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문제 정의
- 침향의 성분에 대해서는 chromone 유도체, sesquiterpenes 및 coumarinolignan 등이 알려져 있다(Bhandari 등 1982; Ishohara 등 1993; Okugawa 등 1993). 본 연구에서 상기 두 식물의 높은 항산화 능력을 통한 DNA 상해 감소 효과 및 면역안정 효과를 더욱 높이기 위해 두 식물의 추출물을 1:1 비율로 혼합한 뒤, 인간 각질형성 세포주인 HaCaT 세포에서 자외선A를 조사하고, 표고버섯과 침향의 추출물이 자외선A로 인해 증가한 8-OHdG나 CPDs와 같은 DNA 상해 반응에 어떠한 영향을 미치는지 확인하였다. 이후 DNCB를 이용하여 알러지성 접촉피부염을 유발한 mouse에 표고버섯과 침향의 추출물이 면역력에 어떤 영향을 미치는지 확인하여 산화적 스트레스로 인한 DNA 상해 반응에 효과와 면역 안정에 효과가 있으며, 두 추출물을 혼합하였을 때 더욱 강한 효과가 있다는 결과를 관찰하였다.
- 상기한 2종의 식물인 표고버섯(Lentinula edodes)과 침향(Aquilariae agallocha)의 에탄올 추출물을, 자외선을 조사한 HaCaT 세포에 처리하여 세포의 활성도와 DNA 상해 반응에 미치는 영향을 규명하기 위해 연구하였다.
- 앞서 이야기한 것처럼 표고버섯과 침향의 항산화 능을 통한 산화적 스트레스 감소 효과를 확인하기 위하여 산화적 스트레스로 인해 발생하는 DNA 상해반응인 CPD와 8-OHdG의 회복효과를 확인하고자 하였다.
제안 방법
- DNA 상해 수준 분석은 상기 방법에 따라 세포배양, 자외선 조사 및 추출물 처리한 세포들의 DNA를 추출한 뒤 slot blot(Hoefer Inc, USA)을 이용하여 polyvinylidene fluoride (PVDF) (Millipore, USA) 막에 부착시킨 후 CPD 또는 8-OHdG를 각각 1:3,000, 1:1,500으로 희석시킨 항체 용액과 반응시켜 암실에서 Hyper film(Fuji, Japan)에 현상한 후 얻은 이미지를 Image J 프로그램을 통해 자외선 조사 직후의 CPD와 8-OHdG의 양에 대한 상대값을 결정하였다.
- HaCaT 세포는 96 well multiplate(Nunc-Immuno Plate Maxisorp, Rochester, USA)에 각 well 당 1×105개의 세포를 분주하고, 24시간 동안 배양한 후 FBS가 첨가된 새 배지로 교환하고, 실험에 사용될 추출물들을 다양한 농도에서 24시간 처리하였다.
- HaCaT 세포를 PBS로 세척한 후 자외선A(5,000 J/m2)를 조사하고, 정상배지 또는 표고버섯과 침향 추출물을 각각 농도별(0, 5, 10, 25, 50, 100 μg/mL) 혹은 각 추출물을 1:1로 혼합시켜 상기 농도와 동일한 농도별로 함유된 배지를 처리하여 24시간 동안 배양하였다.
- 나아가 실험동물 모델에서 이 두 추출물의 또 다른 기능인 면역체계 안정화를 이용하여 면역체계 불안정으로 발생하는 피부염에 대한 긍정적인 효과를 확인하기 위해, DNCB를 주 5회씩 3주 동안 도포하여 알러지성 접촉피부염을 유발시키고, 각 추출물을 혼합하여 마우스 피부에 도포한 뒤 실험을 통해서 IgE, IL-6, 히스타민의 과발현이 억제되었음을 밝혀내었다. IgE, IL-6, 염증 단백질인 히스타민의 과발현은 면역반응의 교란을 초래하여 아토피, 접촉성 피부염과 같은 피부질환을 일으키므로, 표고버섯과 침향의 혼합을 통하여 이러한 단백질들의 과발현에 대한 억제 효능을 증진시키는 효과를 확인하였다. 본 연구는 표고버섯과 침향의 추출물을 이용하여 세포와 실험동물의 피부에 처리하였기 때문에 각 추출물의 어떠한 성분들이 상승효과로 본 연구와 같은 결과를 나타내었는지는 아직 정확히 알 수 없으나, 항산화 능력을 갖고 면역력을 증진시켜주는 표고버섯의 비타민 D나 글루칸과 같은 성분들(Mizuno & Nishitani 2013), 천식의 치료제로 이용되며, 항알러지 효과를 갖는 침향의 벤젠유도체 등이 이상의 긍정적인 효과를 나타낸 것으로 생각된다(Kim 등 1997).
