선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 본 연구에서는 황기 유용물질 생산량 증대에 효과적인 부정 근을 유도하기 위하여 식물 호르몬인 IBA를 농도별로 배지에 첨가하여 이상적인 배지조건을 확립하고 황기의 유효성 분인 calycosin-7-O-β-D-glucopyranoside, calycosin 그리고 formononetin을 HPLC 분석으로 비교 하였다. 이를 바탕으로 황기 부정근의 대량생산을 통해 건강식품 및 의약품을 개발할수 있는 기초기반을 마련하는 것이 본 연구의 목적이다.
제안 방법
- HPLC 추출조건별 수율 및 성분 정량분석은 3회 반복으로 실시하였다. 분석된 데이터 값은 means ± SE 값으로 나타내었으며 실험값의 통계처리 및 유의성 검정은 SAS (Statistical Analysis System)프로그램을 사용하여 분산분석 (ANOVA)과 Duncan’s Multiple Range Test (DMRT)로 유의성을 검증하였다.
- 성분 분석을 위해 황기 부정근은 앞서 연구된 배양조건에서 가장 우수하게 배양된 부정근 4개 라인 (Ama1, Ama2, Ama3, Ama4)을 선발하여 사용하였다. 각 시료는 동결건조기 에서 48시간 건조하고 커터기 (Hanil, Seoul, Korea)를 이용해 조분쇄 하고, 30 g씩 정량하여 추출시료에 이용하였다. 선행연 구에서 추출물 및 지표성분의 수율을 확인한 결과 50% EtOH 를 사용하여 추출 하였을 때 수율이 가장 높은 것을 확인하였고 (Kim et al.
- 3%의 캘러스 발아율을 보였다. 따라서 본 연구에서는 황기의 부정근을 유도하기 위하여 기내에서 무균발아 된 황기의 잎, 줄기, 뿌리 절편을 이용하여 높은 캘러스 발아율을 나타낸 IBA를 사용하였고 호르몬의 농도를 다르게 첨가하여 유도용 배지를 제조하였다.
- 배양조건은 1일 16시간 조명, 25± 2℃, 3000럭스의 광량으로 조절되는 배양실에서 4주간 배양하였다.
- 본 연구에서는 황기 유용물질 생산량 증대에 효과적인 부정 근을 유도하기 위하여 식물 호르몬인 IBA를 농도별로 배지에 첨가하여 이상적인 배지조건을 확립하고 황기의 유효성 분인 calycosin-7-O-β-D-glucopyranoside, calycosin 그리고 formononetin을 HPLC 분석으로 비교 하였다.
- 부정근을 생산하기 위하여 황기종자를 1% NaOCl 5분, 70% EtOH 3 분간 표면 살균 후 멸균수에서 3회 세척하여 1/2 MS (Murashige and Skoog, 1962; Duchefa Biochemie, Haarlem, Netherlands)배지에 치상하였고 1일 16시간 조명, 25 ± 2℃, 3000럭스의 광량으로 조절되는 배양실에서 생육시키며 무균발아를 유도하였다.
- 배양조건은 캘러스 유도조건과 동일한 환경에서 2주간 배양하였다. 부정근의 진탕 배양을 위해 증식배지에서 배양된 부정근 1 g (FW)을 1, 0.5 ㎎ IBA와 3% sucrose, 0.35% gelite가 첨가된 액체 MS배지 30 ㎖ 에 넣어 인큐베이터에서 진탕배양 하였다. 배양조 건은 암조건으로 25 ± 2℃에서 2주간 배양하였다.
- 6 × 250 ㎜, 5 ㎛, Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA, USA)을 사용하여 오븐 온도 30℃에서 실시하였다. 사용된 이동상은 water (A) 및 acetonitrile (B)를 각 20분씩 초음파 처리를 하여 사용하였다. Autosampler를 이용해 20 ㎕를 주입하였다.
