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문제 정의
- 울릉도는 해안 주변이 깊은 바다이어서 연안의 해수는 대부분 청정하지만, 방파제 구조물이 있는 항구 안에는 생활하수나 하천수의 유입으로 인하여 해수가 오염되고 있다. 본 연구는 울릉도에서 해수의 오염으로 인한 해양미생물의 생태계 변화를 파악하기 위하여 항구의 표층수에서 서식하는 해양미생물의 분포를 조사하였다.
제안 방법
- Marine broth에서 배양한 미생물들은 각각 원심분리(4,000 rpm, 30분)로 회수한 다음, 같은 방법으로 DNA Stool Minikit (QIAamp, Qiagen)을 이용하여 염색체 DNA를 추출하였다(C1–C8).
- 저동항(JD)은 울릉도에서 규모가 가장 큰 어항이어서 항구내에 많은 어선들이 정박하고 있었으며, 주변 마을에서 나오는 생활하수와 하천수가 항구로 유입되고 있었는데 수평선 방향으로 방파제 시설이 있는 닫힌 구조를 하고 있어서 항구의 해수가 매우 혼탁하였다. 따라서 저동항의 해수는 생활하수로 오염된 해수의 기준이 되는 양성 대조군으로 활용하였다.
- 울릉도 서쪽에 있는 태하항(TH)은 ‘C’ 자형의 열린 구조로 수평선 방향에 방파제 구조물이 아무것도 없어서 동해바다에 완전히 노출되었다. 따라서 태하항의 해수는 먼 동해바다의 해수와 같이 맑고 투명하여서 청정한 해수의 기준이 되는 음성 대조군으로 활용하였다. 구암(GA) 해변은 전방에 방파제 구조물은 있으나 항구는 아니며, 섬에서 흘러나오는 하천수가 바다의 해수와 만나는 지점이다.
- 또한 해수시료에 있는 해양미생물 중 실험실에서 배양이 가능한 균주를 파악하기 위하여 해수 100 μl를 멸균한 Marine broth (Difco) 7 ml에 접종하고 27°C에서 24시간 배양하였다.
- 울릉도에서 7곳의 항구(천부항, 현포항, 태하항, 남양항, 사동항, 도동항, 저동항)와 1곳의 해변(구암)에서 표층해수를 채취하였다. 배양하지 않은 시료(uncultured samples)와 배양한 시료(cultured samples)에서 각각 미생물의 16S rDNA를 pyrosequencing하여 해양미생물의 분포를 조사하였다. 태하항과 사동항의 해수처럼 청정한 해수에서는 Alphaproteobacteria 분포율이 높았고, 남양항, 도동항, 저동항의 해수처럼 생활하수나 하천수의 유입이 많은 곳에서는 Gammaproteobacteria 분포율이 증가하였다.
- 측정한 종의 수(Operational Taxonomic Unit, OTU), 다양도지수(Shannon index), 우점도지수(Simpson index)는 각 염기서열의 97% 이상의 유사성(sequence similarity)을 기반으로 조사하였다. 병원성 Vibrio균의 확인은 PCR Detection kit (iNtRON)로 조사하였다.
- 시료로 채취한 해양표층수(4 L)는 Whatman paper 여과지로 고체 불순물을 제거한 다음, Ultrafiltration membrane (Cutoff=10,000 Da, Millipore)으로 해양미생물을 여과하고, 여과지에 모인 미생물 균체를 DNA Stool Minikit (QIAamp, Qiagen)을 사용하여 염색체 DNA를 추출하였다(F1–F8).
- 추출한 미생물의 genomic DNA는 16S rRNA 유전자 V1-V3 영역의 27F (5'-ATCGTACGACGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3')와 518R (5'-ATCGTACGACWTTACCGCGGCTGCTGG-3') universal primers (Suh et al., 2015)을 사용하여 Polymerase Chain Reaction (PCR)으로 16S rRNA 유전자를 증폭한 다음 454 pyrosequencing으로 염기서열을 분석하였다(Khang, 2014).
- PCR 산물의 pyrosequencing과 염기서열 분석(taxonomic assignments, operational taxonomic unit, Shannon index, Simpson index)은 Macrogen(주)에서 제공하였다. 측정한 종의 수(Operational Taxonomic Unit, OTU), 다양도지수(Shannon index), 우점도지수(Simpson index)는 각 염기서열의 97% 이상의 유사성(sequence similarity)을 기반으로 조사하였다. 병원성 Vibrio균의 확인은 PCR Detection kit (iNtRON)로 조사하였다.
대상 데이터
- 울릉도에서 7곳의 항구(천부항, 현포항, 태하항, 남양항, 사동항, 도동항, 저동항)와 1곳의 해변(구암)에서 표층해수를 채취하였다. 배양하지 않은 시료(uncultured samples)와 배양한 시료(cultured samples)에서 각각 미생물의 16S rDNA를 pyrosequencing하여 해양미생물의 분포를 조사하였다.