- 고형사료와 물을 충분히 공급하면서, 2주일간 실험실 환경에 적응시킨 후 실험을 실시하였고 실험기간 중 동물 사육실 온도는 24±2℃ 였으며, 습도는 40～50%, 명암은 12시간 주기로 전환하였다. 각 실험군은 정상대조군, DNCB 단독처리군 , DNCB + 추출 혼합물 0.2%, DNCB + 1%, DNCB + 5%, DNCB + 10%, DNCB + 20% 이렇게 7개의 군으로 나누었으며, 각 군에 속하는 쥐는 5마리로 총 35마리의 쥐가 이용되었다. 알러지성 접촉피부염에 관련된 실험들은 원광대학교 동물실험윤리 위원회의 승인(승인 번호: WKU15-73) 하에 수행되었다.
- 고형사료와 물을 충분히 공급하면서, 2주일간 실험실 환경에 적응시킨 후 실험을 실시하였고 실험기간 중 동물 사육실 온도는 24±2℃ 였으며, 습도는 40～50%, 명암은 12시간 주기로 전환하였다.
- 본 연구에서는 항산화 기능성을 나타내는 것으로 알려진 천연물 소재들인 표고버섯(Kim 등 2012)과 침향 추출물(Yeon JH 2009)을 혼합하여, 자외선으로 인해 감소된 세포활성도와 자외선으로 증가한 DNA 상해 반응인 8-OHdG 및 CPD와 같은 노화 관련 유전체 안정화 훼손 물질의 수준을 측정하여 유전체 안정화 효과를 확인하였으며, 나아가 이 두 추출물의 또 다른 뛰어난 기능인 면역체계 안정화를 이용하여 면역체계 불안정으로 발생하는 피부염에 대한 긍정적인 효과 또한 확인하였다. 나아가 실험동물 모델에서 이 두 추출물의 또 다른 기능인 면역체계 안정화를 이용하여 면역체계 불안정으로 발생하는 피부염에 대한 긍정적인 효과를 확인하기 위해, DNCB를 주 5회씩 3주 동안 도포하여 알러지성 접촉피부염을 유발시키고, 각 추출물을 혼합하여 마우스 피부에 도포한 뒤 실험을 통해서 IgE, IL-6, 히스타민의 과발현이 억제되었음을 밝혀내었다. IgE, IL-6, 염증 단백질인 히스타민의 과발현은 면역반응의 교란을 초래하여 아토피, 접촉성 피부염과 같은 피부질환을 일으키므로, 표고버섯과 침향의 혼합을 통하여 이러한 단백질들의 과발현에 대한 억제 효능을 증진시키는 효과를 확인하였다.
- 동시에 200 μL씩 각각의 표고버섯과 침향 추출물을 용해시킨 증류수를 각 군에 따라 등에 주 5회의 간격으로 도포하였으며, 정상대조군에는 증류수만 도포하였다.
- 마우스 등의 털을 제모하고, 100 μL의 DNCB(5% olive oil)를 등에 주 5회씩 총 3주 동안 도포하여 알러지성 접촉피부염을 유발시켰다.
- 배양 후 phosphate buffered saline(PBS)으로 세척한 후 0.5 mg/mL의 MTT 용액 100 μL를 넣고, 4시간 동안 37℃에서 배양한 후, 570 nm에서 흡광도(ELISA reader, ReTiSoft Inc, Canada)를 측정하여 그 효과를 정상대조군에 대한 백분율로 산출하여 비교하였다.
- 배양세포에 자외선A(5,000 J/m2)를 조사한 후 24시간 동안 추출물들을 처리하여 자외선에 의해 유도된 DNA 상해 반응에 대한 추출물들의 효과를 분석하였다. 먼저 자외선을 각 세포군에 같은 양을 조사한 후, 표고버섯 추출물과 침향 추출물을 각각 0, 5, 10, 25, 50, 100 μg/mL씩 넣고 반응시킨 다음, DNA를 추출하여 slot blot을 이용하여 CPD와 8-OHdG의 수준을 측정한 결과, 표고버섯과 침향 추출물 각각 농도의존적으로 CPD와 8-OHdG의 수준을 감소시켰으며, 두 추출물을 상기 농도와 동일하게 1:1 혼합하였을 때 100 μg/mL에서 약 10~15% 더 감소시킨 결과를 나타내었다(Fig.
