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문제 정의
- 알려진 바가 없다. 따라서 세리신의 분자량을 제어하면서 수용화 할 수 있는 빙법과 분자량에 따른 특성들 및 이들의 응용에 대해 알아보기 위하여 우선, 본 실험에서는 세리신의 분자량 제어를 위해 절각견을 고온고압 정련하여 수용성 세리신을 얻고, 남은 난용성 세리신을 추출하여 효소 가수분해하였다. 효소 가수분해 조건에 따른 세리신의 용해도와 분자량 변화를 여러 방법으로 살펴보고 세리신의 분자량을 어느 정도 제어할 수 있는지에 대해 알아보고 그 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
- 본 실험에서는 FAO의 식품 첨가물용 효소규격에 적합한 제품을 사용하여 난용성 세리신의 효소 가수분해 시최적의 가수분해 조건을 알아보기 위한 실험을 하여 그림 2~5에 나타내었으며 가수분해 정도를 흡광도로 나타내었다.
- 따라서 세리신의 분자량을 제어하면서 수용화 할 수 있는 빙법과 분자량에 따른 특성들 및 이들의 응용에 대해 알아보기 위하여 우선, 본 실험에서는 세리신의 분자량 제어를 위해 절각견을 고온고압 정련하여 수용성 세리신을 얻고, 남은 난용성 세리신을 추출하여 효소 가수분해하였다. 효소 가수분해 조건에 따른 세리신의 용해도와 분자량 변화를 여러 방법으로 살펴보고 세리신의 분자량을 어느 정도 제어할 수 있는지에 대해 알아보고 그 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
제안 방법
- 0.5 g의 난용성 세리신 분말을 욕비 1:50, 효소의 양은 세리신 분말의 10%, kojizyme과 flavourzyme의 pH는 6, 온도는 50℃에서, protamex와 alcalase의 pH는 7, 온도는 60℃에서 각각 0.5, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20, 24시간 가수분해하여 처리 시간에 따른 흡광도를 측정하였다.
- 만들어 실험 중 pH 변화를 최소화하였다. 0.5 g의 난용성 세리신 분말을 욕비 1:50, 효소의 양은 세리신 분말의 10%, 온도는 50℃, pH(4, 5, 6, 7, 8, 9)별로 12시간 가수분해하여 pH 변화에 따른 흡광도를 측정하였다.
- 0.5 g의 난용성 세리신 분말을 욕비 1:50, 효소의 양은세리신 분말의 0.5, 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30%로 하고, kojizyme 과 flavourzyme의 pH는 6, 온도는 50℃에서, protamex와 alcalase의 pH는 7, 온도는 60℃에서 각각 4시간 가수분해하여 효소 농도 변화에 따른 흡광도를 측정하였다.
- 0.5 g의 난용성 세리신 분말을욕비 1:50, 효소의 양은 세리신 분말의 10%, kojizyme과 flavourzyme의 pH는 6, 온도는 30, 40, 50, 60℃에서, protamex와 alcalase의 pH는 7, 온도는 30, 40, 50, 60, 70℃에서 각각 12시간 가수분해하여 온도 변화에 따른 흡광도를 측정하였다.
- 난용성 세리신 1 g을 6N HCl 로 가수분해한 후 감압건조, 수세 , 건조 후 증류수를 첨가하여 10ml로 정용하여 0.45 |J.m membrane filter로 여과한 후 닌히드린반응 시켜 흡광도를 측정하여 완전 가수분해된 세리신의 mol 흡광도를 기준으로 하였다. 닌히드린반응 시 완전 가수분해 액은 증류수를 첨가하여 0.
- 난용성 세리신 30 g을 욕비 1:50으로 하고, kojizyme의 경우는 효소농도 0.5% o.w.s., pH 6, 온도 50℃에서 4시간 처리하였고, protamex의 경우는 효소농도 0.5% o.w.s., pH 7, 온도 60℃에서 8시간 처리하였고, alcalase는 효소농도 5% o.w.s., pH 7, 온도 60>C에서 8시간 처리하였다. 각 시간 처리 후 85℃에서 5분간 처리하여 효소의 활성을 없앤 후 식혀서 , filter paper를 이용하여 1차 여과한 후 glass filter (G4)를 이용하여 2차 여과하여 얻은 용액을 동결건조 하였다.
