선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 본 연구는 장려 품종 누에고치로부터 실크 세리신과 실크 피브로인으로 분리하여 이들 단백질을 세포 첨가제로 개발하기 위하여 수행되었다. 장려품종 누에고치를 고온 고압기를 통하여 실크 세리신을 먼저 추출하였으며, 남겨진 실크 피브로인을 이용하여 시간별로 용해하여 품종별 실크 피브로인을 얻었다.
- 원활한 세포의 점착과 분화가 이루어질 수 있는 우수한 공극구조를 지닌 다공성의 3차원 고분자 지지체의 공극률, 공극의 크기, 공극의 모양 등은 지지체가 갖추어야 할 중요한 매개변수이다. 본 연구에서는 누에고치의 품종별 공극구조 차이를 살펴보기 위하여 공극률을 측정하였다. 금옥잠으로부터 얻은 누에고치의 경우 84.
- 본 연구에서는 실크 단백질(세리신, 피브로인)을 이용하여 혈청을 대체하는 첨가제를 개발하기 위하여 현재 농가에서 가장 많이 사용하는 장려품종인 백옥잠, 금옥잠, 대성잠의 3가지 품종으로부터 각 누에고치의 특성을 분석하고, 누에고치로부터 실크 세리신 및 실크 피브로인을 각각 분리한 다음, 이들 실크 단백질들을 이용하여 세포 성장에 미치는 영향을 관찰하였다.
제안 방법
- PCR 반응은 PCR 기기(Takara, Japan)를 이용하여 94oC에서 4분 predenaturation 후, 94oC에서 60초 동안 denaturation, 53oC 에서 60초 동안 annealing, 72oC에서 60초 동안 extension 반응을 35 cycle 반복 실시하였고, 마지막으로 72oC에서 10분 동안 최종 extension하였다. PCR 반응으로 생성된 산물은 1% 아가로스겔을 이용하여 전기영동하고 UV하에서 관찰하였다. 얻어진 이미지는 Gel capture program(Lifetechnologies, USA)을 이용하여 분석하였다.
- EGF (sense, 5’-TGC CAG CTG CAC AAA TAC AGA GGG-3’; antisense, 5’- CAT CGT GGG CA GGG GC ATT CA-3’), β-actin (sense, 5’-GCA TGG GTC AGA AGG ATT-3’; antisense, 5’-ACA CGC AGC TCA TTG TAG A-3’). PCR 반응은 PCR 기기(Takara, Japan)를 이용하여 94oC에서 4분 predenaturation 후, 94oC에서 60초 동안 denaturation, 53oC 에서 60초 동안 annealing, 72oC에서 60초 동안 extension 반응을 35 cycle 반복 실시하였고, 마지막으로 72oC에서 10분 동안 최종 extension하였다. PCR 반응으로 생성된 산물은 1% 아가로스겔을 이용하여 전기영동하고 UV하에서 관찰하였다.
- 세포 생장 관련 유전자인 EGF의 발현수준을 분석하기 위하여 각 품종별 실크 단백질을 첨가하여 일정시간 배양한 세포로부터 전체 RNA를 Trizol (Invitrogen, CA)을 이용하여 제조사에서 제공한 방법에 따라 분리하였다. cDNA 합성과 PCR(Polymerase Chain Reaction)은 amfiRivert 1-step RT-PCR kit (GenDEPOT, USA)를 사용하였다. EGF 분석을 위한 PCR 프라이머는 다음과 같다.
- 가잠누에 3품종(백옥잠, 금옥잠, 대성잠)으로부터 제조된 실크 세리신과 실크 피브로인의 분자량을 측정하였다 (그림 1). 실크 세리신은 백옥잠, 금옥잠, 대성잠 모두 98 kDa에서부터 3.
- 각 품종별 누에고치 10 g에 증류수 300 ml을 가하여 120oC, 0.1 MPa 조건하에서 고온고압기를 이용하여 5시간 추출하여 실크 세리신 수용액을 제조하였다. 실크 피브로인 수용액을 얻기 위하여 세리신이 제거된 정련견을 CaCl2 : H2O : EtOH 혼합용매 (몰비 1 : 8 : 2)를 이용하여 욕비 1 : 20으로 85oC에서 1, 3, 5 시간 처리하였다.