- 실험군의 약물 및 혼합물 처리가 끝난 후, 마우스에게 에테르를 흡입시켜 마취시키고, 정맥에서 혈액을 채혈한 다음 원심분리하여 혈청을 준비하였다. 혈청에 포함되어 있는 IgE, IL-6, 히스타민의 양은 ELISA kit(Abcam, UK)를 이용하여 제조사의 지침에 따라 수행되었다.
- 침향(Aquilariae agallocha) 추출물은 80 g을 70% ethanol로 추출하였는데, 시료 40 g씩 용매에 100 mL를 가하여 상온에서 24시간 동안 침지한 후 여과지로 여과하여 여과액을 얻었다. 얻어진 추출물을 진공증발기로 감압하고 농축하여 용매별 추출물을 얻었다. 8-OHdG, CPD 항체는 Santacruz(USA)에서 구입하였고, DNCB는 Sigma-Aldrich(USA)에서, IL-6, IgE 및 히스타민 ELISA kit는 Abcam(USA)에서 구입하였다.
- 실험군의 약물 및 혼합물 처리가 끝난 후, 마우스에게 에테르를 흡입시켜 마취시키고, 정맥에서 혈액을 채혈한 다음 원심분리하여 혈청을 준비하였다. 혈청에 포함되어 있는 IgE, IL-6, 히스타민의 양은 ELISA kit(Abcam, UK)를 이용하여 제조사의 지침에 따라 수행되었다. 각각의 샘플들은 ELISA reader(ReTiSoft Inc, Canada)로 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
대상 데이터
- 얻어진 추출물을 진공증발기로 감압하고 농축하여 용매별 추출물을 얻었다. 8-OHdG, CPD 항체는 Santacruz(USA)에서 구입하였고, DNCB는 Sigma-Aldrich(USA)에서, IL-6, IgE 및 히스타민 ELISA kit는 Abcam(USA)에서 구입하였다.
- 본 실험에서 사용한 표고버섯(Lentinula edodes) 추출물은 건조 시료에 20배의 95% ethanol로 상온에서 24시간 동안 2회 반복 추출하여 여과지로 여과한 후, 여과액을 회전 진공 증발기(EYELA, Japan)로 감압 농축하여 추출물을 얻었다. 침향(Aquilariae agallocha) 추출물은 80 g을 70% ethanol로 추출하였는데, 시료 40 g씩 용매에 100 mL를 가하여 상온에서 24시간 동안 침지한 후 여과지로 여과하여 여과액을 얻었다.
- 세포 활성도 실험은 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazolium bromide(MTT)(Sigma Aldrich, USA)를 이용하여 측정하였다. HaCaT 세포는 96 well multiplate(Nunc-Immuno Plate Maxisorp, Rochester, USA)에 각 well 당 1×105개의 세포를 분주하고, 24시간 동안 배양한 후 FBS가 첨가된 새 배지로 교환하고, 실험에 사용될 추출물들을 다양한 농도에서 24시간 처리하였다.
- 실험에 사용된 체중 30~33 g의 6주령 수컷 ICR 마우스는 ㈜샘타코(Korea)로부터 구입하여 사용하였다. 고형사료와 물을 충분히 공급하면서, 2주일간 실험실 환경에 적응시킨 후 실험을 실시하였고 실험기간 중 동물 사육실 온도는 24±2℃ 였으며, 습도는 40～50%, 명암은 12시간 주기로 전환하였다.
- 인간 각질 세포주인 HaCaT 세포는 10% fetal bovine serum(FBS)과 2 mM L-glutamine이 함유되어 있는 RPMI-1640(Gibco Laboratories, USA)에서 37℃, 5% CO2 배양기(Sanyo, Japan)에서 24시간 배양하였다. HaCaT 세포를 PBS로 세척한 후 자외선A(5,000 J/m2)를 조사하고, 정상배지 또는 표고버섯과 침향 추출물을 각각 농도별(0, 5, 10, 25, 50, 100 μg/mL) 혹은 각 추출물을 1:1로 혼합시켜 상기 농도와 동일한 농도별로 함유된 배지를 처리하여 24시간 동안 배양하였다.