- 이룬다. 본 실험에서는 간단하게 알아볼 수 있는 말단기 정량법을 이용하여, 최적 pH와 온도에서 각 효소의 처리 시간과 농도 변화에 따라 수용성화 된 세리신의 평균 중합도를 측정하였다.
- 원심분리 하였다. 상등액을 취하여 20배 희석한 후분광광도계 (UV, VIS-spectrophotometer, Beckman, DU 650) 로 세리신의 최대흡수파장인 271nm에서 측정한 흡광도값을 용해도의 척도로 하였다.
- 수용성 세리신 분말 2종과 효소 가수분해로 얻은 분말 3종의 분자량 분포를 알아보기 위해 GPC-MALS(wyatt, DAWN EOS(S/N:245-E))를 이용하여 측정하였다.
- 앞에서 효소농도와 처리시간에 따른 용해도를 알아보았는데, 이들에 대한 흡광도를 측정하여 용해도와 흡광도의 상관관계를 알아보았다.
- 이들의 최적 pH는 위에서 언급했듯이 극단적인 산성이나 알칼리를 제외하고 최대한 높은 pH가 최적일 것이나. 이들을 사용하여 각종 식품이나 기타 재료로 사용하기 위해서는 활성이 크게 차이나지 않으면서 중성인 pH 가 적정 pH라고 사료되어 이후의 실험에서는 적정 pH를 7로 고정하여 실험하였다.
- 이상과 같이 효소 가수분해 시 최적의 용해도를 고려하여 처리시간과 농도 변화에 따른 용해도와 흡광도 및 평균중합도를 '측정하기' 위해서 아래와 같은 조건으로 가수분해하였다.
- 이상과 같이 효소 가수분해 시 최적의 용해도와 평균분자량을 고려하여 가수분해한 것과, 수용성 세리신 2종 및 난용성 세리신을 각종 분석과 실험에 이용하였다. 효소 가수분해는 다음과 같은 조건으로 가수분해하여 3종의 세리신을 얻었다.
- 정련 액에서 수용성 세리신을 얻고, 남은 난용성 세리신을 여러가지 효소로 가수분해하여, 효소 가수분해 특성을 알아보고, 아미노산 조성과 분자량을 조사하여 다음과같은 결론을 얻었다.
- 정련하였다. 정련 액을 한외여과막 장치(U/F & N/F system, Actra)에서 투과 분자량 크기 20, 000인 여과막을 사용하여, 1/2을농죽하여 투과된 용액과, 농축액에 처음 양과 같게 증류수를 첨가하여 1/2로 농축하는 것을 2회 반복하여 투과된용액을 합하여 수용성 저분자 수용액을 얻었다. 투과 분자량 크기 200, 000인 여과막을 사용하여 남은 농축액에 처음 양과 같게 증류수를 첨가하여 1/2로 농축하는 것을 3회 반복하여 투과된 수용성 고분자 수용액을 얻었다.
- 정련 액을 한외여과막 장치(U/F & N/F system, Actra)에서 투과 분자량 크기 20, 000인 여과막을 사용하여, 1/2을농죽하여 투과된 용액과, 농축액에 처음 양과 같게 증류수를 첨가하여 1/2로 농축하는 것을 2회 반복하여 투과된용액을 합하여 수용성 저분자 수용액을 얻었다. 투과 분자량 크기 200, 000인 여과막을 사용하여 남은 농축액에 처음 양과 같게 증류수를 첨가하여 1/2로 농축하는 것을 3회 반복하여 투과된 수용성 고분자 수용액을 얻었다. 이후 남은 농축액은 filter paper(Whatman, 5C)로 여과하였다.
대상 데이터
- 잔류물인 난용성 세리신을 수거하여 건조시킨 후 가수분해시의 시료로 사용하였다. 정련 후 얻은 수용성 세리신용액 2종류와 가수분해 후 얻어진 수용액은 동결건조하여, 이를 데시케이트(desiccator)에 보관 후 필요시에 사용하였다.
이론/모형
- 난용성 세리신을 효소 가수분해한 후 닌히드린반응(김 등, 1991)을 시켜 분광광도계로 392nm에서 흡광도를 측정하였다. 난용성 세리신 1 g을 6N HCl 로 가수분해한 후 감압건조, 수세 , 건조 후 증류수를 첨가하여 10ml로 정용하여 0.
