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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 자초의 주성분인 quinoid 화합물 중 주성분인 β-hydroxyisovalerylshikonin, acetylshikonin을 분리하여 선행연구와 대조15,16) 및 기기분석을 이용해 구조를 규명하고 이 성분을 이용 HPLC-UV를 사용하여 동시 분석법을 개발하고, 수십 종에 대한 함량분석을 실시하여 지표성분 및 함량을 제시하고, 나아가 다 성분 패턴을 이용 PCA 군집 분석을 통하여 기원종을 구분하는데 그 목적이 있다.
- 하지만 다양한 제제개발의 원료로 사용되는 자근의 확인시험 및 함량실험은 전혀 개발되어 있지 않아 유통되는 자초에 대한 품질평가가 전혀 실행되고 있지 않은 실정이다. 따라서 본 연구에서는 두 가지 이상의 성분을 동시 분석할 수 있는 다 성분 분석법을 개발하고, 함량분석을 실시하여 지표성분 및 함량을 제시하는 것에 목적을 두고 수십종에 대하여 진행하였다. 나아가 다성분 패턴을 이용 PCA 군집 분석을 통하여 기원종을 구분하였다.
제안 방법
- 각각의 standard stock solution은 모두 methanol로 희석하여 β-hydroxyisovalerylshikonin은 50, 100, 500, 1000, 2000 μg/ml, acetylshikonin은 150, 300, 150, 3000, 4000 μg/ml의 농도가 되도록 조제하였다.
- 30분간 초음파 추출한 후 원심분리기를 이용하여 3.000 rpm에서 5분간 원심분리 후 여과한 여액을 membrane filter(0.2 μm)에 통과시켜 이중 10 μl를 HPLC system에 주입하여 분석하였다.
- 4 kg을 분쇄기를 사용하여 분쇄하고 80% methanol 12 l를 넣고 24시간 추출하여 여과하였으며 이를 3회 반복 후 감압농축 하여 추출물 622 g을 얻었다. 추출물 622 g을 증류수 3 l에 현탁한 후 분액 깔때기에서 chloroform 을 가하여 진탕 반복추출하고 수층을 분취하여 chloroform 분획과 water 분획으로 각각 나누어 chloroform 분획 21.63 g, water 분획 600 g을 얻었다. choloroform 분획을 silica gel(이동상 chloroform : methanol=100 : 0.
- Compound 1은 50~2000 μg/ml, compound 2는 150~4000μg/ml의 농도 범위의 표준액을 조제하여 각각의 샘플을 확립된 분석법을 이용하여 3회 주입하였다.
- 용리 조건은 이동상 조성을 시간에 따라 변화시키는 기울기 용리를 사용 하였다(Table II). 검출파장은 210 nm을 선택하여 자근 추출물 및 표준품의 패턴 및 함량 분석을 실시하였다.
- 자근에서 분리한 2가지 주성분을 지표로 하여 HPLC-UV를 이용한 다 성분 동시분석법을 설정하였고 이에 대하여 ICH(International Conference on Harmonization) 가이드라인을 기준으로 분석법 검증을 실시하였다. 각각 농도의 표준액을 반복 측정하여 선택성(specificity), 직선성(linearity), 정량한계(LOQ), 검출한계(LOD), 정확성(accuracy) 및 반복성(Repeatability), 완건성(robustness)을 측정하여 분석법의 타당성을 검증하였다.
- 자근에서 분리한 2가지 주성분을 지표로 하여 HPLC-UV를 이용한 다 성분 동시분석법을 설정하였고 이에 대하여 ICH(International Conference on Harmonization) 가이드라인을 기준으로 분석법 검증을 실시하였다. 각각 농도의 표준액을 반복 측정하여 선택성(specificity), 직선성(linearity), 정량한계(LOQ), 검출한계(LOD), 정확성(accuracy) 및 반복성(Repeatability), 완건성(robustness)을 측정하여 분석법의 타당성을 검증하였다.
- 분석물질에 대하여 특이적이고 식별성을 가진 방법임을 입증하기 위해 compound 1, 2을 혼합하였을 경우 peak가 확실하게 분리되어 나타나는 것으로 특이성을 확인하였다.
- 검량선의 y 절편의 표준편차와 검량선의 기울기에 근거하는 방법으로, 표준용액을 단계별로 3회 반복 측정한 평균값으로 검량선을 작성하여 다음의 식에 따라 계산하여 검출한계와 정량한계를 확인하였다.