- 본 실험에서 사용한 표고버섯(Lentinula edodes) 추출물은 건조 시료에 20배의 95% ethanol로 상온에서 24시간 동안 2회 반복 추출하여 여과지로 여과한 후, 여과액을 회전 진공 증발기(EYELA, Japan)로 감압 농축하여 추출물을 얻었다. 침향(Aquilariae agallocha) 추출물은 80 g을 70% ethanol로 추출하였는데, 시료 40 g씩 용매에 100 mL를 가하여 상온에서 24시간 동안 침지한 후 여과지로 여과하여 여과액을 얻었다. 얻어진 추출물을 진공증발기로 감압하고 농축하여 용매별 추출물을 얻었다.
데이터처리
- 모든 측정값은 평균값±표준편차(Mean±SD)로 표시하였다.
- 유의성 검증은 Student’s t-test를 사용하였고, p<0.05, p<0.01일 경우에 유의성이 있는 것으로 간주하였다.
성능/효과
- 표고버섯과 침향은 또한 모두 항알러지 효과가 있어 히스타민을 유리시켜 과발현을 억제하는 효과가 있다고 밝혀져 있다(Kim 등 1997; Bae & Ye 2007). 따라서 본 연구에서는 두 추출물을 혼합하여 알러지 반응에서 과발현되는 히스타민뿐만 아니라, IgE, IL-6에 대한 감소 효과를 확인하기 위해서, 실험동물인 ICR 마우스에 DNCB를 주 5회씩 3주 동안 도포하여 알러지성 접촉피부염을 유발시키고, 각 추출물을 1:1로 혼합하여 3차 증류수에 0.2%, 1%, 5%, 10%, 20%로 용해시켜 마우스 피부에 주 5회 간격으로 도포한 뒤, 정맥에서 채혈 혈액에서 얻은 혈청으로 ELISA를 이용하여 IgE, IL-6, 히스타민의 수준을 측정한 결과, DNCB에 의해 과발현된 IgE 및 사이토카인들이 추출 혼합물을 처리하였을 때 감소한 결과를 나타내었으며, IgE, IL-6, Histamine 모두 5%에서 양성대조군 대비 각각 약 40%, 30%, 30% 감소 효과를 나타내었다 (Fig. 4, 5, 6).
- 먼저 자외선을 각 세포군에 같은 양을 조사한 후, 표고버섯 추출물과 침향 추출물을 각각 0, 5, 10, 25, 50, 100 μg/mL씩 넣고 반응시킨 다음, DNA를 추출하여 slot blot을 이용하여 CPD와 8-OHdG의 수준을 측정한 결과, 표고버섯과 침향 추출물 각각 농도의존적으로 CPD와 8-OHdG의 수준을 감소시켰으며, 두 추출물을 상기 농도와 동일하게 1:1 혼합하였을 때 100 μg/mL에서 약 10~15% 더 감소시킨 결과를 나타내었다(Fig. 2, 3).
- 본 연구에서는 항산화 기능성을 나타내는 것으로 알려진 천연물 소재들인 표고버섯(Kim 등 2012)과 침향 추출물(Yeon JH 2009)을 혼합하여, 자외선으로 인해 감소된 세포활성도와 자외선으로 증가한 DNA 상해 반응인 8-OHdG 및 CPD와 같은 노화 관련 유전체 안정화 훼손 물질의 수준을 측정하여 유전체 안정화 효과를 확인하였으며, 나아가 이 두 추출물의 또 다른 뛰어난 기능인 면역체계 안정화를 이용하여 면역체계 불안정으로 발생하는 피부염에 대한 긍정적인 효과 또한 확인하였다. 나아가 실험동물 모델에서 이 두 추출물의 또 다른 기능인 면역체계 안정화를 이용하여 면역체계 불안정으로 발생하는 피부염에 대한 긍정적인 효과를 확인하기 위해, DNCB를 주 5회씩 3주 동안 도포하여 알러지성 접촉피부염을 유발시키고, 각 추출물을 혼합하여 마우스 피부에 도포한 뒤 실험을 통해서 IgE, IL-6, 히스타민의 과발현이 억제되었음을 밝혀내었다.