- 울릉도의 해수시료는 여름철(2012년 7월 10일)에 해수의 오염도가 높을 곳으로 예상되는 페리항(도동항), 지방어항(천부항, 태하항), 국가어항(현포항, 남양항, 사동항, 저동항) 및 구암 방파제 해안의 표층해수를 각각 6.0 L씩 무균채수병(2 L*3, 메디랜드)에 담아서 실험실로 운반하여 냉장고(2°C)에 저장하였다(Fig. 1).
이론/모형
- , 2015)을 사용하여 Polymerase Chain Reaction (PCR)으로 16S rRNA 유전자를 증폭한 다음 454 pyrosequencing으로 염기서열을 분석하였다(Khang, 2014). PCR 산물의 pyrosequencing과 염기서열 분석(taxonomic assignments, operational taxonomic unit, Shannon index, Simpson index)은 Macrogen(주)에서 제공하였다. 측정한 종의 수(Operational Taxonomic Unit, OTU), 다양도지수(Shannon index), 우점도지수(Simpson index)는 각 염기서열의 97% 이상의 유사성(sequence similarity)을 기반으로 조사하였다.
성능/효과
- 07%에 불과하였지만(자료 미제시), cultured samples에서는 Vibrio 균이 95% 이상 분포하였다. Marine broth로 배양한 Vibrio 균의 유전자를 PCR로 분석한 결과 독소를 분비하는 병원성 Vibrio (V. harveyi, V. alginolyticus, V. parahaemolyticus, V. anguillarum) 세균들을 포함하고 있음이 확인되었다(자료 미제시). 이 결과는 식중독을 유발하는 Vibrio균의 존재 유무를 조사할 때에는 해수를 Marine broth에 배양하여 cultured bacteria의 분포를 조사하는 것이 uncultured bacteria의 분포를 조사하는 것보다 훨씬 더 효과적임을 시사한다.
- Proteobacteria 중에서는 Alphaproteobacteria와 Gammaproteobacteria가 우점하고 있었으며, 지역에 따라서 Betaproteobacteria와 Epsilonproteobacteria가 낮은 비율로 분포하고 있었다(Fig. 4). Alphaproteobacteria는 유기물을 잘 분해할 수 없으나(Joint et al.
- Ultramembrane filter로 여과한 해수시료(F1–F8)에서 추출한 DNA로 분석한 세균의 16S rRNA 유전자 염기서열(평균 300 bp)은 4,822±2,433 reads (95% 신뢰구간)를 얻었고, 해수를 marine broth로 배양한 시료(C1–C8)에서 추출한 DNA로 분석한 세균의 16S rRNA 유전자 염기서열(평균 380 bp)은 8,966±8,166 reads (95% 신뢰구간)를 얻었다.
- 본 연구의 결과를 정리하면, 울릉도 항구의 해수에 생활하수나 하천수 등의 유입량이 많을수록uncultured samples에서는 Bacteroidetes 분포가 높아지고, cultured samples에서는 Firmicutes 분포가 높아졌다. 또한 연안의 해수가 먼 바다의 해수와 같이 청정할수록Alphaproteobacteria 분포 비율이 높았고, 해수에 하천수나 생활하수가 많이 혼합될수록 Gammaproteobacteria 분포 비율이 증가하였다. 울릉도 항구에서 생활하수나 하천수로 인하여 미생물의 다양성이 상대적으로 높게 나타난 곳은 천부항, 도동항, 저동항이었으며, 현포항과 도동항의 해수에서는 식중독을 유발할 수 있는 Vibrio 균이 검출되었다.
- , 2014). 미생물의 이런 특성으로 인해서 Alphaproteobacteria는 해수가 청정한 것으로 나타난 태하항(82.0%)과 사동항(97.5%)에서 높게 나타났고, Gammaproteobacteria는 하천수나 생활하수가 해수와 합쳐지는 구암해변(56.4%), 남양항(45.7%), 도동항(28.2%), 저동항(58.3%)에서 비교적 높게 나타났다(Fig. 4). 작은 분자의 방향족 화합물을 분해할 수 있는 Betaproteobacteria (Liu and Liu, 2013)는 천부항(3.
- 배양이 가능한 해양미생물의 분포를 파악하기 위하여 해수시료를 marine broth로 배양한 결과, Alphaproteobacteria는 거의 사라지고 유기물을 이용할 능력이 있는 Gammaproteobacteria가 주로 배양되었다. 태하항에서는 Geothermobacter 속을 포함하는 Deltaproteobacteria (4.