- 일정농도의 compound 1과 2의 표준액을 조제하여 각각의 샘플을 확립된 분석법을 이용하여 3회 주입하였다. 이와 같은 방법으로 실험하여 HPLC 크로마토그램에서 Inter-day, Intra-day 로 정확성 및 정밀성을 측정하였다.
- 일정농도의 compound 1과 2의 표준액을 조제하여 각각의 샘플을 확립된 분석법을 이용하여 3회 주입하였다. 이와 같은 방법으로 실험하여 HPLC 크로마토그램에서 Inter-day, Intra-day 로 정확성 및 정밀성을 측정하였다.
- 시험농도의 100%에 해당하는 농도로 compound 1, 2의 표준액을 조제하여 분석법의 전 조작을 3회 반복 측정하였다. 이에 따른 결과를 상대표준편차(RSD%)로 확인하였다.
- 얻어진 화합물은 물리 화학적 성상과 문헌조사 및 각종 기기분석(1H-NMR, 13C-NMR)을 통하여 자근(L. erythrorhizon)에서 분리된 성분을 β-hydroxyisovalerylshikonin, acetylshikonin로 최종 구조 동정하였다(Fig. 1).
- 시험방법의 조건이 일부 의도적으로 변경되었을 때 측정값이 영향을 받지 않는지에 대한 척도를 확인할 수 있으므로 column 과 유속을 변경하여 확인하였다.
- 자근(L. erythrorhizon)을 80% methanol로 추출하여 chloroform으로 탈지한 후 chloroform층과 water층을 얻었다. chloroform 분획층을 silica gel을 이용하여 open column chromatography를 통하여 총 3개의 화합물을 분리하였다.
- erythrorhizon)을 80% methanol로 추출하여 chloroform으로 탈지한 후 chloroform층과 water층을 얻었다. chloroform 분획층을 silica gel을 이용하여 open column chromatography를 통하여 총 3개의 화합물을 분리하였다. 얻어진 화합물은 물리 화학적 성상과 문헌조사 및 각종 기기분석(1H-NMR, 13C-NMR)을 통하여 자근(L.
- 정확성(accuracy) 및 정밀성(precision) − 확립된 분석밥법의 정확성을 확인하기 위하여 3가지 농도에 대하여 3번 반복 실험하였으며, 3개의 농도를 주입하여 검량선에 따라 구해진 갑과 참값을 비교한 회수율로 구하였다(Table V).
- 수집된 31개의 시료를 검증된 분석법을 이용하여 HPLC 함량 모니터링을 실시하였다(Fig. 4, Table VIII).
- 각종 기기분석(1H-NMR, 13C-NMR)을 통하여 자근(L. erythrorhizon)에서 분리한 2종의 quinoid 성분은 β-hydroxyisovalerylshikonin, acetylshikonin 로 확인 동정하였다.
- 자근(L. erythrorhizon)에서 분리 한 2가지 quinoid 성분인 β-hydroxyisovalerylshikonin과 acetylshikonin을 지표성분으로 설정하여 HPLC 분석조건을 확립하였다.
- 따라서 본 연구에서는 두 가지 이상의 성분을 동시 분석할 수 있는 다 성분 분석법을 개발하고, 함량분석을 실시하여 지표성분 및 함량을 제시하는 것에 목적을 두고 수십종에 대하여 진행하였다. 나아가 다성분 패턴을 이용 PCA 군집 분석을 통하여 기원종을 구분하였다.
- 먼저 천연물화학적 방법으로 자근(L. erythrorhizon)을 80% methanol으로 추출하여, chloroform으로 탈지과정을 거친 후 2종의 quinoid 성분을 자근(L. erythrorhizon)에서 분리 하였다.
- ICH 가이드라인을 기준으로 분석법 검증을 실시하여 단계별로 희석한 표준액을 반복 측정하여 특이성(specificity), 검출한계 (LOD) 및 정량한계(LOQ), 정확성(accuracy) 및 정밀성(precision), 반복성(repeatability), 완건성(robustness)을 측정 하여 분석법의 타당성을 검증하였다.
- 2 μm membrane filter로 여과한 후 HPLC 분석에 사용하였다. 이를 이용하여 검량선을 작성하였으며, 검량선의 직선성은 상관계수(R2)를 구하여 확인하였다.
- HPLC/UV를 이용한 함량분석에서 자근의 지표물질 2가지를 포함한 주변 피크들을 포함하여 총 6개의 면적을 변수로 하여 군집 분석(cluster analysis)과 주성분 분석(principal component analysis)에 적용하여 패턴분석을 하였다. 군집 분석과 주성분 분석에는 Kovach Computery Services사의 Multi Variate Statistical Package(version 3.