- 상기 방법에 따라 96 well plate에서 배양된 세포에 자외선A(5,000 J/m2)를 조사한 후 24시간 동안 표고버섯과 침향 추출물을 각각 0, 5, 10, 25, 50, 100 μg/mL씩 넣어 반응시킨 다음 처리하여 세포활성도를 측정한 결과, 두 추출물 모두 처리하지 않은 군에 비해 약 10% 가량 증가하였으며, 상기 농도와 동일한 농도로 두 추출물을 1:1 비율로 혼합하였을 때 추출물을 각각 처리한 군에 비하여 100 μg/mL에서 10% 정도 더 증가한 결과를 나타내었다(Fig. 1).
- 이상의 결과로 볼 때, 표고버섯과 침향 추출물은 인간 각질세포 모델에서 DNA 상해 반응에 대한 회복 효과와 실험동물모델에서 알러지성 접촉피부염에 대한 면역 안정화 효과가 있음을 확인하였다. 추출 혼합물에서 나타난 더 높은 효과는 항암, 항종양, 항산화 활성 등이 입증되어 있으며, 식품 및 의약품 소재로 크게 주목받고 있는 표고버섯의 lentinan, 면역 증강 효과를 가지는 균사체(Park SY 2009), 그리고 항염, 항알 러지, 항산화 등의 기능이 있는 침향의 세스퀴테르펜, 쿠쿠르 비타신과 같은 다양한 성분들에 의한 상승효과로 사료된다(Chen 등 2014).
- 표고버섯과 침향 모두 항산화 능이 있어 산화적 스트레스를 줄여줄 수 있다는 결과가 밝혀져 있다(Yeon JH 2009; Kim MJ 등 2012). 이와 같은 두 식물의 항산화능을 통하여 자외선으로 인해 증가한 산화적 스트레스를 감소시켜 주어, 본 연구의 결과와 같이 세포 활성도가 증가한 것으로 사료된다.
- 본 연구에서 상기 두 식물의 높은 항산화 능력을 통한 DNA 상해 감소 효과 및 면역안정 효과를 더욱 높이기 위해 두 식물의 추출물을 1:1 비율로 혼합한 뒤, 인간 각질형성 세포주인 HaCaT 세포에서 자외선A를 조사하고, 표고버섯과 침향의 추출물이 자외선A로 인해 증가한 8-OHdG나 CPDs와 같은 DNA 상해 반응에 어떠한 영향을 미치는지 확인하였다. 이후 DNCB를 이용하여 알러지성 접촉피부염을 유발한 mouse에 표고버섯과 침향의 추출물이 면역력에 어떤 영향을 미치는지 확인하여 산화적 스트레스로 인한 DNA 상해 반응에 효과와 면역 안정에 효과가 있으며, 두 추출물을 혼합하였을 때 더욱 강한 효과가 있다는 결과를 관찰하였다.
후속연구
- 본 연구는 표고버섯과 침향의 추출물을 이용하여 세포와 실험동물의 피부에 처리하였기 때문에 각 추출물의 어떠한 성분들이 상승효과로 본 연구와 같은 결과를 나타내었는지는 아직 정확히 알 수 없으나, 항산화 능력을 갖고 면역력을 증진시켜주는 표고버섯의 비타민 D나 글루칸과 같은 성분들(Mizuno & Nishitani 2013), 천식의 치료제로 이용되며, 항알러지 효과를 갖는 침향의 벤젠유도체 등이 이상의 긍정적인 효과를 나타낸 것으로 생각된다(Kim 등 1997). 따라서 후속 연구를 통하여 표고버섯과 침향의 특정 성분을 추출하여 어떤 성분이 상승효과를 내는지 밝혀내야할 필요성이 있다.
- 추출 혼합물에서 나타난 더 높은 효과는 항암, 항종양, 항산화 활성 등이 입증되어 있으며, 식품 및 의약품 소재로 크게 주목받고 있는 표고버섯의 lentinan, 면역 증강 효과를 가지는 균사체(Park SY 2009), 그리고 항염, 항알 러지, 항산화 등의 기능이 있는 침향의 세스퀴테르펜, 쿠쿠르 비타신과 같은 다양한 성분들에 의한 상승효과로 사료된다(Chen 등 2014). 자세한 기전은 후속연구를 통해 밝혀내야할 필요성이 있다.
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