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문제 정의
- 금은화의 약리작용에 관한 선행연구로는 금은화의 성분 중 tannin이 급 성장염 및 해독효과를 나타내는 유효성분으로 밝혀져 있고(13), 금은화로 조제한 약침액이 항암효과가 있는 것으로 보고 되고 있다(14). 또한 한방에서는 각종 화농성 질환이나 악창 등에 유 효하다고 알려져 있는데(15), 본 연구에서는 이와 같은 금은화 를 각종 유기용매 및 물로 추출하여 식중독 유발세균에 대한 항균력을 검색해 보고자 하였다.
가설 설정
- 1)Diameter 2)No inhibitory zone was formed.
- 2)No inhibitory zone was formed.
제안 방법
- 이 배지 위에 멸균된 paper disc를 시료 수에 맞게 올리고 밀착시킨 후 금은화의 petroleum ether, chloroform, ethyl acetate, methanol, 열수추출물을 각각 100, 250, 500, l, 000ppm으로 희석하여 20μL씩 천천히 흡수시켰다. Control로 금은화 추출물이 들어 있지 않은 70% ethanol을 실 험군과 동일한 방법으로 점적 하였다. 준비된 모든 plate는 37℃ 에서 24시간 배양한 후 disc 주변에 생성된 clear zone(mm)의 크기를 측정하여 각 분획물의 항균 활성 정도를 측정하였다.
- 건조시킨 금은화 1kg에 대해 금은화 중량의 2배 분량인 petroleum ether, chloroform, ethyl acetate, methanol을 사용하여 항균성 물질을 추출하였다. 추출관에 금은화를 넣고 1L의 methanol을 넣은 후 실온에서 6시간 방치한 후, Whatman No.
- 금은화 추출물을 다른 항균성 식물 추출물과 혼합했을 시 항 균력의 상승 여부를 확인하고자 한방에서 한약재로 널리 사용되고 있는 인진쑥 추출물과의 혼합을 시도하였다. 본 실험의 예비 실험에서 항균력이 있음이 입증된 금은화의 ethyl acetate 추출물과 인진쑥의 ethyl acetate 추출물을 각각 500 ppm씩 섞 고, 금은화의 ethyl acetate 추출물 1,000 ppm 및 인진쑥의 ethyl acetate 추출물 1,000 ppm과 항균력을 비교하였다.
- 금은화의 ethyl acetate 추출물 1,000 ppm 농도를 첨가한 배양에서는 12시간까지 완만하게 성장하다가 24시간에 가 서 야 급격 하게 성 장하기 시 작하였고, 2,000 ppm, 3, 000 ppm에 서는 12시간 이후까지 성장지연 효과를 나타내었다. 금은화의 Shigella 加曲巳尸써에 대해 미치는 생육 저해 정도를 동일한 방법으로 72시간 동안 QD값 측정을 통해 살펴본 바, Fig. 4와 같은 결과를 얻었다. 금은화의 ethyl acetate 추출물을 넣지 않은 control의 경우 배양 후 12시간부터 급속한 균의 증식을 볼 수 있었고 1,000 ppm 농도로 금은화 ethyl acetate 추출물을 첨가한 실험군도 12시간부터 급속한 성장을 보이다가 그 이후로 는 완만한 성장을 나타내었다.
- Staphylococcus epidermidis의 경우, 금은화의 ethyl acetate 추출물을 넣지 않은 control배지에서 배양했을 시, 12시간 후부터 급격한 증가를 보여 빠른 성장이 일어남을 관찰할 수 있었다. 금은화의 ethyl acetate 추출물 1,000 ppm 농도를 첨가한 배양에서는 12시간까지 완만하게 성장하다가 24시간에 가 서 야 급격 하게 성 장하기 시 작하였고, 2,000 ppm, 3, 000 ppm에 서는 12시간 이후까지 성장지연 효과를 나타내었다. 금은화의 Shigella 加曲巳尸써에 대해 미치는 생육 저해 정도를 동일한 방법으로 72시간 동안 QD값 측정을 통해 살펴본 바, Fig.
- 금은화의 ethyl acetate 추출물을 membrane filter(0.2 |im, pore size, Toyoroshi kaisha, Ltd., Japan)로 제균시키고, 액체배지에 각 추출물을 1,000, 2,000, 및 3, 000 ppm 농도별로 첨가하였다. 여기에 O.