대상 데이터
- 본 연구의 실험에 사용한 기기로는 UV/VIS spectrophotometer (Human TU-1800PC, Korea, Optizen 2120 UV, Korea), Balance(Metter Toledo ML 204, Switzerland), Vortex mixer (Thermolyne type 37600 mixer, U.S.A.), Centrifuge(Hanil Science Industrial Co. Union Combi–514R, Korea), Shaking water bath(Daihan-SciLSB-045S, Korea), TLC Adsorbent (Kiesel gel 60 F254, Germany), 1H-NMR spectrometer(Varian Gemini 2000, 600 MHz, U.S.A.), 13C-NMR spectrometer (Varian Gemini 2000, 150 MHz, U.S.A.) 등이 있으며, 추출 및 분획과정, 성분규명에 사용된 용매는 Methanol, Ethanol, Acetonitrile, Chloroform, Water, Formic acid, Acetic acid(J.T. Baker, HPLC grade, U.S.A.), NMR Solvents(CD3OD, internal standard, TMS) 등을 사용하였다.
- 표준액으로는 자근(L. erythrorhizon) 추출물에서 분리한 2종의 화합물 β-hydroxyisovalerylshikonin, acetylshikonin을 사용하였으며, 각각 1.0 mg 씩 정밀하게 취하여 메탄올 1ml을 가한 후, 1 mg/ml의 standard stock solution을 만들어 4℃에 보관하고 사용 전에 희석하여 사용하였다.
- HPLC 분석에 사용한 기기로는 YL9100 system, YL9101 Vacuum Degasser, YL9110 Quaternary Pump, YL9120UV/Vis Detector(Korea), ACE C18(4.6×250 mm, 5 μm), Kromasil 100-5 C18(4.6×250 mm, 5 μm), Sunfire C18(4.6×250 mm, 5 μm)을 사용하였다.
- Column Chromatography의 충진제로는 Silica gel(70-230 mesh, Merck, Germany), Sephadex LH-20(25~100 μm, Pharmacia, Sweden)을 사용하였다.
- 본 실험에서 사용한 자근(lithospermum root) 시료는 2014년 11월 경동시장에서 구입하여 중앙대학교 약품자원식물학실에서 기원 및 형태학적 감정을 거친 후 연구의 재료로 사용하였다. 또한 패턴 및 함량 분석을 실시하기 위해 시중에 유통되는 중국, 내몽고, 이란 자근을 국내 약재시장 및 중국 약재시장 등에서 구입하여 감정을 거친 후 분석에 사용하였다.
- 본 실험에서 사용한 자근(lithospermum root) 시료는 2014년 11월 경동시장에서 구입하여 중앙대학교 약품자원식물학실에서 기원 및 형태학적 감정을 거친 후 연구의 재료로 사용하였다. 또한 패턴 및 함량 분석을 실시하기 위해 시중에 유통되는 중국, 내몽고, 이란 자근을 국내 약재시장 및 중국 약재시장 등에서 구입하여 감정을 거친 후 분석에 사용하였다.
- 국내산 자근(L. erythrorhizon) 2.4 kg을 분쇄기를 사용하여 분쇄하고 80% methanol 12 l를 넣고 24시간 추출하여 여과하였으며 이를 3회 반복 후 감압농축 하여 추출물 622 g을 얻었다. 추출물 622 g을 증류수 3 l에 현탁한 후 분액 깔때기에서 chloroform 을 가하여 진탕 반복추출하고 수층을 분취하여 chloroform 분획과 water 분획으로 각각 나누어 chloroform 분획 21.
- 검액 및 표준액 조제 - 국내에 현재 유통되는 자근을 기원별, 지역별로 31품목을 수집하였다(Table I). 수집한 샘플을 분쇄기로 균질하게 분쇄하여 50호(300 μm) 체로 친 후 0.
- HPLC 분석조건 - 고정상은 Kromasil C18(4.6×250 mm, 5 μm particle size) 컬럼을 사용하였으며, 이동상은 Acetonitrile와 Water을 사용하였다.
데이터처리
- 기울기 S는 분석대상물질의 검량선으로부터 구하였으며 표준편차(σ)는 정량한계 내에 있는 분석대상물질을 포함한 검체를 사용하여 특이적인 검량선을 작성한 후 y 절편의 표준편차를 표준 편차 σ로서 이용하였다.
- Compound 1은 50~2000 μg/ml, compound 2는 150~4000μg/ml의 농도 범위의 표준액을 조제하여 각각의 샘플을 확립된 분석법을 이용하여 3회 주입하였다. 이를 이용하여 검량선을 작성하였으며 검량선으로부터 직선식의 상관계수(correlation coefficient)를 구하여 직선성을 확인하였다.
