하여 PCR을 수행한 결과, Fig. 4에 나타낸 것처럼 각 형질전환체의 전사체 발현이 다양한 정도로 나타남을 확인할 수 있었다. 하지만 6번 형질전환체는 Pthdr 유전자 증폭이 전혀 이루어지지 않았고, 10번 형질전환체는 다른 형질전환체에 비해 약한 발현량을 보였다.
공초점 현미경을 통한 eGFP 단백질 발현 조사. pPha-T1-eGFP 플라스미드가 도입된 P. tricornutum 형질전환체 내에 발현된 eGFP 단백질은 형광 공초점 현미경을 통해 확인할 수 있었다 (Fig. 6). 각 형질전환체에서 eGFP 단백질의 발현은 이미 보고된 결과와 마찬가지로 엽록체를 제외한 세포질(cytoplasm)에서 발현되는 것을 확인할 수 있었다(Tanaka 등, 2005).
이에 PCR시 자가 유전자의 증폭을 제한하고 도입 유전자만 확인하기 위해, Pthdr 유전자 ORF 5' 말단 부분(PtHDR-F)과, pPha-T1 vector의 multi cloning 지역(pPha-T1-R)을 기준으로 프라이머를 제작하여 PCR을 진행하였다(Table 1). 그 결과 야생형(WT) 및 음성 대조군(NC)을 제외한 Pthdr 형질전환체에서만 PCR 밴드를 확인할 수 있었다(Fig. 4). 이를 통해 pPha-T1-HDR 플라스미드가 안정적으로 P.
그 결과 총 12개의 Pthdr 형질전환체 콜로니를 확보할 수 있었으며, 플라스미드농도 2−3 µg, 2−3일의 회복시간 조건에서 가장 많은 형질전환 효율을 얻을 수 있었다.
tricornutum의 크로모좀에 삽입되었음을 확인할 수 있었다. 양성대조군인 6개의 egfp 형질전환체와 음성대조군에서도 genomic DNA로부터 PCR을 통해 정확한 PCR 밴드를 확인하여 pPha-T1-eGFP 플라스미드가 안정적으로 도입되었음을 확인할 수 있었다(Fig. 5).
tricornutum의 야생형과 음성대조군에서는 eGFP의 발현을 확인할 수 없었다. 이 결과를 바탕으로 pPha-T1 벡터를 활용한 형질전환체에서 도입 유전자가 단백질 수준까지 잘 작동하고 있음을 확인할 수 있었다. 현 단계에서는 도입한 Pthdr 유전자가 단백질 수준까지 잘 발현되는지를 확인할 수 없으나, egfp 형질전환체에서 단백질이 잘 발현되는 것이 확인된 만큼 도입된 Pthdr 유전자도 단백질까지 잘 발현된 것이라고 예상할 수 있었다.
4와 같다. 이 결과에서 모든 형질전환체 및 야생형, 음성대조군에서 모두 전사체가 증폭되는 것을 확인할 수 있었는데, 이는 자생 Pthdr 유전자가 일반적으로 어느 정도 발현되고 있음을 알 수 있었다. 앞으로 fcpA 프로모터 조절을 받는 도입된 Pthdr 유전자의 발현이 야생형 P.
tricornutum에 도입하여 최종적으로 eGFP 단백질이 발현되는 것을 형광 공초점 현미경을 통해 확인하였다. 이를 바탕으로, 확보된 Pthdr 형질전환체에서도 도입한 Pthdr 유전자로부터 발현된 PtHDR 효소도 잘 발현될 것으로 추측할 수 있었다. 이렇게 준비된 Pthdr 형질전환체는 추후 연구를 통해, P.
4). 이를 통해 pPha-T1-HDR 플라스미드가 안정적으로 P. tricornutum의 크로모좀에 삽입되었음을 확인할 수 있었다. 양성대조군인 6개의 egfp 형질전환체와 음성대조군에서도 genomic DNA로부터 PCR을 통해 정확한 PCR 밴드를 확인하여 pPha-T1-eGFP 플라스미드가 안정적으로 도입되었음을 확인할 수 있었다(Fig.
