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문제 정의
- 선행연구에서는 인체혈구암세포 U937 cell에 물질을 처리하였을 때 암세포의 증식이 억제되고 cell cycle arrest가 유도됨이 보고되었다 [10]. 따라서 본 실험에서는 AAE에 의한 세포증식억제효과가 cell cycle arrest에 의한 것인지 알아보기 위하여 Flow cytometric을 실시하였다. Hep 3B cell에 AAE를 농도별 (40, 60, 80 µg/mL)로 24시간 동안 처리하여 반응시킨 후 40 µg/mL의 propidium iodide (PI)과 200 µg/mL의 RNase A로 염색한 다음 DNA content를 측정 하였다.
- 개똥쑥은 여러 신호경로를 통하여 암세포의 증식억제와 항암효과가 있다고 보고되었다 [3,4]. 따라서 본 연구에서는 Hep3B 간암세포에 AAE (개똥쑥추출물)를 처리했을 때 cell cycle arrest에 어떠한 영향을 미치는지 알아보았다. MTT assay를 통한 세포생존율 측정에서 AAE를 농도별과 시간별로 처리했을 때 Hep3B 간암세포의 증식이 억제되었다.
- 따라서 본 연구에서는 Hep3B 간암세포에 개똥쑥 추출물 (AAE)을 처리하였을 때, 암세포 증식 억제가 cell cycle arrest에 의한 것인지를 알아보고자 하였다. 또한, AAE의 증가에 따른 Cell cycle 관련 protein의 발현 변화를 확인하였고, Checkpoint를 조절하는 상위조절인자인 p-Akt, p53 신호분자 조절의 연관성을 알아보기 위하여 LY294002와 Pifithrin-á를 각각 단독으로 처리하거나 AAE (개똥 쑥 추출물)과 병행 처리하였다.
- 따라서 Hep3B 간암세포의 증식억제가 AAE의 농도와 시간 의존적으로 일어남을 확인하였다. 또한 wound healing assay를 통하여 AAE이 세포 증식 억제에 미치는 영향을 확인하고자 하였다. Hep3B cell을 배양한 6 well plate에 scratch를 낸 후 AAE를 12시간 동안 농도별 (40, 60, 80 µg/ mL)로 처리하여 wound healing area를 측정하였다.
- 선행연구에서는 항산화 효과가 뛰어나다고 알려진 개똥쑥을 에탄올로 추출하여 인체자궁경부상피암세포 (HeLa)와 위암 세포 (AGS)에 처리하였을 때 암세포 증식 억제효과가 있음이 보고되었다 [3,4]. 본 연구에서는 Hep3B 간암세포에 AAE를 처리하였을 때 암세포의 증식억제효과를 알아보고자 하였다. AAE가 Hep3B 세포의 증식에 미치는 영향을 확인하기 위하여 AAE를 농도별 (10, 20, 40, 60, 80, 100 µg/mL)로 처리한 뒤 MTT assay를 통하여 암세포의 생존율을 측정하였다.
제안 방법
- 추출한 단백질은 ELISA-reader를 이용하여 595 nm에서 흡광도를 측정하여 정량하였다. 8%, 12% acrylamide gel를 이용하여 만들어 놓은 sample을 loading한 뒤 전기영동을 실시한 후 nitrocellulose membrane에 transfer하였고, 다음에 2% Bovine serum albumin (BSA)을 이용해 blocking한 후, 1차 항체를 4℃에서 밤새 반응시키고 TBST로 5분씩 4번 washing후 2차 항체를 결합시킨 다음 실험결과를 측정하였다.
- AAE가 Hep3B 세포의 증식에 미치는 영향을 확인하기 위하여 AAE를 농도별 (10, 20, 40, 60, 80, 100 µg/mL)로 처리한 뒤 MTT assay를 통하여 암세포의 생존율을 측정하였다.
- Cell cycle은 Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS)를 사용하여 측정하였다. Hep3B cell에 AAE를 24시간 동안 농도별 (40, 60, 80 µg/mL)로 처리한 후 PBS로 washing 하였다.
- Wound was performed after confluence, and cells were treated with concentreation of AAE 40~80 µg/mL. Cells were monitored every 12 hours for one day to evaluate the rate of migration into the scratched area.
- Hep 3B cell에 AAE를 농도별 (40, 60, 80 µg/mL)로 24시간 동안 처리하여 반응시킨 후 40 µg/mL의 propidium iodide (PI)과 200 µg/mL의 RNase A로 염색한 다음 DNA content를 측정 하였다.
