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문제 정의
- 궤양성 대장염 치료의 목표는 증상과 점막의 염증을 호전 시켜 관해를 유도하고 가능하면 오랜 기간 동안 관해를 유지 하여 환자의 삶의 질을 높이는 것이다. 궤양성 대장염 환자의 약 15%가 위약만으로도 관해 상태에 도달한다고 하지만12) 대부분 환자들에서는 치료를 받지 않으면 혈변과 설사 등의 증상이 지속되므로 적절한 치료를 시행하는 것이 바람직하다13).
- 이에 근거하여 금은화가 만성 복통, 설사를 주된 증상으로 하는 염증성 장질환에 효과가 있을 것으로 생각되나 아직까지 금은화의 항산화효과와 COX-2 발현억제 효과 및 DSS로 유발된 궤양성 대장염 동물모델 대한 연구가 부족한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 금은화를 통한 궤양성 대장염 치료에 활용될 수 있는 근거를 마련하기 위해 금은화의 항산화 효과, COX-2 발현 억제 효과 및 DSS로 유발된 궤양성 대장염 생쥐에 대한 조절효과를 관찰한 결과 유의성이 있었기에 보고하는 바이다.
가설 설정
- A. The hemorrhagic erosion in mice treated with LE noticeably decreased than DSS only treated mouse (Wright, stain, x40). B.
제안 방법
- 0.05% 3,3'-diaminobenzidine (DAB; Sigma)과 0.01% HCl이 포함된 0.05M tris-HCl 완충용액 (pH 7.4)에서 발색시킨 후, hematoxylin으로 대조염색하였다.
- DSS 처리 후 sodium pentobarbital 용액으로 마취한 후 vascular rinse와 10% 중성 포르말린용액 (neutral buffered formalin : NBF)으로 심장관류고정을 실시하였다. 맹장에서 내림주름창자까지 적출하여 길이를 측정하고 내림결장만 따로 분리한 후 실온에서 24시간동안 10% NBF에 고정하였다.
- 그 여액을 rotary evaporator를 이용하여 감압․농축 후 동결 건조하여 금은화 물추출물 (LE, 수득률 31%)을 얻었다. LT군에 궤양성 대장염 유발 후 5일동안 45 ㎎/㎏/day 량으로구강투여 하였다. 한편 in vitro 실험에서의 LE의 첨가량 결정을 위해 MTT assay를 실시하였고, LE 10 ㎎/㎖까지는 세포생존률의 변화가 일어나지 않아 0.
- RT-PCR kit(Premega, USA)를 이용하여 cDNA를 합성한 후 COX-2 primer를 PCR machine으로 반응시켰다 (Table 1). PCR 산물은 1-2% agarose gel상에서 전기영동하여 relative intensity로 측정하였다. 한편 RT-PCR의 정확성을 평가하기 위하여 internal standard인 beta-actin의 증폭을 동시에 실시하였다.
- RAW 264.7 macrophages -5 × 105 cells/well을 6 well에 plating 하고 12시간 후에 lipopolysaccharide (1 ㎍/㎖, Sigma)를 2시간 처리하고 LE 0.4, 0.6, 0.8 그리고 1.0 ㎎/㎖을 농도별로 첨가하여 24시간동안 배양하였다.
- 배양 후 수거한 RNA를 trizol reagent (Sigma)를 사용하여 추출한 다음 fluorometer(introgen, USA)로 RNA를 정량하였다. RT-PCR kit(Premega, USA)를 이용하여 cDNA를 합성한 후 COX-2 primer를 PCR machine으로 반응시켰다 (Table 1). PCR 산물은 1-2% agarose gel상에서 전기영동하여 relative intensity로 측정하였다.
- 궤양성 대장염을 유발하기 위해 5일 동안 5% (wt/vol) Dextran sulfate sodium (DSS, with a molecular weight of 40,000, ICN, Aurora,OH)을 voluntary administration 시켰다.
- 이 작업을 7번 반복하여 평균값을 얻은 다음, 시료를 첨가하지 않은 3차 증류수에 대한 결과와 비교하여 억제율을 계산하였다. 그 결과를 Buthylated hydroxyanisole (BHA)와 비교하였다.
