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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 익모초의 화장품 원료로서의 가능성을 알아보기 위해서 익모초 추출물의 각 용매분획별 항산화 활성, 항노화 활성 및 항균 효과를 측정하였다.
제안 방법
- DPPH radical (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) 소거활성 측정은 Blois의 방법[12]을 변형하여 실시하였다. 각 농도별로 조제한 시료 20 ㎕와 0.
- 11 U 엘라스타제 20㎕를 가하여 배양기에서 37 ℃로 20분 동안 반응시켰다. 반응 후 ELISA reader를 이용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하였고 시료를 첨가하지 않은 대조군과 비교하여 엘라스타제 저해 활성을 백분율(%)로 나타내었다.
- 5 mM tyrosine 50 ㎕를 혼합하여 37 ℃에서 10분간 반응시켰다. 반응이 끝난 후 ELISA reader를 사용하여 492 nm 에서 흡광도를 측정하였으며, 추출물을 첨가하지 않은 대조군과 비교하여 티로시나제 저해 활성을 산출하였다.
- 균액이 마르는 사이 멸균된 paper disc (6 mm)에 추출물을 농도별로 20 ㎕씩 올려 휘발시킨 후 plate 위에 놓고 24～48시간동안 배양하였다. 배양이 끝난 후 disc 주위의 clear zone의 직경(mm)을 생육저해환으로서 비교하였다[15].
- 본 연구에서는 익모초를 70% 에탄올로 추출한 후 극성별 유기용매로 분획하여 유효성분 확인(총 폴리페놀 함량, 총 플라보노이드 함량), 항균 효과, 항산화 효과, 항노화 효과 등을 측정하여 다음과 같은 결론을 얻었다. 익모초 추출물 및 용매별 분획의 총 폴리페놀과 플라보노이드 함량을 측정한 결과 MC 분획과 EtOAc 분획에서 각각 200 ㎍/㎖ 이상, 60 ㎍/㎖ 이상으로 가장 높게 나타났다.
- 그후 ELISA reader를 사용하여 560 nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료를 첨가하지 않은 대조군과 비교하여 DPPH radical 소거활성을 백분율(%)로 나타내었다.
- 반응이 끝난 후 ELISA reader를 사용하여 560 nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료를 첨가하지 않은 대조군과 비교하여 superoxide anion radical 소거 활성을 백분율(%)로 나타내었다.
- 티로시나제는 tyrosine을 DOPA로의 전환에 관여할 뿐만 아니라 DOPA를 DOPAquinone으로 전환시킴으로서 적색의 melanin 색소를 생성하는 반응에 관여하는 주요 효소 중 하나로 알려져 있다[22]. 익모초 추출물 및 용매별 분획에 대한 티로시나제 활성 저해효과를 tyrosine을 기질로 이용하여 측정하였으며, 그 결과를 그림 6에 나타내었다. 용매분획별로 티로시나제 저해활성을 비교한 결과 MC 분획 > EtOH 추출물 > Hx 분획> EtOAc 분획, BuOH 분획, 물 분획 순으로 나타났으며, 특히 MC 분획의 경우 125 ppm에서 62.
- 엘라스타제는 피부조직의 탄력성을 유지하는데 필요한 가교결합 형성에 관여하는 엘라스틴을 가수분해하는 효소로 알려져 있다[23]. 익모초 추출물과 용배별 분획의엘라스타제 저해효과는 생성되는 p-nitroanilide의 양을 측정하여 평가하였다. 시료를 넣지 않은 군을 대조군으로 하여 시료를 1000 ppm, 500 ppm, 250 ppm으로 희석하여 엘라스타제 저해 효과를 측정한 결과 실험군 중 대부분이 불투명해져 흡광도를 측정하는데 어려움이 있었다.
- 익모초의 잎과 줄기를 말려 곱게 간 가루 50 g을 70%(v/v) 에탄올 수용액으로 3시간씩 3회 환류추출 후 냉침하여 와트만(Whatman) 여과지로 여과하고 여과된 추출물을 50℃ 이하에서 감압농축 및 동결건조하여 익모초 에탄올 추출물(32 g)을 제조하였다.
대상 데이터
- 사용한 기기로는 감압농축기(NVC-2100, Eyela, Japan), UV-VIS spectrophotometer (Gensys 10S, Thermo, USA), ELISA reader (Sunrise, Tecan, Switzerland), Incubator (SLI-700, Eyela, Japan), Shaker (Titramax 100, Heidolph, Germany) 등을 사용하였다.