- 각 시료는 동결건조기 에서 48시간 건조하고 커터기 (Hanil, Seoul, Korea)를 이용해 조분쇄 하고, 30 g씩 정량하여 추출시료에 이용하였다. 선행연 구에서 추출물 및 지표성분의 수율을 확인한 결과 50% EtOH 를 사용하여 추출 하였을 때 수율이 가장 높은 것을 확인하였고 (Kim et al., 2013), 추출을 위하여 각 분석 시료에 50% EtOH를 300 ㎖ 을 넣은 후, 80℃ 수조에서 40분간 2회 반복 환류추출을 실시하였다. 추출된 시료는 rotary evaporator (N1000-S, Eyela, Tokyo, Japan)로 농축하였고, 건조된 시료 10 ㎎ 을 1 ㎖ 50% MeOH에 녹인 후 0.
- 유도된 부정근을 이용하여 증식배지로 계대배양 하였을 때 캘러스의 유도율이 가장 우수한 조건인 유도배지에서 얻어진 각 조직부위별 부정근을 이용하여 고체배양을 실시하였으며 기본배지는 MS로 교체하였다. 선행연구자 (Thwe et al.
- , 2013), 추출을 위하여 각 분석 시료에 50% EtOH를 300 ㎖ 을 넣은 후, 80℃ 수조에서 40분간 2회 반복 환류추출을 실시하였다. 추출된 시료는 rotary evaporator (N1000-S, Eyela, Tokyo, Japan)로 농축하였고, 건조된 시료 10 ㎎ 을 1 ㎖ 50% MeOH에 녹인 후 0.45 ㎛ membrane filter (Waters, Milford, MA, USA)로 여과하여 HPLC 분석을 실시하였다.
- 캘러스 유도배지는 indole-3-butyric acid (IBA)를 각각 3, 4, 5 ㎎ㆍℓ−1로 하고 3% sucrose에 0.35% gelite가 첨가된 고체 1/2 MS 배지를 사용하였다.
- 캘러스 유도배지에 접종된 황기 부위별 절편에서 캘러스를 유도한 후 각각의 부정근을 약 0.5 ㎝로 절단하여 1, 2, 3, 4, 5 ㎎ㆍℓ−1 IBA와 3% sucrose, 0.35% gelite가 첨가된 고체 MS배지로 옮겨 증식하였다.
- 황기 부정근의 액체배양을 위해 MS배지에 0.5와 1.0 ㎎ㆍℓ−1 IBA 농도로 배지를 제조하여 배양 하였다 (Fig. 1C).
- 황기 부정근의 증식을 위한 증식용 배지는 IBA의 농도를 더욱 세분화하여 1, 2, 3, 4, 5 ㎎ㆍℓ−1로 첨가한 배지에 부정근을 치상하였다.
- , Seoul, Korea)을 사용하였다. 황기 지표성분 분석 장비는 Agilent 1100 series HPLC system (Agilent Technologies, Wilmington, DE, USA)을 사용하였다. 그 외 기타 시약은 Sigma Chemical Co.
- 황기의 세 조직부위별 증식배지에서 성장이 가장 우수한 뿌리로부터 유도된 부정근을 사용하여 부정근 대량생산을 위한 액체배양을 수행하였다. 황기 부정근의 액체배양을 위해 MS배지에 0.
- 황기의 주요성분 정량을 위하여 황기의 isoflavonoid 성분인 calycosin-7-O-β-D-glucopyranoside, calycosin 및 formononetin을 지표성분으로 하여 HPLC로 분석하였다.
대상 데이터
- 부정근 유도를 위해 잎, 줄기, 뿌리 절편을 재료로 사용하였다. 각 부위별 절편은 0.
- 황기의 주요성분 정량을 위하여 황기의 isoflavonoid 성분인 calycosin-7-O-β-D-glucopyranoside, calycosin 및 formononetin을 지표성분으로 하여 HPLC로 분석하였다. 분석시료는 본 연구에서 유도된 황기 부정근 중에서 생장이 활발한 4개 라인을 선발하여 이용하였다. 선발된 각 라인을 Ama1, Ama2, Ama3 그리고 Ama4로 명명하였다.
- 황기 부정근의 정량분석에 사용된 지표성분 (calycosin-7-O-β-D-glucopyranoside, calycosin, formononetin)은 ChromaDex사 (Santa Ana, CA, USA)로부터 구입하여 사용하였다. 분석에 사용된 acetonitrile은 HPLC급 용매 (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ, USA)를 사용하였고 황기의 추출에는 주정 (Daehan Ethanol life Ltd., Seoul, Korea)을 사용하였다. 황기 지표성분 분석 장비는 Agilent 1100 series HPLC system (Agilent Technologies, Wilmington, DE, USA)을 사용하였다.
