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문제 정의
- 균주에 자외선을 조사를 통해 항산화효소 및 단백질의 변화를 살펴보았다[13]. 따라서 본 연구에서는 자외선을 조사하여 C. vulgaris 균주를 개량하였으며 선별된 균주의 특성을 파악하고자 하였다.
- 본 연구는 미세조류 C. vulgaris에 자외선을 조사하여 지질이 다량 축적된 변이주를 얻고자 하였다. 자외선 조사선량에 따른 C.
- 자외선 조사에 따른 C. vulgaris의 세포 생존율 및 변화 양상을 관찰하고자 하였다. 실험에 적합한 자외선 조사선량을 확인하기 위해 UV-B (254 nm)램프를 이용하여 1~5 min간 조사하였다.
제안 방법
- 자외선 조사 시간에 비례하여 세포 생존율 및 색소함량, 지질 함량이 감소함을 확인하였다. C. vulgaris에 자외선을 1 min간 조사하여 두 종의 변이주를 획득하였으며, 이를 UM10과 15로 명명하였다. 두 변이균주의 세포 생장은 야생균주에 비해 약 1.
- UM10과 15를 3일 간격으로 세포 생장을 측정하였다(Figure 4
- 세포 균체량 분석을 위해 680 nm에서 UV/Vis 분광기(Optizen 2120 UV, Mecasys Ltd, Korea)를 이용하여 흡광도를 측정하였다. 건조 균체량(Dry Cell Weight, DCW)은 항량된 종이필터(Whatman filter)를 이용해 여과된 균체를 105 ℃로 조절한 건조기에서 3 h 동안 건조 후 무게를 측정하였다[15].
- 두 번째 방법으로는 콜로니 획득을 위해 자외선 조사 시간별로 획득한 샘플을 고체 f/2 평판 배지에 도말하였다. 고체 배지에서 획득한 콜로니들을 액체 배지에 재배양하여 세포 생장 및 유용성분 분석을 진행하였다[7].
- 광합성을 통해 생장하는 미세조류 내 색소함량의 변화를 알아보기 위해 배양 21일 차에 세포 내 클로로필과 카로티노이드 함량을 분석하였다. 세포 내 색소함량 측정은 세포 1mL를 13000 rpm에서 3 min 간 원심분리한 뒤 상등액을 제거하고 methanol 1mL를 첨가하여 60℃에서 30 min간 반응하였다.
- Chlorococcumsp. 균주에 자외선을 조사를 통해 항산화효소 및 단백질의 변화를 살펴보았다[13]. 따라서 본 연구에서는 자외선을 조사하여 C.
- 본 연구에서는 UV-B 파장(254 nm)으로 UV 램프 스탠드(15 W)를 이용하여 균체에 직접적으로 조사하였다. 대수 증식기의 C. vulgaris 균주를 인산완충용액으로 세척 후 6-well에 5 mL씩 담아 뚜껑을 열고 1, 2, 3, 4, 5 min 간격으로 자외선에 노출시킨 후 채취하였다. 획득한 샘플은 두 가지 방법으로 배양하였다.
- 액상 배양은 12 h : 12 h (명 : 암)으로 형광등 조사하며 25 ℃에서 배양하였다. 두 번째 방법으로는 콜로니 획득을 위해 자외선 조사 시간별로 획득한 샘플을 고체 f/2 평판 배지에 도말하였다. 고체 배지에서 획득한 콜로니들을 액체 배지에 재배양하여 세포 생장 및 유용성분 분석을 진행하였다[7].
- 5 µg/mL 농도로 조절한 nile red 2 µL, DMSO 50 µL를 혼합하여 40 ℃에서 10 min간 반응하였다. 반응 후 형광광도계(Infinite F 200 pro, Tecan, Austria)를 이용하여 excitation 495 nm, emission 620 nm에서 형광값(fluorescence intensity)을 측정 후 nile red로 염색된 세포의 형광값과 미세조류 자체 형광값을 빼서 세포가 가진 지질 함량을 분석하였다. 측정한 지질 함량의 정량을 위해 Bertozzini 등[17]의 방법을 변형하여 검량선을 작성하였으며 이를 바탕으로 세포 내 지질함량의 정량을 진행하였다.