- Hep3B cell에 AAE를 24시간 동안 농도별 (40, 60, 80 µg/mL)로 처리한 후 PBS로 washing 하였다.
- Hep3B cell을 배양한 6 well plate에 scratch를 낸 후 AAE를 12시간 동안 농도별 (40, 60, 80 µg/ mL)로 처리하여 wound healing area를 측정하였다.
- LY294 002, Pifithrin-α와 병행처리 시에는 inhibitor를 30분 전처리한 뒤, AAE를 처리하였다.
- LY294002, Pifithrin-α와 병행처리 시에는 inhibitor를 30분 전처리 한 뒤, AAE를 처리하였다.
- MTT solution을 처리한 media를 제거하고PBS washing후 PBS를 제거한 뒤 DMSO 150 µL씩 넣어 각 well에 생성된 formazan을 모두 녹인 다음 96 well plate에 100ìL씩 옮긴 후 ELISA microplate reader (Bio-Red model 680, Bio-Red Laboratories Inc. Tokyo, Japan)로 595 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- Trypsin- EDTA로 세포를 떼어낸 뒤 원심분리 (3000 rpm, 10분)를 통해 세포를 모으고 95% 이상의 에탄올에 고정시킨 뒤, 40 µg/mL의 propidium iodide (PI)과 200 µg/mL의 RNase A로 염색한 다음 FlowFACS Canto (Becton-Dickinson Biosciences, Drive Frankline Lages, NJ, USA)로 DNA content를 측정하였다.
- 또한, AAE의 증가에 따른 Cell cycle 관련 protein의 발현 변화를 확인하였고, Checkpoint를 조절하는 상위조절인자인 p-Akt, p53 신호분자 조절의 연관성을 알아보기 위하여 LY294002와 Pifithrin-á를 각각 단독으로 처리하거나 AAE (개똥 쑥 추출물)과 병행 처리하였다.
- LY294 002, Pifithrin-α와 병행처리 시에는 inhibitor를 30분 전처리한 뒤, AAE를 처리하였다. 물질처리 후 12~24시간 동안 wound healing이 된 정도를 현미경으로 사진을 찍어 관찰하였다.
- 현미경으로 관찰하고 배양액 교체 후 AAE를 40, 60, 80 µg/mL 농도별로 처리하였다.
대상 데이터
- Hep3B 세포는 American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA)에서 분양 받았으며, 10% FBS (Hyclone, Laboratoris Inc., Logan, UT, USA)와 1% antibiotics가 포함된 DMEM media (Hyclone, Laboratris Inc., Logan, UT, USA)를 사용하여 5% CO2, 37℃ 조건 하에 배양하였다. 매 48시간마다 Trypsin-EDTA (Hyclcone, Laboratories Inc.
- LY294002와 Pifithrin-α는 Calbiochem (Calbiochem, SD, CA, USA)에서 구입하여 20 mM으로 만들어 사용하였다.
- 실험에 사용된 개똥 쑥은 대전한약재시장에서 구입하였고, 개똥 쑥 100 g에 에탄올 800 mL을 가하여 72시간 동안 상온 에서 환류시키며 추출하였다. 이러한 방법으로 추출된 개똥쑥 추출물을 감압농축기를 이용하여 감압농축 시킨 뒤, 농축된 추출물은 -86℃에서 보관하였다.
데이터처리
- (A) cells were treated with 10~100 µg/mL of AAE 12 h and 24 h. The statistical analysis of the data was carried out by use of an ANOVA-test. a-cp<0.
- Tokyo, Japan)로 595 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정은 각 농도별로 세 번 시행하였으며, 이에 따른 평균값과 표준오차는 Microsoft Excel program을 사용하여 분석하였다.
이론/모형
- Cell cycle arrest effect of AAE in Hep3B liver cancer cell. Cell viability was measuresd by MTT assay. He3pB cells were treated with concentrations of AAE 10~100 µg/mL.
- (A) Cells were pre-treated with 20 µM LY294002 or 20 µM Pifithrin-α for 30 min and then co-treated with 60 µg/mL AAE for 12 h and 24 h. Cells viability was measured by MTT assay. The statistical analysis of the data was carried out by use of an ANOVA-test.