- 금은화의 ethyl acetate 추출물을 농도별로(0, 1,000, 2,000 및 3, 000 ppm) TSB 배지에 첨가하고, Gram 양성균인 Staphylococcus epidermidis와 Gram 음성균인 Shigella dysenteriaee 각각 접종 시켜 72시간 배양하면서 일정 시간 간격으로 균주의 성장 정도를 측정해 본 바, Fig. 3 및 Fig. 4와 같은 증식곡선을 얻을 수 있었다. Staphylococcus epidermidis의 경우, 금은화의 ethyl acetate 추출물을 넣지 않은 control배지에서 배양했을 시, 12시간 후부터 급격한 증가를 보여 빠른 성장이 일어남을 관찰할 수 있었다.
- Series, Japan)를 사용하여 35℃(2에서 감압 . 농축하였으며 농축한 추출물은 petroleum ether, chloroform, ethyl acetate 및 methanol을 각각 사용하여 용매 계통 분획하였다. 이때 methanol 추출물 과 각종 유기용매를 분별 깔대기에 넣고 5분간 수작업으로 흔 들어 혼합한 후, 15분간 실온에 방치시킨 후 분리하였다.
- 대상 균주는 Staphylococcus epidermidis. 및 Shigella dysenteriae를 사'용하고, 대조군으로 70% ethanol을 각 시료와 동일한 양인 20 μL씩 분 주하여 검증하였다.
- 금은화 추출물을 다른 항균성 식물 추출물과 혼합했을 시 항 균력의 상승 여부를 확인하고자 한방에서 한약재로 널리 사용되고 있는 인진쑥 추출물과의 혼합을 시도하였다. 본 실험의 예비 실험에서 항균력이 있음이 입증된 금은화의 ethyl acetate 추출물과 인진쑥의 ethyl acetate 추출물을 각각 500 ppm씩 섞 고, 금은화의 ethyl acetate 추출물 1,000 ppm 및 인진쑥의 ethyl acetate 추출물 1,000 ppm과 항균력을 비교하였다. 대상 균주는 Staphylococcus epidermidis.
- , Japan)로 제균시키고, 액체배지에 각 추출물을 1,000, 2,000, 및 3, 000 ppm 농도별로 첨가하였다. 여기에 O.D.값을 0.4로 맞춘 세균 배양액을 109배 희석하여 무 균적으로 접종하고 37℃에서 72시간 배양하면서 12시간마다 세 균 배양액의 증식정도를 660 nm에서 spectrophotometer로서 측 정하였다 (17).
- 4로 흡광도를 조절하고 pour-plate method에 따라 Tryptic Soy Agar(TSA)배지가 분주 된 배양접시에 균일하게 섞 은 후 실온에서 굳혔다. 이 배지 위에 멸균된 paper disc를 시료 수에 맞게 올리고 밀착시킨 후 금은화의 petroleum ether, chloroform, ethyl acetate, methanol, 열수추출물을 각각 100, 250, 500, l, 000ppm으로 희석하여 20μL씩 천천히 흡수시켰다. Control로 금은화 추출물이 들어 있지 않은 70% ethanol을 실 험군과 동일한 방법으로 점적 하였다.
- Control로 금은화 추출물이 들어 있지 않은 70% ethanol을 실 험군과 동일한 방법으로 점적 하였다. 준비된 모든 plate는 37℃ 에서 24시간 배양한 후 disc 주변에 생성된 clear zone(mm)의 크기를 측정하여 각 분획물의 항균 활성 정도를 측정하였다.
대상 데이터
- 금은화 추출물의 항균실험에 사용한 균주는 Gram(+)세균 2 종과 Gram(-)세균 7종으로 총 9종을 한국과학기술연구원 생명 공학연구소에서 분양 받아 사용하였다(Table 1). 균의 생육배지 로는 모든 균주에 대하여 Tryptic Soy Broth(Difco, TSB)를 사용하여 37℃, incubator에서 18-24시간 배양하였다.