- 금은화 (Lonicera japonica)를 증류수 500 ㎖에 넣고 2시간동안 전탕한 후 여과하였다. 그 여액을 rotary evaporator를 이용하여 감압․농축 후 동결 건조하여 금은화 물추출물 (LE, 수득률 31%)을 얻었다.
- 금은화의 궤양성 대장염에 대한 치료 효과를 조사하기 위해 본 연구는 금은화 물추출물의 항산화 효과, 항염증 효과, DSS 처리를 통한 궤양성 대장염 유발 생쥐의 주름창자 길이 변화, 창자점막 손상, COX-2의 면역조직학적 변화를 관찰한 결과 다음과 같은 결과를 얻었다.
- 오리엔트 (Korea)에서 분양 받은 태령 4주된 Balb/C 수컷 생쥐를 무균사육장치내에서 2주일동안 적응시킨 후 체중 20 g된 생쥐를 선별하여 사용하였다. 대조군(CON군), DSS로 궤양성 대장염 유발군 (CE군), DSS와 금은화 물추출물 동시 처리군 (LT군)으로 나누었으며, 각 군에 각 10마리씩 배정하였다. 본 실험은 동국대학교 동물실험윤리위원회의 심의 (심의번호 2015-006)를 거쳤다.
- DSS 처리 후 sodium pentobarbital 용액으로 마취한 후 vascular rinse와 10% 중성 포르말린용액 (neutral buffered formalin : NBF)으로 심장관류고정을 실시하였다. 맹장에서 내림주름창자까지 적출하여 길이를 측정하고 내림결장만 따로 분리한 후 실온에서 24시간동안 10% NBF에 고정하였다. 고정된 조직은 통상적인 방법으로 paraffin에 포매한 후 5 ㎛ 두께의 연속절편으로 제작되었다.
- 본 연구에서는 실험적 UC 유발을 위해 5% DSS를 사용하였으며, 내림주름창자 길이의 변화를 통해 금은화의 대장 보호효과를 관찰하였다. 그 결과 CE군은 CON군에 비해 대장 길이가 33% 짧았으며, LT군은 CE 군에 비해 대장 길이가 20% 길었다.
- 염증 효소인 COX-2의 조직내 분포를 조사하기 위해 mouse anti-mouse COX-2 (1:250, Santa Cruz Biotec)를 이용한 면역조직화학적 염색을 실시하였다.
- 세포는 37 ℃, 5% CO2 incubator에서 10% Fetal Bovine Serum (Sigma, USA)가 함유된 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM, Sigma)를 사용하여 배양하였다. 오염방지를 위해 항생제로 100 unit/㎖ penicillin, 100 ㎍/㎖ streptomycin (Gibco/BRL, USA)을 첨가하였다.
- 항산화능력은 riboflavin을 이용한 활성산소 소거실험을 실시하였다. 우선 photocell에 40 mM buffer 2.6 ㎖, nitroblue tetrazolium 100 ㎕, EDTA/cyanide 200 ㎕, riboflavin 100 ㎕, LE 100 ㎕을 넣고 3번 섞어준 다음 Abs 560 nm에서 autozero를 잡고 light box에서 1분동안 조사한 후 흡광도를 측정하였다. 이 작업을 7번 반복하여 평균값을 얻은 다음, 시료를 첨가하지 않은 3차 증류수에 대한 결과와 비교하여 억제율을 계산하였다.
- 유전자 발현의 relative intensity와 면역조직화학의 결과의 수치화를 위해 Image pro Plus (Media Cybernetic, USA)를 이용한 영상분석 (image analysis)을 실시하였다. 영상분석 결과는 Sigmaplot 2000 (SPSS INC, USA)을 통해 student t test로 유의성을 검증하였다.
- 이와 관련하여 본 연구에서 금은화의 항산화 능력을 알아보기 위해 riboflavin을 이용한 활성산소 소거실험을 실시하여 BHA와 비교하였다. 그 결과 LE의 항산화 효율은 농도-의존적으로 증가하는 경향을 보였으며, 특히 BHA와의 항산화 효능 비교에서 금은화 3 ㎎/㎖이하 농도에서 BHA보다 항산화효능이 우수한 것으로 나타났다.
- 일반적인 형태변화를 관찰하기 위해 연속 절편을 Wright's 염색 후 광학현미경 (BX50. Olympus, Japan)으로 관찰하였다.