- 성분 분석을 위해 황기 부정근은 앞서 연구된 배양조건에서 가장 우수하게 배양된 부정근 4개 라인 (Ama1, Ama2, Ama3, Ama4)을 선발하여 사용하였다. 각 시료는 동결건조기 에서 48시간 건조하고 커터기 (Hanil, Seoul, Korea)를 이용해 조분쇄 하고, 30 g씩 정량하여 추출시료에 이용하였다.
- 식물재료는 인삼특작부 약용작물과 시험포장에서 육성한 황기 (Astragalus membranaceus)식물체를 사용하였다. 부정근을 생산하기 위하여 황기종자를 1% NaOCl 5분, 70% EtOH 3 분간 표면 살균 후 멸균수에서 3회 세척하여 1/2 MS (Murashige and Skoog, 1962; Duchefa Biochemie, Haarlem, Netherlands)배지에 치상하였고 1일 16시간 조명, 25 ± 2℃, 3000럭스의 광량으로 조절되는 배양실에서 생육시키며 무균발아를 유도하였다.
- 황기 부정근의 정량분석에 사용된 지표성분 (calycosin-7-O-β-D-glucopyranoside, calycosin, formononetin)은 ChromaDex사 (Santa Ana, CA, USA)로부터 구입하여 사용하였다.
데이터처리
- 또한 각 처리구간의 최소유의차 (p < 0.05) 수준에서 통계처리 하였다.
- 분석된 데이터 값은 means ± SE 값으로 나타내었으며 실험값의 통계처리 및 유의성 검정은 SAS (Statistical Analysis System)프로그램을 사용하여 분산분석 (ANOVA)과 Duncan’s Multiple Range Test (DMRT)로 유의성을 검증하였다.
성능/효과
- 각 성분의 함량을 살펴보면 calycosin-7-O-β-D-glucopyranoside는 5.25 ± 0.10 ㎍ㆍg−1으로 calycosin과 formononetin의 함량은 각각 0.73 ± 0.01 ㎍ㆍg−1, 1.53 ± 0.01 ㎍ㆍg −1로 분석되었다.
- 그 결과 Fig. 2와 같이 Ama1의 calycosin-7-O-β-D-glucopyranoside과 calycosin성분함량이 최대치를 나타내었다.
- 그 결과 Table 3에서와 같이 0.5 ㎎ㆍℓ−1 IBA의 배지에서 2.80 ± 0.84 g, 1.0 ㎎ㆍℓ−1 IBA의 배지에서 4.70 ± 1.32 g으로 고농도의 IBA가 첨가된 배지에서 배양된 황기 부정근이 저농도의 배지에서 배양된 황기 부정근에 비해약 2배의 생산량 차이를 관찰할 수 있었다.
- 그 결과 황기 뿌리로부터 유도된 부정근은 1 ㎎ㆍℓ−1 IBA에서 부정근 증식이 가장 우수하였다(Table 2, Fig. 1B).
- 따라서 황기의 flavonoid 성분 중에는 calycosin-7-O-β-D-glucopyranoside의 함량이 calycosin과 formononetin에 비해 높은 비율로 차지한 다는 것을 확인할수 있었다.
- 황기 부정근에 대해 선행 연구한 Thwe 등 (2012)에 의하면 황기의 부정근을 유도하기 위하여 IAA, IBA 그리고 NAA를이용한 결과 NAA에 의해 부정근 생장이 가장 양호한 것으로 보고하였다. 본 연구에서도 3종의 auxin을 이용해서 부정근을 유도한 결과 IAA에서 12.4%, NAA에서 23.6% 그리고 IBA 에서 56.3%의 캘러스 발아율을 보였다. 따라서 본 연구에서는 황기의 부정근을 유도하기 위하여 기내에서 무균발아 된 황기의 잎, 줄기, 뿌리 절편을 이용하여 높은 캘러스 발아율을 나타낸 IBA를 사용하였고 호르몬의 농도를 다르게 첨가하여 유도용 배지를 제조하였다.