- 사용한 시약은 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl, nitrotetrazolium blue chloride, xathine sodium salt, xanthine oxidase from bovine milk, elastase from porcine pancreas, tyrosinase, L-tyrosine, N-succinyl-(ala)3-p-nitroanilide, tannic acid, Folin-Ciocalteu’s reagent, quercetin, aluminum nitrate nonahydrate 등은 Sigma Aldrich (USA)사 제품을 사용하였으며 그 외 실험에 사용된 모든 시약은 일급 및 특급시약을 구입하여 사용하였다.
이론/모형
- 엘라스타제 저해활성은 James 등의 방법[17]을 이용 하여 측정하였다. 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8)와 농도별 시료 30 ㎕, 1 mM N-succinyl-(Ala)3-pnitroanilide 30 ㎕를 혼합한 후, 0.
- 익모초 추출물과 분획물의 항균효과는 일반적인 병원성 미생물 4종 Candida albican, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus를 대상으로 paper disc method [14]로 측정하였다. 각 균주 1 백금이를 취하여 10㎖의 broth에 접종하고 37 ℃에서 24～48시간 배양하여 활성화시킨 후 활성액과 broth를 섞어 농도가 약 10⁵～10⁶ CFU/㎖ 가량 되도록 균액을 만들었다.
- 익모초 추출물과 용매별 분획의 항균효과를 알아보기 위하여 병원성 미생물 4종(E. coli, S. aureus, P. aeruginosa, C. albican)에 대해 paper disc method를 사용하여 항균효과를 측정하여 그 결과를 표 3에 나타내었다.
- 익모초 추출물의 미백활성을 측정하기 위하여 티로시나제의 작용결과 생성되는 DOPAchrome을 비색법으로 측정하여 티로시나제 저해활성 여부를 측정하였다[16]. 0.
- 총 폴리페놀 함량은 Folin-Denis 방법[10]으로 측정하였으며, 적당하게 희석된 시료 1 ㎖에 95% ethanol 1㎖와 증류수 5 ㎖를 첨가하고 1 N Folin-Ciocalteu’s reagent 0.5 ㎖를 넣어 잘 섞어 주었다.
- 총 플라보노이드 함량은 Moreno 등[11]의 방법에 의해 측정하였다. 각 시료 100 ㎕를 취하여 10% 질산 알루미늄(aluminum nitrate)와 1 µM 초산 칼륨(potassium acetate)을 함유하는 80% 에탄올 4.
성능/효과
- 시료를 넣지 않은 군을 대조군으로 하여 시료를 1000 ppm, 500 ppm, 250 ppm으로 희석하여 엘라스타제 저해 효과를 측정한 결과 실험군 중 대부분이 불투명해져 흡광도를 측정하는데 어려움이 있었다. 6개의 분획 모두 엘라스타제 저해 효과가 높지 않은 것으로 나타났다.
- DPPH radical과 superoxide anion 소거 활성을 통해 항산화 효과를 측정한 결과 익모초 추출물 및 용매별 분획 모두 농도 의존적인 경향을 나타내었다. 특히, EtOAc 분획의 경우 250 ppm에서 DPPH radical과 superoxide radical을 80% 이상 소거하는 우수한 항산화 효과를 나타내었다.
- albican에는 Hx 분획만이 효과를 나타내었으며 (7～9 mm). S. aureus와 P. aeruginosa에는 모든 분획들이 항균효과가 없는 것으로 나타났다.
- 그 결과 물 분획과 부탄올 분획을 제외한 모든 시료들에서 15 ㎍/㎖이상의 플라보노이드가 함유된 것으로 나타났으며, 특히, MC 분획과 EtOAc 분획에서는 60 ㎍/㎖이상으로 플라보노이드 함량이 가장 높은 것으로 나타났다.
- 그 결과 물 분획을 제외한 모든 시료들에서 50 ㎍/㎖ 이상의 폴리페놀이 함유된 것으로 나타났으며, 특히, MC 분획과 EtOAc 분획에서는 200 ㎍/㎖ 이상으로 폴리페놀이 함량이 가장 높은 것으로 나타났다.