- 본 실험의 예비 실험에서 항균력이 있음이 입증된 금은화의 ethyl acetate 추출물과 인진쑥의 ethyl acetate 추출물을 각각 500 ppm씩 섞 고, 금은화의 ethyl acetate 추출물 1,000 ppm 및 인진쑥의 ethyl acetate 추출물 1,000 ppm과 항균력을 비교하였다. 대상 균주는 Staphylococcus epidermidis. 및 Shigella dysenteriae를 사'용하고, 대조군으로 70% ethanol을 각 시료와 동일한 양인 20 μL씩 분 주하여 검증하였다.
- 본 실험에서 사용한 항균성 시험 대상 식물인 금은화와 인 진쑥은 한국산으로, 대구시 중구 남성로 약전 골목에서 2001년 5월, 건조 상태의 것을 구입하였다. 불순물을 제거하기 위해 가 볍게 2번 수세하여 건조시킨 후, 추출용 시료로 시-용하였다.
이론/모형
- Paper disc 방법으로 금은화의 각종 유기용매 분획물 및 열 수추출물을 각종 식품부패균 및 식중독균에 적용시켜 항균 활 성을 실험해 본 바, 다음과 같은 결과를 얻을 수 있었다. Gram 양성 균에 대한 금은화의 petroleum ether, chloroform, ethyl acetate, methanol 추출물 및 열수추출물의 항균활성은 Table 3과 같이 나타나 disc에 점적한 금은화의 각종 추출물의 농도가 증 가할수록 항균 활성이 크게 나타났다.
- 항균성 물질을 검색하기 위해 본 실험에서는 paper disc방법을 사용하였다(16). Typtic Soy Broth(TSB)배지에 배양한 세균 을 spectrophotometer(Nontron instruments, Italy) 560nm에서 O.
성능/효과
- Paper disc 방법으로 금은화의 각종 유기용매 분획물 및 열 수추출물을 각종 식품부패균 및 식중독균에 적용시켜 항균 활 성을 실험해 본 바, 다음과 같은 결과를 얻을 수 있었다. Gram 양성 균에 대한 금은화의 petroleum ether, chloroform, ethyl acetate, methanol 추출물 및 열수추출물의 항균활성은 Table 3과 같이 나타나 disc에 점적한 금은화의 각종 추출물의 농도가 증 가할수록 항균 활성이 크게 나타났다. 즉 농도가 증가할수록항균 활성을 나타내는 inhibition zone의 크기가 증가하여 ethyl acetate 주줄물의 경우 Staphylococcus epidermidis에 대해 1,000 ppm 농도에서 21 mm로 가장 큰 활성도를 나타내었다.
- 갓 에 탄올 주줄물 중의 ethyl acetate 분획물은 Staphylococcus aureus 에 대해서 가장 항균활성이 높음을 보고하였으나(18) 본 실험에 사용한 금은화의 ethyl acetate 주줄물은 Staphylococcus epi- dermidis에 대해 강한 항균효과를 지니고 있었다. 금은화 추출 물의 종류 및 농도에 따라 각 균주들에 대한 다른 활성을 나 타내 균의 종류에 따라 각기 다른 항균활성을 나타내, 금은화 의 chloroform 추출물과 methanol 추출물은 Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis 모두에 대해 주어진 농도가 높아질수록 항균력이 증가하였다. 한편 백작약의 methanol 추 줄물은 1,500 pig/mL의 농도에서 Bacillus subtilis, Staphylococ- cus aureus, Vibrio pwahaemolyticus의 증식을 100% 억제하였으며, Listeria monocytogenes와 Escherichia c이도 같은 농도에서각각 65.
- 금은화의 ethyl acetate 추출물을 넣지 않은 control의 경우 배양 후 12시간부터 급속한 균의 증식을 볼 수 있었고 1,000 ppm 농도로 금은화 ethyl acetate 추출물을 첨가한 실험군도 12시간부터 급속한 성장을 보이다가 그 이후로 는 완만한 성장을 나타내었다. 금은화의 ethyl acetate 추출물을 2,000, 3, 000ppm 농도로 첨가한 실험군의 경우 균의 증식이 완 만하게 이루어져 금은화의 ethyl acetate 추출물이 Staphylococcus epidermidis와 Shigella dysenteriaee:^\ 성장을 억제시킬 수 있는 것으로 판단되었다. 한편 몰약의 ethanol 주출물은 Staphylococcus aureus의 경우 25 ppm 첨가 시에도 균의 증식이 완전히 억제되 었다고 보고된 바 있으며(24), Kong 등(25)은 신갈나무잎의 물 주줄물은 Salmonella Typhimuriume Pseudomonas aeruginosae 대하여 250jig/mL의 농도에서 생육을 저해하고, Staphylococcus 의 경우 물과 methanol 주줄물 모누 125 μg/mL으] 농도에서 생육을 저해한다고 보고된 바 있다.