성능/효과
- 1. 효소 가수분해 시 kojizyme과 flavourzyme의 최적 조건은 pH 7, 온도 50℃이었고, protamex와 alcalase는 처리 pH의 증가에 따라 활성이 높았고 최적온도는 60℃이었다.
- 2. 효소 가수분해 시 용해도 측정에서는 효소 처리농도 증가에 따라 용해도도 높았으며, 4시간 이상의 처리에서는 아주 소폭으로 용해도가 증가하였다.
- 3. 효소 가수분해 시 흡광도를 이용한 용해도 측정에서는 효소 처리농도 증가에 따라 흡광도도 높았으며, 4시간이상의 처리에서도 계속하여 흡광도가 증가하였다.
- 4. 효소 가수분해 시 말단기 정량에 의한 평균중합도 측정에서는 처리시간과 농도의 증가에 따라 중합도가 감소하였다.
- 처리농도가 높을수록, 처리시간이 경과할수록 용해도가 높은 것을 알수 있었다. 4시간 이상 처리했을 때에는 처리시간의 증가에 따라 용해도의 증가폭이 완만한 것으로 나타나 24시 간처리시 효소농도가 0.5%의 경우는 39.5%, 5%의 경우는 53.26%로 13%이상의 용해도 차를 보였다. 효소농도 5%, 4시간 처리의 경우는 47.
- 5. 아미노산 분석 결과 정련 후 채취한 low와 high의 아미노산 조성 이 비슷하고, PK와 PP 및 PA의 아미노산 조성 이 비슷하였으며, low와 high는 PK, PP, PA보다 세린과 타이로신의 함량이 많았고, 프롤린은 검출되지 않았다.
- 6. GPC에 의한 분자량 측정결과 중량평균분자량(Mw) 크기는 PK>high>PP>low>PA 순서이었으며, PK와 PA 의 Mw는 각각 9, 800, 905이었다.
- 분자량 10, 000 전후에 많이 분포하는 것으로 관찰되며, Mn은 4, 903, Mw는 9, 800 으로 나타났다. Mp 는 3, 950으로 Mn보다 약간 낮았으나, 세가지 측정 방법 모두에서 3, 950 이상의 분자량으로 low 와 high보다는 상당히 크다는 것을 확인할 수 있었다.
- 나타낸 것이다. kojizyme 처리와 비슷한 경향으로 효소농도가 높을수록 처리시간이 경과할수록 평균중합도는 낮게 나타났다. kojizyme과 flavourzyme의 0.
- kojizyme 처리와 비슷한 경향으로 효소농도가 높을수록 처리시간이 경과할수록 평균중합도는 낮게 나타났다. kojizyme과 flavourzyme의 0.5% 농도 4시간 처리 이전의 평균중합도는 30이상으로 나타났으며, 2%농도 이상의 경우는 1시간 처리이상에서 거의 20 이하의 평균중합도를 나타내고, 5% 농도에서는 평균중합도가 10이하로 낮게 나타났다. 이는 일정 효소 농도 이상이면 불용해물의 가용화뿐만 아니라 용해된 세리신에도 계속 작용하여 전체 분자량이 작아지는 것으로 사료되며, 24시간 처리 시 kojizyme 처리의 평균중합도는 3.
- pH 의 영향에서와 같이 protamex와 alcalase의 처리가 kojizyme 과 flavourzyme의 경우보다 용해도가 크고, 최적온도는 60℃로 나타났다. kojizyme과 flavourzyme의 경우는 최적온도가 50℃ 부근으로 나타났다.
- 나타낸 것이다. protamex 처리의 경우와 비슷한 평균 중합도 경향을 보이나, 전체적으로 용해도도 높고, 0.5% 농도의 경우 protamex 처리보다 상당히 낮은 평균 중합도를 나타내고, 다른 농도에서도 약간 더 낮거나 비슷한 평균중합도를 나타내는 것으로 보아, 사용한 효소 중 난용성 세리신에 대한 가수분해 활성이 가장 높은 것으로 사료된다.
- protamex와 alcalase의 경우도 pH 변화에 따른 흡광도가 서로 비슷한 경향으로 나타났으며, 처리 pH가 높을수록 흡광도도 높게 나타났다. pH 5~6부근을 경계로 낮은 pH에서는 protamex가, 높은 pH에서는 alcalase의 흡광도가 높게 나타났으나 큰 차이는 나타나지 않았다.