- 4). 배양한 시료(cultured samples)에서 나타난Gammaproteobacteria는 천부항, 태하항, 구암해변, 남양항, 사동항에서는 Alteromonas 속이 우점으로 분포하고 있었으나, 저동항에서는 Shewanella 속이 우점으로 분포하고 있었다(Table 1). 현포항과 도동항에서는 uncultured samples에서는 Vibrio 균의 분포가 각각 0.
- Marine broth로 배양한 시료(cultured samples)에서는 Alteromonas (천부항, 태하항, 구암해변, 남양항, 사동항), Shewanella (저동항), Vibrio (현포항, 도동항) 속이 우점으로 분포하였다. 본 연구결과는 항구로 유입되는 하천수나 생활하수가 해양미생물의 분포에 큰 변화를 초래한다는 것을 시사한다.
- 본 연구의 결과를 정리하면, 울릉도 항구의 해수에 생활하수나 하천수 등의 유입량이 많을수록uncultured samples에서는 Bacteroidetes 분포가 높아지고, cultured samples에서는 Firmicutes 분포가 높아졌다. 또한 연안의 해수가 먼 바다의 해수와 같이 청정할수록Alphaproteobacteria 분포 비율이 높았고, 해수에 하천수나 생활하수가 많이 혼합될수록 Gammaproteobacteria 분포 비율이 증가하였다.
- 또한 연안의 해수가 먼 바다의 해수와 같이 청정할수록Alphaproteobacteria 분포 비율이 높았고, 해수에 하천수나 생활하수가 많이 혼합될수록 Gammaproteobacteria 분포 비율이 증가하였다. 울릉도 항구에서 생활하수나 하천수로 인하여 미생물의 다양성이 상대적으로 높게 나타난 곳은 천부항, 도동항, 저동항이었으며, 현포항과 도동항의 해수에서는 식중독을 유발할 수 있는 Vibrio 균이 검출되었다. 육지 연안에 있는 해양미생물의 분포는 계절에 따라서 변할 수 있기 때문에(Suh et al.
- 울릉도에서 해수의 오염이 발생할 가능성이 높은 7곳의 항구와 구암해변에서 채취한 해수를 조사한 결과, 해양미생물의 Operational Taxonomy Unit (OTU)이 60 이상으로 높게 나타난 곳은 천부항, 도동항, 저동항이었다(Fig. 2). 천부항, 도동항, 저동항에서는 다양도지수(Shannon index)도 2.
- anguillarum) 세균들을 포함하고 있음이 확인되었다(자료 미제시). 이 결과는 식중독을 유발하는 Vibrio균의 존재 유무를 조사할 때에는 해수를 Marine broth에 배양하여 cultured bacteria의 분포를 조사하는 것이 uncultured bacteria의 분포를 조사하는 것보다 훨씬 더 효과적임을 시사한다.
- 배양하지 않은 시료(uncultured samples)와 배양한 시료(cultured samples)에서 각각 미생물의 16S rDNA를 pyrosequencing하여 해양미생물의 분포를 조사하였다. 태하항과 사동항의 해수처럼 청정한 해수에서는 Alphaproteobacteria 분포율이 높았고, 남양항, 도동항, 저동항의 해수처럼 생활하수나 하천수의 유입이 많은 곳에서는 Gammaproteobacteria 분포율이 증가하였다. Marine broth로 배양한 시료(cultured samples)에서는 Alteromonas (천부항, 태하항, 구암해변, 남양항, 사동항), Shewanella (저동항), Vibrio (현포항, 도동항) 속이 우점으로 분포하였다.
- 배양이 가능한 해양미생물의 분포를 파악하기 위하여 해수시료를 marine broth로 배양한 결과, Alphaproteobacteria는 거의 사라지고 유기물을 이용할 능력이 있는 Gammaproteobacteria가 주로 배양되었다. 태하항에서는 Geothermobacter 속을 포함하는 Deltaproteobacteria (4.7%)가 검출되었고, 도동항에서는 Clostridia (0.8%), 저동항에서는 Bacilli (19.5%)가 검출되었다(Fig. 4). 배양한 시료(cultured samples)에서 나타난Gammaproteobacteria는 천부항, 태하항, 구암해변, 남양항, 사동항에서는 Alteromonas 속이 우점으로 분포하고 있었으나, 저동항에서는 Shewanella 속이 우점으로 분포하고 있었다(Table 1).
- 5 이상으로 높아서 해수가 청정해서 소수의 미생물이 우점하고 있다는 것을 시사하고 있다. 해수에서의 미생물 분포를 보면 Proteobacteria가 대부분이었으나 Bacteroidetes도 낮은 비율로 분포하고 있었다(Fig. 3). 생활하수에서는 Bacteroidetes와 Firmicutes가 많이 검출된다는 점을 고려하면(Wang et al.
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