- 점막 손상 스트레스를 조사하기 위해 스트레스에 대한 완충적 물질인 열 충격 단백질 (heat shock protein, HSP)의 하나인 HSP70의 분포 변화를 항HSP70항체를이용한 면역조직화학적 염색을 실시하였다. 우선 절편을 proteinase K (20 ㎍/㎖)에 5분 동안 proteolysis 과정을 거친 후 blocking serum인 10% normal goat serum에서 2시간 동안 반응시켰다.
- PCR 산물은 1-2% agarose gel상에서 전기영동하여 relative intensity로 측정하였다. 한편 RT-PCR의 정확성을 평가하기 위하여 internal standard인 beta-actin의 증폭을 동시에 실시하였다.
- LT군에 궤양성 대장염 유발 후 5일동안 45 ㎎/㎏/day 량으로구강투여 하였다. 한편 in vitro 실험에서의 LE의 첨가량 결정을 위해 MTT assay를 실시하였고, LE 10 ㎎/㎖까지는 세포생존률의 변화가 일어나지 않아 0.4, 0.6, 0.8 그리고 1.0 ㎎/㎖를 첨가량으로 결정하였다.
- 항산화능력은 riboflavin을 이용한 활성산소 소거실험을 실시하였다. 우선 photocell에 40 mM buffer 2.
대상 데이터
- 실험에 사용한 마우스의 RAW 264.7 macrophages는 Korean Cell Line Bank (KCLB; Korea)에서 구입하였다. 세포는 37 ℃, 5% CO2 incubator에서 10% Fetal Bovine Serum (Sigma, USA)가 함유된 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM, Sigma)를 사용하여 배양하였다.
- 오리엔트 (Korea)에서 분양 받은 태령 4주된 Balb/C 수컷 생쥐를 무균사육장치내에서 2주일동안 적응시킨 후 체중 20 g된 생쥐를 선별하여 사용하였다. 대조군(CON군), DSS로 궤양성 대장염 유발군 (CE군), DSS와 금은화 물추출물 동시 처리군 (LT군)으로 나누었으며, 각 군에 각 10마리씩 배정하였다.
데이터처리
- 유전자 발현의 relative intensity와 면역조직화학의 결과의 수치화를 위해 Image pro Plus (Media Cybernetic, USA)를 이용한 영상분석 (image analysis)을 실시하였다. 영상분석 결과는 Sigmaplot 2000 (SPSS INC, USA)을 통해 student t test로 유의성을 검증하였다.
- 6 ㎖, nitroblue tetrazolium 100 ㎕, EDTA/cyanide 200 ㎕, riboflavin 100 ㎕, LE 100 ㎕을 넣고 3번 섞어준 다음 Abs 560 nm에서 autozero를 잡고 light box에서 1분동안 조사한 후 흡광도를 측정하였다. 이 작업을 7번 반복하여 평균값을 얻은 다음, 시료를 첨가하지 않은 3차 증류수에 대한 결과와 비교하여 억제율을 계산하였다. 그 결과를 Buthylated hydroxyanisole (BHA)와 비교하였다.
이론/모형
- 금은화가 cyclooxygenase (COX)-2의 mRNA 발현 양상에 미치는 영향을 조사하기 위해 역전사중합효소연쇄 반응법 (Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)을 실시하였다. RAW 264.
성능/효과
- 1. 금은화 물추출물의 항산화 효율은 농도 의존적으로 증가하였다.
- 2. RAW 264.7 macrophages에서 LPS 자극에 의한 COX-2 mRNA 발현은 금은화 물추출물 처리 후 농도-의존적으로 감소하였다.
- 3. 금은화 물추출물이 투여된 생쥐에서 주름창자의 길이는 DSS 처리군 보다 증가하였다.
- 4. 금은화 물추출물이 투여된 생쥐에서 창자 점막손상 스트레스 완충 물질인 HSP70의 양성반응세포의 분포가 감소하였다.
- 5. 금은화 물추출물이 투여된 생쥐에서 염증 효소인 COX-2의 양성반응세포의 분포가 감소하였다.
- 특히 조직 분포에서 COX-2 양성 반응세포는 점막상층부에 분포하였고, 핵막주변 세포질에서 강한 양성반응을 보였다. COX-2 양성반응 영상분석 결과에서도 CE군은 CON군에 비해 641% 증가하였고, LT군은 CE군에 비해 54% 감소하였다. 이러한 결과로 금은화가 항염증 효과를 가지고 있음을 확인할 수 있었다.