- 37oC, 5% CO2 배양기에서 10%(v/v) FBS (GIBCO, USA)와 스트렙토마이신과 페니실린(GIBCO, USA)이 함유된 DMEM 배지(Dulbecco’s modified Eagle’s medium, Lonza Walkersville, USA)를 사용하여 배양하였다. 각 품종별 실크 수용액의 세포독성을 확인하기 위하여, 96well plate에 세포(1,000 cells/well)를 접종하여 24시간 배양 후 실크 단백질들을 처리하여, 이들의 세포 독성을 평가하였다. 세포증식에 관한 실크 단백질들의 영향을 살펴보기 위하여 96well plate에 세포(1,000 cells/well)를 접종한 뒤 실크 세리신의 농도를 0~5 μg 처리한 뒤 1, 3, 7일 배양하여 세포 생장을 측정하였다.
- 또한 실크 피브로인의 농도를 0 ~ 50 μg 처리한 뒤 1, 3, 7일 뒤에 세포 생장을 확인하였다.
- 이들 실크 세리신과 실크 피브로인을 이용하여 세포 독성, 세포 증식 및 분열 관련 유전자 발현 분석을 확인하였다. 먼저, 누에고치의 특성을 분석하기 위하여 공극률을 측정하였다. 공극률은 금옥잠 누에고치의 경우 84.
- 세포 생장 관련 유전자인 EGF의 발현수준을 분석하기 위하여 각 품종별 실크 단백질을 첨가하여 일정시간 배양한 세포로부터 전체 RNA를 Trizol (Invitrogen, CA)을 이용하여 제조사에서 제공한 방법에 따라 분리하였다. cDNA 합성과 PCR(Polymerase Chain Reaction)은 amfiRivert 1-step RT-PCR kit (GenDEPOT, USA)를 사용하였다.
- 세포증식에 관한 실크 단백질들의 영향을 살펴보기 위하여 96well plate에 세포(1,000 cells/well)를 접종한 뒤 실크 세리신의 농도를 0~5 μg 처리한 뒤 1, 3, 7일 배양하여 세포 생장을 측정하였다.
- 1 MPa 조건하에서 고온고압기를 이용하여 5시간 추출하여 실크 세리신 수용액을 제조하였다. 실크 피브로인 수용액을 얻기 위하여 세리신이 제거된 정련견을 CaCl2 : H2O : EtOH 혼합용매 (몰비 1 : 8 : 2)를 이용하여 욕비 1 : 20으로 85oC에서 1, 3, 5 시간 처리하였다. 용해 후 불용분을 제거하기 위해 여과하고, 투석막 (MWCO = 12,000 ~ 14,000)을 이용하여 3일 동안 흐르는 증류수에 투석하여 실크 용액을 여과하여 수용액을 제조하였다.
- PCR 반응으로 생성된 산물은 1% 아가로스겔을 이용하여 전기영동하고 UV하에서 관찰하였다. 얻어진 이미지는 Gel capture program(Lifetechnologies, USA)을 이용하여 분석하였다.
- 실크 피브로인 수용액을 얻기 위하여 세리신이 제거된 정련견을 CaCl2 : H2O : EtOH 혼합용매 (몰비 1 : 8 : 2)를 이용하여 욕비 1 : 20으로 85oC에서 1, 3, 5 시간 처리하였다. 용해 후 불용분을 제거하기 위해 여과하고, 투석막 (MWCO = 12,000 ~ 14,000)을 이용하여 3일 동안 흐르는 증류수에 투석하여 실크 용액을 여과하여 수용액을 제조하였다.
- 장려품종 누에고치를 고온 고압기를 통하여 실크 세리신을 먼저 추출하였으며, 남겨진 실크 피브로인을 이용하여 시간별로 용해하여 품종별 실크 피브로인을 얻었다. 이들 실크 세리신과 실크 피브로인을 이용하여 세포 독성, 세포 증식 및 분열 관련 유전자 발현 분석을 확인하였다. 먼저, 누에고치의 특성을 분석하기 위하여 공극률을 측정하였다.
- 먼저, 누에고치를 일정 에탄올(V1)이 담긴 메스 실린더에 5분 동안 침지시킨 뒤, 에탄올과 누에고치의 총 부피(V2)를 측정한 다음 누에고치를 메스실린더에서 제거한다. 이후의 남은 에탄올 부피(V3)를 측정한 후, 다음 과 같은 계산식으로 공극률을 측정하였다.
- 본 연구는 장려 품종 누에고치로부터 실크 세리신과 실크 피브로인으로 분리하여 이들 단백질을 세포 첨가제로 개발하기 위하여 수행되었다. 장려품종 누에고치를 고온 고압기를 통하여 실크 세리신을 먼저 추출하였으며, 남겨진 실크 피브로인을 이용하여 시간별로 용해하여 품종별 실크 피브로인을 얻었다. 이들 실크 세리신과 실크 피브로인을 이용하여 세포 독성, 세포 증식 및 분열 관련 유전자 발현 분석을 확인하였다.