- UM10과 15의 클로로필 함량은 야생균주에 비해 최대 10% 감소하였으며 카로티노이드 함량은 최대 17% 감소하였다. 변이주의 지질 함유량은 세포를 nile red로 염색하여 형광강도를 측정하였으며, triolein을 이용하여 정량하였다. 그 결과 자외선 조사를 통해 선별한 변이주 UM10과 15의 지질 축적 량은 야생균주의 지질 축적량에 비해 약 1.
- 본 연구에서는 UV-B 파장(254 nm)으로 UV 램프 스탠드(15 W)를 이용하여 균체에 직접적으로 조사하였다. 대수 증식기의 C.
- 세포 균체량 분석을 위해 680 nm에서 UV/Vis 분광기(Optizen 2120 UV, Mecasys Ltd, Korea)를 이용하여 흡광도를 측정하였다. 건조 균체량(Dry Cell Weight, DCW)은 항량된 종이필터(Whatman filter)를 이용해 여과된 균체를 105 ℃로 조절한 건조기에서 3 h 동안 건조 후 무게를 측정하였다[15].
- vulgaris의 세포 생존율 및 변화 양상을 관찰하고자 하였다. 실험에 적합한 자외선 조사선량을 확인하기 위해 UV-B (254 nm)램프를 이용하여 1~5 min간 조사하였다. 그 결과 자외선 조사 시간이 길어질수록 세포 생존율이 감소함을 확인하였다 (Figure 1).
- vulgaris에 자외선을 조사하여 지질이 다량 축적된 변이주를 얻고자 하였다. 자외선 조사선량에 따른 C. vulgaris 변화를 확인하기 위해 1, 2, 3, 4, 5 min간 자외선을 조사하였다. 자외선 조사 시간에 비례하여 세포 생존율 및 색소함량, 지질 함량이 감소함을 확인하였다.
- 자외선 조사에 따른 C. vulgaris 변이주의 생장에 따른 색소함량 변화를 확인하기 위하여 배양 21일차에 클로로필과 카로티노이드 함량을 측정하였다(Figure 5). 두 변이주의 클로로필 함량은 UM10은 4.
- 획득한 샘플은 두 가지 방법으로 배양하였다. 첫 번째 방법으로는 균체 성장 확인을 위해 일부 샘플을 50 mL conical tube에 나눠 담고 10일간 액상배양하였다. 액상 배양은 12 h : 12 h (명 : 암)으로 형광등 조사하며 25 ℃에서 배양하였다.
- 반응 후 형광광도계(Infinite F 200 pro, Tecan, Austria)를 이용하여 excitation 495 nm, emission 620 nm에서 형광값(fluorescence intensity)을 측정 후 nile red로 염색된 세포의 형광값과 미세조류 자체 형광값을 빼서 세포가 가진 지질 함량을 분석하였다. 측정한 지질 함량의 정량을 위해 Bertozzini 등[17]의 방법을 변형하여 검량선을 작성하였으며 이를 바탕으로 세포 내 지질함량의 정량을 진행하였다.
대상 데이터
- 본 연구에서는 한국해양미세조류은행에서 분양받은 Chlorella vulgaris (KMMCC 191)를 사용하였다. F/2 배지를 사용하여 250 mL 삼각플라스크에서 working volume 100 mL로 25 ℃, 120 rpm, 광도 3000 lux의 조건에서 배양하였다.
데이터처리
- 세포 배양 21일째에 지질 함량을 측정하였으며, 동일한 과정을 3번 진행하여 평균값으로 그래프를 나타내었다. 변이주의 지질 함량을 측정한 결과 UM10은 36 µg/mL, UM15는 30.