- COX-2 양성반응의 영상분석 결과 CE군 (3482 ± 106/100000 pixel) 은 대조군 (470 ± 32/100000 pixel)에 비해 641% 증가하였고, LT군 (1601 ± 77/100000 pixel) 은 CE군에 비해 54% 감소하였다 (Fig. 6).
- DSS 처리로 궤양성 대장염을 유발 후 스트레스에 대한 완충적 물질인 HSP70의 양성반응세포의 분포는 점막고유층에 증가하였으며, 양성반응세포의 핵과 주변세포질에서 강하게 양성반응을 보였다. 이러한 양성반응세포의 분포 증가는 CON군 (601 ± 42/100000pixel) CE군에서 283% (2803 ± 124/100000 pixel) 증가하였다.
- 7 macrophages에서 LPS 자극에 의한 COX-2 mRNA 발현은 증가하였는데, LE 처리 후 농도의존적으로 발현이 감소되었다. LE 처리 후 LPS 자극 시 발현되는 COX-2 mRNA 발현량에 비해 0.4 ㎎/㎖에서 8.9%, 0.6 ㎎/㎖에서 25.7%, 0.8 ㎎/㎖에서 33.3%, 1.0 ㎎/㎖에서 40.2%가 감소하였다 (Fig. 2).
- 본 연구에서는 실험적 UC 유발을 위해 5% DSS를 사용하였으며, 내림주름창자 길이의 변화를 통해 금은화의 대장 보호효과를 관찰하였다. 그 결과 CE군은 CON군에 비해 대장 길이가 33% 짧았으며, LT군은 CE 군에 비해 대장 길이가 20% 길었다. 이를 통해 CE군에서 대장염이 잘 유발되었고, LT군의 내림주름창자 길이 증가로 금은화의 대장 보호효과를 확인하였다.
- 이와 관련하여 본 연구에서 금은화의 항산화 능력을 알아보기 위해 riboflavin을 이용한 활성산소 소거실험을 실시하여 BHA와 비교하였다. 그 결과 LE의 항산화 효율은 농도-의존적으로 증가하는 경향을 보였으며, 특히 BHA와의 항산화 효능 비교에서 금은화 3 ㎎/㎖이하 농도에서 BHA보다 항산화효능이 우수한 것으로 나타났다. 이러한 금은화의 항산화효능은 장내 산화스트레스에 의한 조직손상 예방에 효과가 있을 것으로 생각된다.
- 대조군의 내림주름창자의 길이는 36.5 ± 0.6 ㎜ 였지만, DSS 처리로 궤양성 대장염이 유도된 CE군에서는 대조군에 비해 33% 감소한 24.5 ± 1.3 ㎜로 측정되었다.
- 또한 금은화의 COX-2 발현 억제 효과를 알아보기 위해 RAW 264.7 macrophages에서 LPS 자극에 의한 COX-2 mRNA 발현 양상의 변화를 측정한 결과 CON군에 비해 LE 처리 후 농도-의존적으로 발현이 감소되었다. 이를 통해 금은화가 COX-2 발현 억제를 통한 항염증 효과가 있음을 알 수 있다.
- 본 연구 결과 DSS 처리로 궤양성 대장염을 유발 후 스트레스에 대한 완충적 물질인 HSP70의 양성반응세포의 분포는 점막 고유층에 증가하였으며, 양성반응세포의 핵과 주변세포질에서 강하게 양성반응을 보였다. 이러한 양성반응세포의 분포 증가는 CON군에 비해 CE군에서 283% 증가하였고, 이에 반해 LT군에서는 CE 군에 비해 57% 감소한 사실을 확인하였다.
- 본 연구에서도 창자 점막의 일반적인 형태 변화를 확인한 결과 CE군의 점막 표면상피의 많은 부분에서 출혈성 침식 (hemorrhagic erosion)과 염증관여세포의 침윤(infiltration)이 점막 고유층에서 관찰되었다. 하지만 LT 군에서는 CE군에 비해서 출혈성 침식이 완화된 것으로 나타났으며, 점막 고유층에서도 염증관여세포의 침식감소가 확인되었다.