그 결과 총 12개의 Pthdr 형질전환체 콜로니를 확보할 수 있었으며, 플라스미드농도 2−3 µg, 2−3일의 회복시간 조건에서 가장 많은 형질전환 효율을 얻을 수 있었다. 이를 통해 도입하는 유전자의 종류 및 크기에 따라 microcarrier에 코팅하는 플라스미드의 양 및 bombardment 후 치유시간의 차이가 형질전환 효율에 영향을 준다는 것을 알 수 있었다.
tricornutum의 MEP 대사경로 및 그 이후의 카로티노이드 등의 생합성에 어떻게 영향을 주는지 추가적인 연구가 필요하다. 한편 양성대조군인 egfp 형질전환체에서는 5번에서만 gene silencing 현상이 관찰되었고, 나머지 형질전환체에서는 모두 egfp 전사체가 잘 발현이 된 것을 확인할 수 있었다(Fig. 5).
이 결과를 바탕으로 pPha-T1 벡터를 활용한 형질전환체에서 도입 유전자가 단백질 수준까지 잘 작동하고 있음을 확인할 수 있었다. 현 단계에서는 도입한 Pthdr 유전자가 단백질 수준까지 잘 발현되는지를 확인할 수 없으나, egfp 형질전환체에서 단백질이 잘 발현되는 것이 확인된 만큼 도입된 Pthdr 유전자도 단백질까지 잘 발현된 것이라고 예상할 수 있었다. 단백질 발현량은 직접적으로 확인하지는 못하였으나, 이미 보고된 논문을 참고하면, P.
후속연구
이 결과에서 모든 형질전환체 및 야생형, 음성대조군에서 모두 전사체가 증폭되는 것을 확인할 수 있었는데, 이는 자생 Pthdr 유전자가 일반적으로 어느 정도 발현되고 있음을 알 수 있었다. 앞으로 fcpA 프로모터 조절을 받는 도입된 Pthdr 유전자의 발현이 야생형 P. tricornutum의 MEP 대사경로 및 그 이후의 카로티노이드 등의 생합성에 어떻게 영향을 주는지 추가적인 연구가 필요하다. 한편 양성대조군인 egfp 형질전환체에서는 5번에서만 gene silencing 현상이 관찰되었고, 나머지 형질전환체에서는 모두 egfp 전사체가 잘 발현이 된 것을 확인할 수 있었다(Fig.
이를 바탕으로, 확보된 Pthdr 형질전환체에서도 도입한 Pthdr 유전자로부터 발현된 PtHDR 효소도 잘 발현될 것으로 추측할 수 있었다. 이렇게 준비된 Pthdr 형질전환체는 추후 연구를 통해, P. tricornum의 유용물질인 카로티노이드의 생합성 과정 연구 및 고부가가치 카로티노이드 과발현 균주 개발 등에 유용한 정보를 제공할 것으로 기대된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
HDR은 생합성 과정 중, IPP와 DMAPP 비율을 결정하는 첫 단계의 중요한 효소인 이유는?
1). IPP와 DMAPP는 테르페노이드 계열 화합물의 전구체로 사용되며 IPP와 DMAPP 비율에 따라 geranyl diphosphate (GPP, IPP:DMAPP=1:1), farnesyl diphsophat (FPP, IPP:DMAPP=2:1), 그리고 geranylgeranyl diphosphate (GGPP, IPP:DMAPP=3:1)가 형성된다. 이렇게 형성된 FPP, GPP와 GGPP는 카로티노이드, 테프펜류 화합물, 클로로필 등의 생합성에 쓰이게 된다. 따라서 HDR은 생합성 과정 중, IPP와 DMAPP 비율을 결정하는 첫 단계의 중요한 효소라 할 수 있다.
규조류란?
규조류(Diatom)는 풍부하고 다양한 광합성 미세조류로 해수 및 담수 모두에서 발견된다(Werner, 1977; Round 등, 1990). 이런 규조류는 지구생물화학적 순환에서 중요한 역할을 하며, 지구 일차대사산물의 20%를 생산한다(Falkowski 등, 1998; Field 등, 1998; Kroth, 2007).
규조류는 어떤 역할을 하는가?
규조류(Diatom)는 풍부하고 다양한 광합성 미세조류로 해수 및 담수 모두에서 발견된다(Werner, 1977; Round 등, 1990). 이런 규조류는 지구생물화학적 순환에서 중요한 역할을 하며, 지구 일차대사산물의 20%를 생산한다(Falkowski 등, 1998; Field 등, 1998; Kroth, 2007). 규조류는 크게 두 분류, 즉 pennates와 centrics로 나누어 진다.
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