이론/모형
- 자외선 조사 후 얻은 변이주의 지질 함량을 분석하기 위해 Chen 등[16]의 방법을 이용하여 측정하였다. 측정하려는 세포의 흡광도를 0.
성능/효과
- (a)에 나타내었으며 자외선을 5 min간 조사하였을 때에 2.7 mg/L로써 자외선을 조사하지 않은 대조군에 비해 약 65% 감소함을 확인하였고, 5 min간 자외선을 조사한 세포의 카로티노이드 함량은 대조군에 비해 약 65% 감소함을 확인할 수 있었다(Figure 2
- 그 결과 자외선 조사 시간이 길어질수록 세포 생존율이 감소함을 확인하였다 (Figure 1). 0 min 조사한 세포의 생존율을 100%로 보았을 때에, 5 min 조사한 세포의 생존율은 약 30%임을 확인하였다. 이는 자외선 조사 시간 증가에 따라 조사선량이 증가하며 이에 따라 세포의 생존율 또한 감소함을 알 수 있었다.
- Haematococcus pluvialis를 이용한 제한 배지 생장 실험에서 질소 결핍 배지에서 배양할 경우, 세포 내 astaxanthin의 함량이 증가함을 보고 하였다[23]. Chlorella 배양 과정에 fed-batch 실험을 진행하였으며, 그 결과 지속적인 영양공급이 이루어지면 균체의 농도가 증가했으나, 영양분이 결핍되면 세포 내 지질 축적량이 증가를 확인하였다[24]. 이와 같이, 미세조류의 성장 시 스트레스에 노출되면 스트레스에 대응하여 유용물질의 합성 대사과정을 변환하게 되며 이는 생장 속도 감소를 통한 세포 수확량 감소를 초래한다.
- UM10과 15를 3일 간격으로 세포 생장을 측정하였다(Figure 4(a)). UM10과 15의 세포 생장은 야생균주에 비해 약 1.4배 증가함을 보였다. 세포 건조 중량은 야생균주보다 증가함을 확인하였으며 UM15의 세포 건조 중량은 약 1.
- 5배 증가함을 확인하였다. UM10과 15의 클로로필 함량은 야생균주에 비해 최대 10% 감소하였으며 카로티노이드 함량은 최대 17% 감소하였다. 변이주의 지질 함유량은 세포를 nile red로 염색하여 형광강도를 측정하였으며, triolein을 이용하여 정량하였다.
- 실험에 적합한 자외선 조사선량을 확인하기 위해 UV-B (254 nm)램프를 이용하여 1~5 min간 조사하였다. 그 결과 자외선 조사 시간이 길어질수록 세포 생존율이 감소함을 확인하였다 (Figure 1). 0 min 조사한 세포의 생존율을 100%로 보았을 때에, 5 min 조사한 세포의 생존율은 약 30%임을 확인하였다.
- 변이주의 지질 함유량은 세포를 nile red로 염색하여 형광강도를 측정하였으며, triolein을 이용하여 정량하였다. 그 결과 자외선 조사를 통해 선별한 변이주 UM10과 15의 지질 축적 량은 야생균주의 지질 축적량에 비해 약 1.2, 1.5배 증가함을 확인하였다. 자외선 조사를 통해 얻은 변이주는 야생균주에 비해 세포 생장률 및 건조중량, 세포 내 지질 축적량은 증가한 반면 세포 내 색소함량은 감소하였다.
- Glaeson은 카리브해에 자생하는 산호초에 자외선 조사에 따른 생장 확인실험을 진행하였다[18]. 그 결과 자외선에 노출된 실험군의 세포 농도와 생장률이 대조군에 비해 증가함을 확인하였다.