- 제조된 실크 세리신과 실크 피브로인의 분자량을 측정하기 위하여 NuPAGE Bis-Tris gel(novex, USA)을 이용하여 제조사에서 제공한 매뉴얼에 따라 전기영동을 실시하였다. 전기영동이 완료된 젤은 ProsiBlue Gel Staining Solution(GenDEPOT, USA)으로 염색하였다.
대상 데이터
- 37oC, 5% CO2 배양기에서 10%(v/v) FBS (GIBCO, USA)와 스트렙토마이신과 페니실린(GIBCO, USA)이 함유된 DMEM 배지(Dulbecco’s modified Eagle’s medium, Lonza Walkersville, USA)를 사용하여 배양하였다.
- 마우스 유래 세포주인 Mouse fibroblast cell L929(ISO 14971 공시세포)를 한국세포주은행으로부터 구입하여 실험을 진행하였다. 37oC, 5% CO2 배양기에서 10%(v/v) FBS (GIBCO, USA)와 스트렙토마이신과 페니실린(GIBCO, USA)이 함유된 DMEM 배지(Dulbecco’s modified Eagle’s medium, Lonza Walkersville, USA)를 사용하여 배양하였다.
- 또한 실크 피브로인의 농도를 0 ~ 50 μg 처리한 뒤 1, 3, 7일 뒤에 세포 생장을 확인하였다. 본 연구에서 사용한 세포는 모두 passage 3였다.
이론/모형
- 각 품종별 누에고치의 공극률을 측정하기 위하여 에탄올을 이용한 액체전이법(liquid displacement method)을 사용하였다. 먼저, 누에고치를 일정 에탄올(V1)이 담긴 메스 실린더에 5분 동안 침지시킨 뒤, 에탄올과 누에고치의 총 부피(V2)를 측정한 다음 누에고치를 메스실린더에서 제거한다.
성능/효과
- 가잠 장려품종을 이용하여 제작된 실크 세리신과 피브로인 등 12종류의 수용액을 이용한 세포독성평가 결과 모든 실크 단백질 수용액에 대한 세포독성은 없었으며, 오히려 세포 증식 효과를 보였다.
- 먼저, 누에고치의 특성을 분석하기 위하여 공극률을 측정하였다. 공극률은 금옥잠 누에고치의 경우 84.71%, 대성잠 81.58%, 백옥잠 73.23%의 공극률 값이 나타났다. 분자량 차이에 있어서 실크 세리신은 품종의 영향이 크지 않았으나 실크 피브로인의 경우, 금옥잠은 5시간의 장시간의 용해에도 불구하고 100 kDa 이상의 큰 분자량을 나타내었다.
- 본 연구에서는 누에고치의 품종별 공극구조 차이를 살펴보기 위하여 공극률을 측정하였다. 금옥잠으로부터 얻은 누에고치의 경우 84.71%, 대성잠은 81.58%, 백옥잠은 73.23%의 공극률을 보였다. 누에고치 품종에 따라 공극률의 차이가 많게는 10% 이상 차이가 나는 것을 확인할 수 있었다.
- 또한, 5시간의 용해에도 불구하고 큰 분자량을 갖는 단백질이 계속 존재하고 있음을 보여주어 낮은 분자량의 시료 조제를 위해서는 금옥잠의 용해 방법을 변경해 볼 필요가 있는 것으로 사료된다. 또한, 5시간의 장시간 용해에도 분자량의 변화가 대성잠에 비하여 상대적으로 덜 일어나고, 나머지 2 품종보다 큰 분자량을 나타내는 밴드가 확인되어 금옥잠으로부터 얻은 실크 피브로인이 비교적 강하다고 생각된다. 본 연구에서 진행한 가잠 내에서의 품종별 실크 단백질의 분자량 차이는 Chung et al.
- 장려품종 누에를 사용하여 제조된 실크 세리신과 실크 피브로인을 이용하여 세포 증식 실험을 하였으며 백옥잠으로부터 얻은 실크 세리신의 경우 농도에 따라 유의적으로 세포 증식 효과가 나타났으며, 금옥잠으로부터 얻은 실크 피브로인의 경우 5시간 용해 시 세포 증식에 있어서 가장 우수한 결과를 보였다. 또한, 백옥잠 실크 세리신 처리 결과 세포 증식 관련 유전자의 발현수준이 증가됨을 확인할 수 있었다.