- 시험농도의 100%에 해당하는 농도로 compound 1, 2의 표준액을 조제하여 분석법의 전 조작을 3회 반복 측정하였다. 이에 따른 결과를 상대표준편차(RSD%)로 확인하였다.
- 반복성(repeatability) − 각 성분 피크 면적비의 표준편차를 각 면적비의 평균 값으로 나눈 비의 백분율(%)로서 구하였으며 compound 1은 0.4%, compound 2는 0.4%의 정밀성을 나타내었다(Table VI).
- HPLC/UV를 이용한 함량분석에서 자근의 지표물질 2가지를 포함한 주변 피크들을 포함하여 총 6개의 면적을 변수로 하여 군집 분석(cluster analysis)과 주성분 분석(principal component analysis)에 적용하여 패턴분석을 하였다. 군집 분석과 주성분 분석에는 Kovach Computery Services사의 Multi Variate Statistical Package(version 3.13p) 프로그램을 사용하였고, 총 31개 자근의 2종 물질의 면적을 변수로 하여 군집 분석을 실시하였다(Fig. 6, 7). 그 결과 자근은 산지보다는 기원에 따른 구분이 명확하게 확인되었다.
이론/모형
- 각 표준물질 혼합용액은 연속희석법을 이용하여 희석하였으며, 준비된 각 표준액을 0.2 μm membrane filter로 여과한 후 HPLC 분석에 사용하였다.
성능/효과
- 특이성(Specificity) − Compound 1, 2의 머무름 시간은 compound 1이 약 16.04분, compound 2가 약 18.20분에 명확하게 분리되어 나타나는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 2).
- 이상의 가이드라인을 바탕으로 HPLC를 이용하여 국내 및 중국, 이란에서 유통되고 있는 31종의 자근 시료에 대한 함량평가를 실시한 결과, β-hydroxyisovalerylshikonin 0.20%, acetylshikonin 0.22% 이상을 함유하고 있다는 것을 확인할 수 있었다.
- 6, 7). 그 결과 자근은 산지보다는 기원에 따른 구분이 명확하게 확인되었다.
- 또한 HPLC를 이용한 함량평가 결과를 바탕으로 다변량분석(PCA)을 통하여 종간 또는 지역별 유사성 실험을 실시하였으며, 그 결과 산지보다는 기원에 따른 구분이 명확하게 확인되었다.
- 이상의 결과를 종합하여 우리나라뿐만 아니라 중국에서 수입되어 유통되는 자근에서 분리한 2가지 quinoid 주성분인 β-hydroxyisovalerylshikonin과 acetylshikonin를 이용하여 다 성분 함량 품질 평가 방법을 개발하였으며 또한 PCA 군집 분석을 통하여 유통품의 기원별 구분을 확인할 수 있었다. 위와 같은 결과를 바탕으로 하여 자근을 이용한 화장품 및 기능성 식품개발에 기초자료로서 제공될 수 있을 것으로 사료된다.
- HPLC를 이용한 모니터링 결과, 수집한 자근 샘플 모두에서 유사한 패턴을 보였으며, 평균적으로 β-hydroxyisovalerylshikonin는 0.20%, acetylshikonin는 0.22%를 함유하고 있는 것을 확인할 수 있었다(Table VIII).
- 직선성(Linearity) − Compound 1, 2의 표준액을 각각 compound 1은 50~2000 μg/ml, compound 2는 150~4000 μg/ml의 농도 범위에서 검량선을 작성한 결과, 모든 성분에 대하여 검량선의 상관계수(R2)가 0.99 이상의 양호한 직선성을 나타내었다(Fig. 3, Table III).
- 22%를 함유하고 있는 것을 확인할 수 있었다(Table VIII). 또한 자근의 기원별로 HPLC 크로마토그램 패턴의 차이를 확인할 수 있었다(Fig. 5).
후속연구
- 이상의 결과를 종합하여 우리나라뿐만 아니라 중국에서 수입되어 유통되는 자근에서 분리한 2가지 quinoid 주성분인 β-hydroxyisovalerylshikonin과 acetylshikonin를 이용하여 다 성분 함량 품질 평가 방법을 개발하였으며 또한 PCA 군집 분석을 통하여 유통품의 기원별 구분을 확인할 수 있었다. 위와 같은 결과를 바탕으로 하여 자근을 이용한 화장품 및 기능성 식품개발에 기초자료로서 제공될 수 있을 것으로 사료된다.
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