- vulgaris에 자외선을 1 min간 조사하여 두 종의 변이주를 획득하였으며, 이를 UM10과 15로 명명하였다. 두 변이균주의 세포 생장은 야생균주에 비해 약 1.4배 증가하였으며 세포 건조 중량은 UM15가 약 1.5배 증가함을 확인하였다. UM10과 15의 클로로필 함량은 야생균주에 비해 최대 10% 감소하였으며 카로티노이드 함량은 최대 17% 감소하였다.
- vulgaris 변이주의 생장에 따른 색소함량 변화를 확인하기 위하여 배양 21일차에 클로로필과 카로티노이드 함량을 측정하였다(Figure 5). 두 변이주의 클로로필 함량은 UM10은 4.14 mg/L, UM15는 3.87 mg/L로 야생균주에 비해 각각 약 5, 11% 감소하였다. 카로티노이드 함량은 UM10이 1.
- 미세조류에 자외선을 조사하여 돌연변이주를span> 획득하였으며 이를 이용한 균주특성을 분석하였으며, 자외선 조사를 통해 얻은 변이주는 생장은 야생균주에span> 비해 좋았으나, 색소 축적량은 감소함을 확인하였다[8].
- 변이주의 지질 함량을 측정한 결과 UM10은 36 µg/mL, UM15는 30.1 µg/mL의 지질을 함유하여 야생균주에 비해 약 1.2, 1.5배 증가함을 확인하였다(Figure 6).
- 세포 건조 중량은 야생균주보다 증가함을 확인하였으며 UM15의 세포 건조 중량은 약 1.5배 증가하였다(Figure 4
- 에 미치는 영향을 알아보고자 하였으며, 그 결과 대조군에서는 0.21 pmol의 β-카로틴이 함유되어 있었지만, 자외선을 조사한 실험군에서는 0.08 pmol의 β-카로틴이 함유되어 있어 약 62%가 감소함을 확인하였다[20].
- 자외선 조사 시간에 따른 지질 함량 측정을 위해 3번 측정하였으며, 그 결과 5 min간 조사한 세포 내 지질 함량은 35 µg/mL로 자외선을 조사하지 않은 대조군이 41 µg/mL임을 감안할 때에 약 15% 감소함을 확인하여 자외선 조사 시간에 따른 세포 내 지질 함유량 변화는 크지 않음을 알 수 있었다 (Figure 3).
- vulgaris 변화를 확인하기 위해 1, 2, 3, 4, 5 min간 자외선을 조사하였다. 자외선 조사 시간에 비례하여 세포 생존율 및 색소함량, 지질 함량이 감소함을 확인하였다. C.
- 5배 증가함을 확인하였다. 자외선 조사를 통해 얻은 변이주는 야생균주에 비해 세포 생장률 및 건조중량, 세포 내 지질 축적량은 증가한 반면 세포 내 색소함량은 감소하였다. 자외선 조사라는 스트레스 요인이 세포 내 지질 축적량을 증가시키고, 광합성을 저해한 것이라고 판단된다.
- 87 mg/L로 야생균주에 비해 각각 약 5, 11% 감소하였다. 카로티노이드 함량은 UM10이 1.54 mg/L, UM15가 1.41 mg/L로 약 10, 17% 감소함을 확인하였다.
후속연구
- 자외선 조사라는 스트레스 요인이 세포 내 지질 축적량을 증가시키고, 광합성을 저해한 것이라고 판단된다. 미세조류 내지질 축적량 증가는 바이오디젤과 같은 바이오매스 생산 및 기능성 식품 산업에 적용될 수 있을 것이다.
- 이와 같이, 미세조류의 성장 시 스트레스에 노출되면 스트레스에 대응하여 유용물질의 합성 대사과정을 변환하게 되며 이는 생장 속도 감소를 통한 세포 수확량 감소를 초래한다. 하지만, 자외선 조사를 통해 얻은 UM15 변이주는 정상적 세포 생장 조건에서 야생균주에 비해 생장률이 높으며 세포 내 지질을 다량 함유하는 것으로 미루어 볼 때, 경제적으로 유용하게 사용할 수 있을 것이다.
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