- 5 kDa까지 단백질 밴드가 연속적으로 이어지는 비슷한 양상이 나타난 반면, 실크 피브로인은 누에품종에 따라 그리고 용해 시간에 따라 분자량에 차이가 있는 것으로 나타났다. 먼저, 백옥잠의 경우 98 kDa에서부터 단백질 밴드가 연속적으로 나타났으며 용해시간에 따른 변화는 뚜렷하지 않았고 다른 품종에 비해 피브로인 분자량이 100 kDa 이하에 분포하고 있는 특징을 보여주었다. 금옥잠은 200 kDa 이상에서부터 단백질 밴드가 연속적으로 나타났으며, 백옥잠보다 더 큰 분자량을 보여주었다.
- 백옥잠, 금옥잠, 대성잠 누에고치로부터 용해 시간을 달리하여 얻어진 실크 피브로인 수용액의 세포 증식 효과는 금옥잠 피브로인 1시간 용해액을 낮은 농도로 처리하였을 경우 약간의 증식 효과를 보였으며, 특히 5시간 용해한 금옥잠 피브로인의 경우 높은 농도로 처리 시 뚜렷한 효과를 나타냈다(그림 3). 그러나 백옥잠과 대성잠의 경우 용해 시간이나 처리 농도에 대한 증식 효과는 확인 수 없었다.
- 가잠누에 3품종(백옥잠, 금옥잠, 대성잠)으로부터 제조된 실크 세리신과 실크 피브로인의 분자량을 측정하였다 (그림 1). 실크 세리신은 백옥잠, 금옥잠, 대성잠 모두 98 kDa에서부터 3.5 kDa까지 단백질 밴드가 연속적으로 이어지는 비슷한 양상이 나타난 반면, 실크 피브로인은 누에품종에 따라 그리고 용해 시간에 따라 분자량에 차이가 있는 것으로 나타났다. 먼저, 백옥잠의 경우 98 kDa에서부터 단백질 밴드가 연속적으로 나타났으며 용해시간에 따른 변화는 뚜렷하지 않았고 다른 품종에 비해 피브로인 분자량이 100 kDa 이하에 분포하고 있는 특징을 보여주었다.
- 이러한 EGF의 발현이 백옥잠 세리신의 농도에 유의적으로 증가하였고, 최고 4배까지 증가되었다는 것은 DNA의 합성과 세포증식을 유도한 앞선 결과(그림 2, 3)와 일치한다. 이상의 연구 결과로써, 가잠 누에라 할지라도 서로 다른 품종으로 부터 생산된 누에고치의 공극률과 같은 누에고치 자체의 특성 뿐 아니라 서로 다른 품종의 누에고치로부터 얻어진 실크 세리신과 실크 피브로인의 분자량 등 화학적 특성 차이가 있음을 확인할 수 있었다. 또한 이들 실크 단백질의 세포증식에 대한 영향에 있어 품종에 따른 확연한 차이를 발견할 수 있었다.
- 분자량 차이에 있어서 실크 세리신은 품종의 영향이 크지 않았으나 실크 피브로인의 경우, 금옥잠은 5시간의 장시간의 용해에도 불구하고 100 kDa 이상의 큰 분자량을 나타내었다. 장려품종 누에를 사용하여 제조된 실크 세리신과 실크 피브로인을 이용하여 세포 증식 실험을 하였으며 백옥잠으로부터 얻은 실크 세리신의 경우 농도에 따라 유의적으로 세포 증식 효과가 나타났으며, 금옥잠으로부터 얻은 실크 피브로인의 경우 5시간 용해 시 세포 증식에 있어서 가장 우수한 결과를 보였다. 또한, 백옥잠 실크 세리신 처리 결과 세포 증식 관련 유전자의 발현수준이 증가됨을 확인할 수 있었다.
- 제작된 실크 단백질 중 가장 세포 증식 효과가 우수한 백옥잠 세리신을 대상으로 세포 생장과 관련된 EGF, FGF, PDGF 유전자의 발현 수준을 분석하였으며, 이들 유전자의 발현수준이 증가됨을 확인할 수 있었다(그림 4). EGF는 세포 증식과 성장에 관여하는 호르몬 중 하나로써, RNA와 DNA를 자극하는 여러 종류의 세포분화에 관여하는 것으로 알려져 있다.
후속연구
- 또한 이들 실크 단백질의 세포증식에 대한 영향에 있어 품종에 따른 확연한 차이를 발견할 수 있었다. 본 연구를 통해서 확인된 백옥잠 세리신을 이용하여 다양한 세포에 적용하여 고가의 소 혈청을 대체할 수 있는 세포 첨가제가 개발될 수 있기를 기대해 본다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.