- 4와 같은 결과를 얻었다. 금은화의 ethyl acetate 추출물을 넣지 않은 control의 경우 배양 후 12시간부터 급속한 균의 증식을 볼 수 있었고 1,000 ppm 농도로 금은화 ethyl acetate 추출물을 첨가한 실험군도 12시간부터 급속한 성장을 보이다가 그 이후로 는 완만한 성장을 나타내었다. 금은화의 ethyl acetate 추출물을 2,000, 3, 000ppm 농도로 첨가한 실험군의 경우 균의 증식이 완 만하게 이루어져 금은화의 ethyl acetate 추출물이 Staphylococcus epidermidis와 Shigella dysenteriaee:^\ 성장을 억제시킬 수 있는 것으로 판단되었다.
- 금은화의 주출물을 petroleum ether, chloroform, ethyl acetate 및 methanol로 각각 분리한 결과, 각 분획물의 추출 수율은 Table 2와 같이 나타났다. 금은화의 petroleum ether, chloroform, ethyl acetate, methanol 분획물 및 열수추출물은 각각 1.9, 0.2, 0.38, 23.38% 및 12.64%로 나타나, chloroform의 수율이 가장 낮았고 methanol 추출물의 수율이 가장 높았다.
- 금은화의 ethyl acetate 추출물과 인진쑥의 ethyl acetate 주줄 물을 섞었을 경우 나타나는 항균효과는 Table 5와 같이 나타났다. 본 실험에서 가장 민감한 항균효과를 보였던 Staphylococcus epidermidis에 대한 두 식물 추출물의 항균력은, 금은화 추출물 과 인진쑥 추출물을 혼합했을 경우 더 크게 나타나, 금은화의 ethyl acetate 추출물만을 단독으로 1,000 ppm 준 경우(21 mm)보다 인진쑥의 ethyl acetate 추출물 500 ppm에 금은화의 ethyl acetate 추출물 500ppm을 섞어 준 경우가 더 큰 항균력을 보 였다(23 mm). 한편 인진쑥의 ethyl acetate 추출물은 Gram 양성 균의 성장을 억제한다고 보고된 봐 있는데(23), 본 연구에서도 금은화 추출물과 섞어 사용 하였을 시 항균력이 상승함을 관 찰할 수 있었다.
- 4% 존재하는 allicine Gram 양성균 과 Gram 음성균 모두에 대하여 포자의 발아와 균의 생장을 억 제하는 항균성을 지닌다고 보고된 바 있다(22). 본 실험에서 사용한 금은화의 각종 유기 용매 및 수용성 분획물 중 ethyl acetate 주줄물이 각종 균주, 즉 Staphylococcus aureus, Staphy- lococcus epidermidis, Escherichia coli, Pseudomonas aemgi- nosa, Salmonella Typhimurium, Salmonella paratyphimurium, Shigella sonnei, Shigella dysenteriae 및 Shigella flexneri에 대해 큰 항균력을 보였으며 특히 Shigella dysenteriae6^ 대해 가장 큰 항균력을 나타내었다.
- Gram 양성 균에 대한 금은화의 petroleum ether, chloroform, ethyl acetate, methanol 추출물 및 열수추출물의 항균활성은 Table 3과 같이 나타나 disc에 점적한 금은화의 각종 추출물의 농도가 증 가할수록 항균 활성이 크게 나타났다. 즉 농도가 증가할수록항균 활성을 나타내는 inhibition zone의 크기가 증가하여 ethyl acetate 주줄물의 경우 Staphylococcus epidermidis에 대해 1,000 ppm 농도에서 21 mm로 가장 큰 활성도를 나타내었다. 갓 에 탄올 주줄물 중의 ethyl acetate 분획물은 Staphylococcus aureus 에 대해서 가장 항균활성이 높음을 보고하였으나(18) 본 실험에 사용한 금은화의 ethyl acetate 주줄물은 Staphylococcus epi- dermidis에 대해 강한 항균효과를 지니고 있었다.
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