- protamex와 alcalase의 효소농도 5%, 4시간 처리시의 평균 중합도는 각각 5.74, 5.54이었고, 24시간 처리시의 평균 중합도는 5.09와 5.19로서, 4시간 처리 이후 계속 처리하여도 비슷한 경향을 나타내는 것은, 일정한 크기로 분해한 후 더 이상 세리신에 영향을 미치지 않는 것으로 사료되며, 이러한 특징은 특정 말단기와 일정한 분자량을 가진 펩타이드로 가수분해하기에 적당한 효소라고 생각된다.
- 모든 처리에서 초기 2시간까지는 흡광도 변화가 급격히 증가하며, 그 이상의 처리시간 경과에 의해서는 흡광도 증가가 완만하게 나타난 것으로 보아, 가수분해가 2시간 이전에 상당부분 나타나는 것으로 보여지며, 2시간 이후에도 어떤 식으로든 효소가 작용을 계속하여 미미하게나마 흡광도가 증가된 것으로 보인다.
- 넓은 범위에 분포되어 있다. 분자량 10, 000 전후에 많이 분포하는 것으로 관찰되며, Mn은 4, 903, Mw는 9, 800 으로 나타났다. Mp 는 3, 950으로 Mn보다 약간 낮았으나, 세가지 측정 방법 모두에서 3, 950 이상의 분자량으로 low 와 high보다는 상당히 크다는 것을 확인할 수 있었다.
- 세린만을 볼 때 수용성 세리신의 경우 IN에 비해 함유량이 평균13.9%나 더 높았고, IN을 효소 가수분해 한 것에서도 평균 3.1% 높았다. 항산화 작용과 노인성 치매에 효과가 있다는 타이로신의 경우, IN보다 수용성 세리신에서 함량이 높았으며, IN의 효소 가수분해물에서도 수용성보다는 낮았지만 함량이 높은 것을 확인할 수 있었다.
- 32로 측정되어 GPC로 측정한 것과 비슷한 중합도로 보인다. 이것을 종합해볼 때 다른 처리와는 달리 일정한 크기의 펩타이드로 가수분해되었다는 것을 시사하며, 이는 alcalase가 세리신의 일정 아미노산 결합부분만을 분해하며, 이 아미노산 결합부분이 세리신의 내부에 존재하지 않으면 더 이상 분해하지 않아 크기가 일정하고 특정 말단 기를 가지는 펩타이드를 만들게되므로, 동일한 말단기에 의한 특정한 성질을 가지는 기능성 펩타이드로서의 효과도 기대해 볼만하다고 사료된다.
- 5% 농도 4시간 처리 이전의 평균중합도는 30이상으로 나타났으며, 2%농도 이상의 경우는 1시간 처리이상에서 거의 20 이하의 평균중합도를 나타내고, 5% 농도에서는 평균중합도가 10이하로 낮게 나타났다. 이는 일정 효소 농도 이상이면 불용해물의 가용화뿐만 아니라 용해된 세리신에도 계속 작용하여 전체 분자량이 작아지는 것으로 사료되며, 24시간 처리 시 kojizyme 처리의 평균중합도는 3.69, flavourzyme 은 2.91 로 3개 전후의 아미노산을 가진 저분자 펩타이드로 가수분해 할 수 있을 것으로 기대된다.
- 이러한 여러 정황으로 미루어볼 때 생사나 고치의 세리신은 외층에서 내층으로 갈수록 용해성이 높은 친수성 아미노산인 세린과 타이로신의 함량이 낮아지고 분자량이 작은 글리신의 함량은 높고 밀도는 커져서 용해도는 떨어지고 난용성은 증가하는 것으로 사료된다.
- 이렇듯 용도에 따라 세리신의 분자량을 제어하기 위해서는 난용성 세리신을 이용하여 효소가수분해 하는 것이 적절하리라 사료되며, 수용성 세리신의 경우는 분자량이 6, 000 이하인 것을 확인할 수 있었다.