- 특이한 점은 모든 황기 부정근 라인에서 formonetin의 함량은 Ama1 1.52 ± 0.01 ㎍ㆍg−1, Ama2 1.53 ± 0.01 ㎍ㆍg−1, Ama3 1.53 ± 0.02 ㎍ㆍg−1, Ama4 1.54 ± 0.03 ㎍ㆍg−1로 동일한 검출량을 보이는 반면 calycosin-7-O-β-D-glucopyranoside과 calycosin의 함량은 변화하는 것으로 나타났다.
- 황기 (Astragalus membranaceus)의 잎, 줄기, 뿌리절편을 3, 4 및 5 ㎎ㆍℓ−1의 IBA와 sucrose 30 gㆍℓ−1가 첨가된 1/2 MS 배지위에 치상하여 캘러스 유도율을 조사하였더니 캘러 스의 유도는 Table 1에서 보는바와 같이 잎은 4 ㎎ㆍℓ−1 IBA에서 75.4%, 줄기는 3 ㎎ㆍℓ−1 IBA에서 40.2% 그리고 뿌리에서 5 ㎎ㆍℓ−1 IBA에서 75.4%의 유도율을 보였다 (Fig. 1A).
후속연구
- 결과적으로 본 연구에서 검증한 황기부정근 생산의 최적조 건을 바탕으로 황기의 이차대사산물의 대량생산과 산업화를 위한 기초자료로써 활용 가치가 높을 것으로 사료된다.
- , 2006). 결과적으로 유도된 황기 부정근 4개 라인 중 Ama1의 유효성분 함량이 가장 우수한 것으로 보아 Ama1을 선발하여 bioreactor 를 이용한 대량생산시스템에 적용한다면 황기 부정근에 다량 으로 함유된 calycosin-7-O-β-D-glucopyranoside을 상업적으로 유용하게 이용할 수 있을 것이라고 사료된다. 또한 본 연구결과로부터 생산된 부정근을 이용하여 체세포배를 유도하고 식물체를 순화하여 노지에서 재배하는 방법을 지속적으로 연구한다면 오랜 시간 걸쳐 얻을 수 있는 우수 개체를 단기간에 얻을 수 있고 나아가 황기 전통육종법의 개선이 가능할 것이다.
- 또한 Wu 등 (2011)이 황기 부정근의 polysaccharide, saponin 및 flavonoid의 함량을 분석한 결과 노지 재배된 황기보다 높은 함량을 보였다. 따라서 본 연구에서 검증된 황기 부정근 생산조건으로 bioreactor에 적용하여 부정근을 생산한 다면 단기간에 대량으로 원료를 공급할 수 있어 식품과 의약품 산업의 기대 효과가 클 것으로 사료된다.
- , 2013). 따라서 약용 작물 특히, 장기간 재배시기가 소요되는 뿌리작물에 대해 유용 성분을 대량으로 생산할 수 있는 기내배양 시스템이 계속적으로 연구되어야 한다.
- 따라서 황기 뿌리추출물은 다양한 형태의 건강식품으로써의 가능성뿐만 아니라 추출물의 분리, 정제를 통하여 의약품 개발도 가능할 것으로 기대되고 있다. 건강식품이나 의약품 원료로 사용되기 위해서는 계속적인 황기의 공급이 필요하나 공급량이 증가되기 위해서는 많은 경작지가 필요하며 황기의 수확시기까지는 평균적으로 3 - 4년에 걸친 재배와 관리가 필수적이다 (Ma et al.
- 결과적으로 유도된 황기 부정근 4개 라인 중 Ama1의 유효성분 함량이 가장 우수한 것으로 보아 Ama1을 선발하여 bioreactor 를 이용한 대량생산시스템에 적용한다면 황기 부정근에 다량 으로 함유된 calycosin-7-O-β-D-glucopyranoside을 상업적으로 유용하게 이용할 수 있을 것이라고 사료된다. 또한 본 연구결과로부터 생산된 부정근을 이용하여 체세포배를 유도하고 식물체를 순화하여 노지에서 재배하는 방법을 지속적으로 연구한다면 오랜 시간 걸쳐 얻을 수 있는 우수 개체를 단기간에 얻을 수 있고 나아가 황기 전통육종법의 개선이 가능할 것이다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.