- 시료들의 DPPH radical 소거율은 EtOAc 분획 > EtOH 분획 > BuOH 분획 > Hx 분획, MC 분획, 물 분획 순으로 나타났다.
- 시료들의 superoxide anion radical 소거율은 EtOAc 분획 > BuOH 분획 > EtOH 분획 > 물 분획> Hx 분획, MC 분획 순으로 나타났다.
- 용매분획별로 티로시나제 저해활성을 비교한 결과 MC 분획 > EtOH 추출물 > Hx 분획> EtOAc 분획, BuOH 분획, 물 분획 순으로 나타났으며, 특히 MC 분획의 경우 125 ppm에서 62.8%, 62.5 ppm에서 41.4%의 높은 티로시나제 저해활성을 나타내었다.
- DPPH는 자유 라디칼의 안정된 모델로서 반응 중 DPPH radical의 감소는 자유 라디칼의 소거반응이 진행됨을 알 수 있고, 지질과산화의 초기반응의 억제정도를 예측할 수 있기 때문에 시료의 항산화 효과를 측정할때 DPPH radical 소거능 측정법이 많이 이용된다[20]. 익모초 추출물 및 용매별 분획의 DPPH radical 소거활성을 측정한 결과 투여 농도 의존적으로 DPPH radical 소거작용을 나타내었다[그림 4]. 특히 EtOAc 분획의 경우 250 ppm에서 82.
- 본 연구에서는 익모초를 70% 에탄올로 추출한 후 극성별 유기용매로 분획하여 유효성분 확인(총 폴리페놀 함량, 총 플라보노이드 함량), 항균 효과, 항산화 효과, 항노화 효과 등을 측정하여 다음과 같은 결론을 얻었다. 익모초 추출물 및 용매별 분획의 총 폴리페놀과 플라보노이드 함량을 측정한 결과 MC 분획과 EtOAc 분획에서 각각 200 ㎍/㎖ 이상, 60 ㎍/㎖ 이상으로 가장 높게 나타났다.
- 분자 내 페놀성 수산기가 효소 단백질과 같은 거대 분자들과 결합하는 성질이 있기 때문에 항산화 작용, 항암 및 콜레스테롤 저하작용 등의 다양한 생리활성을 가지는 것으로 알려져 있다[18]. 총 폴리페놀 함량을 측정하기 위하여 지표물질로서 tannic acid를 6.25～500 ppm 농도로 하여 검량선을 작성한 결과 그림 2와 같이 양호한 직선성(R2 =0.9992)을 나타내었다.
- 플라보노이드는 항균, 항암 및 항염증 활성 등이 보고 되어 있다[19]. 총 플라보이드 함량을 측정하기 위하여 지표물질로서 quercetin을 6.25～500 ppm 농도로 하여 검량선을 작성한 결과 그림 3과 같이 양호한 직선성(R2=0.9994)을 나타내었다.
- coli에 대해서는 익모초 추출물 및 용매별 분획들이 모두 항균 효과를 나타내었다. 특히, EtOH 분획과 BuOH 분획에서 가장 큰 항균 효과를 가지는 것으로 나타났다.
- 티로시나제 저해 효과를 측정한 결과 MC 분획 > EtOH 추출물 > Hx 분획 > EtOAc 분획, BuOH 분획, 물 분획 순으로 저해활성이 나타났으며, 특히, MC 분획의 경우 125 ppm에서 60% 정도의 높은 저해활성을 나타내었다.
- 표 3에 나타난 바와 같이 모든 시료들이 E. coli에는 항균효과를 나타내었으며, 특히 EtOH과 BuOH 분획에서 가장 높은 항균효과를 보였다(9～11 mm). C.
- 항균 효과 측정 결과 C. albican에서는 Hx 분획만이 항균 효과를 나타내었으나 E. coli에 대해서는 익모초 추출물 및 용매별 분획들이 모두 항균 효과를 나타내었다. 특히, EtOH 분획과 BuOH 분획에서 가장 큰 항균 효과를 가지는 것으로 나타났다.
후속연구
- 이상의 결과를 종합하여 볼 때 항균 효과는 BuOH 분획에서, 항산화 효과는 EtOAc 분획에서, 미백 효과는 MC 분획에서 가장 우수한 효과를 보이므로 향후 용매별 분획에 대한 분리 및 정제 등의 추가적인 연구를 통해 기능성 화장품 소재로 개발 가능성이 있을 것으로 사료된다.
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