- COX-2 양성반응 영상분석 결과에서도 CE군은 CON군에 비해 641% 증가하였고, LT군은 CE군에 비해 54% 감소하였다. 이러한 결과로 금은화가 항염증 효과를 가지고 있음을 확인할 수 있었다.
- 본 연구 결과 DSS 처리로 궤양성 대장염을 유발 후 스트레스에 대한 완충적 물질인 HSP70의 양성반응세포의 분포는 점막 고유층에 증가하였으며, 양성반응세포의 핵과 주변세포질에서 강하게 양성반응을 보였다. 이러한 양성반응세포의 분포 증가는 CON군에 비해 CE군에서 283% 증가하였고, 이에 반해 LT군에서는 CE 군에 비해 57% 감소한 사실을 확인하였다. 이는 금은화가 궤양성 대장염으로 인한 점막 손상 스트레스를 상당 부분 완화한다는 의미로 보여진다.
- 그 결과 CE군은 CON군에 비해 대장 길이가 33% 짧았으며, LT군은 CE 군에 비해 대장 길이가 20% 길었다. 이를 통해 CE군에서 대장염이 잘 유발되었고, LT군의 내림주름창자 길이 증가로 금은화의 대장 보호효과를 확인하였다.
- 7 macrophages에서 LPS 자극에 의한 COX-2 mRNA 발현 양상의 변화를 측정한 결과 CON군에 비해 LE 처리 후 농도-의존적으로 발현이 감소되었다. 이를 통해 금은화가 COX-2 발현 억제를 통한 항염증 효과가 있음을 알 수 있다.
- 이와 관련하여 본 연구에서 염증 효소인 COX-2의 양성반응세포의 분포를 살펴보았는데 CE군에서는 COX-2의 양성반응세포의 분포가 증가하는 반면 LT군에서는 감소하였다. 특히 조직 분포에서 COX-2 양성 반응세포는 점막상층부에 분포하였고, 핵막주변 세포질에서 강한 양성반응을 보였다.
- 4-B). 일부 지역의 표면상피 상층부를 제외하고는 정상적인 창자 세포의 배열을 확인할 수 있었으며, 솔모양가장자리도 관찰되었다.
- 일부 창자에서는 창자 점막에서 일어난 출혈성 침식은 점막근층(muscularis mucosae)을 지나 점막밑층 (submucosa)까지 확대된 것을 확인할 수 있었다. 표면상피 상층부(apical surface)에 위치한 창자세포는 거의 손상된 형태로 나타났고, 솔모양가장자리는 관찰되지 않았다. 한편 LT군에서는 CE군에 비해서는 출혈성 침식이 완화된 것으로 나타났으며 (Fig.
- 본 연구에서도 창자 점막의 일반적인 형태 변화를 확인한 결과 CE군의 점막 표면상피의 많은 부분에서 출혈성 침식 (hemorrhagic erosion)과 염증관여세포의 침윤(infiltration)이 점막 고유층에서 관찰되었다. 하지만 LT 군에서는 CE군에 비해서 출혈성 침식이 완화된 것으로 나타났으며, 점막 고유층에서도 염증관여세포의 침식감소가 확인되었다. 이를 통해 금은화가 폐쇄띠 손상을 완화하여 장내 투과성을 감소시키고 출혈성 침식 및 염증관여세포의 침윤을 완화시키는 것으로 판단된다.
후속연구
- 본 연구는 RAW 264.7 macrophages와 DSS 동물모델을 사용하여 얻은 결과로써, 실제 인간의 궤양성 대장염에 적용하기에는 한계가 있다. 아울러 향후 금은화에 함유된 항염증 성분의 분리 동정 및 금은화의 항염증성과 관련된 기전에 관한 후속 연구가 필요할 것으로 생각된다.
- 7 macrophages와 DSS 동물모델을 사용하여 얻은 결과로써, 실제 인간의 궤양성 대장염에 적용하기에는 한계가 있다. 아울러 향후 금은화에 함유된 항염증 성분의 분리 동정 및 금은화의 항염증성과 관련된 기전에 관한 후속 연구가 필요할 것으로 생각된다.
- 이상의 결과로 볼 때, 금은화는 항산화 작용, 항염증 작용 및 창자점막 보호작용으로 인하여 궤양성 대장염 치료제의 가능성을 충분히 가지며, 본 연구를 바탕으로 궤양성 장질환에 충분히 응용할 수 있을 것으로 판단된다.
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