- 전체적으로 저분자로부터 6, 000 사이에 분포되어 있고 3, 000 이하의 것들이 주류를 이루며, Mn은 2, 056, Mw는 2, 396, Mp는 1, 387로 나타났다. 일반적으로 계산방식에 의해 Mn보다 Mw 가 약간씩 크게 나타나는데 본 실험에서 측정한달단기 정량법에 따른 평균분자량인 Mp 는 이들 보다도낮은 값을 갖는 것을 알게되었다.
- 전체적으로 17종 아미노산 대부분을 함유하고 있으며, 수용성 세리신인 low와 high의 경우 효소 가수분해된 것들보다 세린과 타이로신의 함량이 높고, 글리신의 양은 적었으며, 프롤린의 경우는 검출되지 않았다.
- 전체적으로 볼 때 6, 000 이상의 고분자 세리신을 얻기 위해서는, 난용성 세리신의 효소 가수분해 중 kojizyme을사용하고, 분포가 일정한 저분자 세리신을 얻고자 할 때는 alcalase 5% 농도로 처리하는 것이 적당하다고 사료된다. 이렇듯 용도에 따라 세리신의 분자량을 제어하기 위해서는 난용성 세리신을 이용하여 효소가수분해 하는 것이 적절하리라 사료되며, 수용성 세리신의 경우는 분자량이 6, 000 이하인 것을 확인할 수 있었다.
- 전체적으로 저분자로부터 6, 000 사이에 분포되어 있고 3, 000 이하의 것들이 주류를 이루며, Mn은 2, 056, Mw는 2, 396, Mp는 1, 387로 나타났다. 일반적으로 계산방식에 의해 Mn보다 Mw 가 약간씩 크게 나타나는데 본 실험에서 측정한달단기 정량법에 따른 평균분자량인 Mp 는 이들 보다도낮은 값을 갖는 것을 알게되었다.
- 전체적으로 효소농도 3%까지는 흡광도가 급격히 증가하였지만, 그 이상의 농도에서는 흡광도 증가가 완만하게 나타났다. 호소는 최적조건에서 그 활성을 소실하는데 장시간을 요한다.
- 처리농도가 높을수록, 처리시간이 경과할수록 용해도가 높은 것을 알수 있었다. 4시간 이상 처리했을 때에는 처리시간의 증가에 따라 용해도의 증가폭이 완만한 것으로 나타나 24시 간처리시 효소농도가 0.
- 1% 높았다. 항산화 작용과 노인성 치매에 효과가 있다는 타이로신의 경우, IN보다 수용성 세리신에서 함량이 높았으며, IN의 효소 가수분해물에서도 수용성보다는 낮았지만 함량이 높은 것을 확인할 수 있었다. 이러한 특성은 세린과 타이로신이 외층에 많이 포함되어 있으므로 low나 high가 IN보다 이들의 함량이 높은 것은 당연하나, 1N을 가수분해하여 얻은 세리신에서도 세런과 타이로신의 함량이 IN보다 높다는 것은 IN 자체 내에서도 위치에 따라 아미노산 함량이 다르다는 것이며, 중심부로 갈수록 세린과 타이로신의 함량은 낮고 글리 신의 함량은 높다는 것이다.
- 26%로 13%이상의 용해도 차를 보였다. 효소농도 5%, 4시간 처리의 경우는 47.57%로 5%, 24시간의 경우가 5.69% 만 더 높게 나타나, kojizyme의 경우 세리신의 용해도를 높이기 위해서는 처리시간의 지속보다는 효소의 농도를 조절하는 것이 더 적당할 것으로 사료된다.
- 나타낸 것이다. 효소농도가 높을수록 처리시간이 경과할수록 평균중합도는 낮게 나타났다. 이러한 결과는 그림 6의 용해도와 그림 10의 흡광도에서 고찰한 것과 같이, 4시간 처리 이후의 경우 용해도 증가는 미미하나 흡광도는 계속 증가하여 효소에 의해 수용성화 된 세리신에 대해서 4시간 처리 이후에도 계속 가수분해가 이루어져 평균중합도가 작아진 것으로 사료된다.
후속연구
- 이상의 실험결과를 보면 난용성 세리신을 추출하여 효소의 종류와 효소의 농도, 처리 시간 등을 적당히 조합하게 되면 다양한 분자량의 세리신을 얻을 수 있으며 이렇게 얻어진 세리신을 각각 필요한 용도에 사용하게 되면 더욱 큰 효과를 얻을 수 있을 것으로 기대된다.
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