- Hep3B 간암세포에서 Akt 와 p53을 저해하였을 때 Hep3B 간암세포의 증식과 사멸에 미치는 영향을 알아보기 위하여 Akt 저해제인 LY294002와 p53 저해제인 Pifithrin-α를 AAE와 병행 또는 각각 단독으로 처리하였을 때 MTT assay와 Wound healing 및 cell cycle FACS와 Western blotting을 하였다.
- 이러한 결과를 토대로 AAE에 의한 cell cycle arrest가 Akt의존적으로 진행됨을 알 수 있었다. 동일한 조건에서 AAE가 p-Cdk2(T14,Y15), Cyclin E, p21 신호분자 조절에 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위해 Western blotting을 실시하였다. 그 결과, Fig.
- 선행 연구에 의하면 Mdm2의 활성이 저해 될수록 p53과 p21의 발현이 증가하는 것을 확인하였고, 그로 인해 cell cycle arrest가 일어난다는 것을 확인하였다 [12]. 본 실험에서는 Hep3B 세포에 AAE를 농도별로 처리하여 cell cycle 신호 단백질들의 양상을 알아보기 위하여 Western blotting을 실시하였다. 그 결과 Fig.
성능/효과
- 그 결과 Fig. 4(a)에 나타난 바와 같이 LY294002 단독처리군에서는 세포 증식이 억제되었고, AAE 병행처리군은 LY294002단독처리군보다 더욱 억제되는 것을 확인하였다. 반면에 Pifithrin-α 단독처리군은 control군에 비해 증가하였고, AAE병행처리군은 Pifithrin-α 단독처리군 보다 증식이 억제됨을 확인하였다.
- 또한 Fig. 4(b)에 나타난 바와 같이wound healing assay의 결과 LY294002 단독처리군에서는 wound healing area이 control군에 비해 억제되었고, AAE 병행처리군은 LY 294002단독처리군보다 더욱 억제되는 것을 확인하였다. 반면에 Pifithrin-α 처리군은 control군과 wound healing area이 비슷하게 증가하였으며 AAE병행처리군은 Pifithrin-α단독처리군보다 wound healing area이 억제되었음을 확인하였다.
- 그 결과 Fig. 1(b)에서와 같이 control 군보다 물질처리군에서 시간이 지날수록 wound healing area이 감소함을 확인하였다. 따라서 본 실험에서 수행한 연구 결과를 통하여 AAE가 Hep3B 간암세포의 세포증식을 억제하고 있음을 확인하였다.
- 이와 같은 조건으로 FACS와 Western blotting을 실시한 결과 Fig. 4(c) FACS에서는 LY294002 단독처리군에서는 G1 값이 55.25% AAE병행처리군은 58.83%로 AAE에 의해 더욱 증가하였고, S값은 LY294002 단독처리군에서는 22.87% AAE 병행처리군은 15.03%, G2값은 LY29400 단독처리군에서는 22.58% AAE 병행처리군은 21.33%로 감소하였다. 반면에 Pifithrin-α 단독처리군의 G1 값이 51.
- (d)에서 보이는 바와 같이 LY294002와 AAE를 병행처리시 Cyclin E의 발현은 LY294002단독처리군보다 현저히 감소하였고, Pifithrin-α 와 AAE병행처리했을 때 AAE에 의해 감소하였지만 Pifithrin-α의 영향으로 AAE 단독처리군과 비교하여 발현양이 증가한 것으로 보인다.
- 따라서 본 연구에서는 Hep3B 간암세포에 AAE (개똥쑥추출물)를 처리했을 때 cell cycle arrest에 어떠한 영향을 미치는지 알아보았다. MTT assay를 통한 세포생존율 측정에서 AAE를 농도별과 시간별로 처리했을 때 Hep3B 간암세포의 증식이 억제되었다. Wound healing assay를 통한 이동성 실험에서 AAE가 농도와 시간에 의존적으로 세포 이동성이 감소됨을 확인하였다.
- MTT assay를 통한 세포생존율 측정에서 AAE를 농도별과 시간별로 처리했을 때 Hep3B 간암세포의 증식이 억제되었다. Wound healing assay를 통한 이동성 실험에서 AAE가 농도와 시간에 의존적으로 세포 이동성이 감소됨을 확인하였다. 이러한 세포증식억제와 이동성억제가 cell cycle에 의한 것인지를 알아보기 위해 Flow cytometric를 실시한 결과 AAE 농도 의존적으로 G1 cell cycle arrest가 일어남을 확인하였다.
- 결론적으로, 본 연구를 통하여 AAE가 Hep3B 간암세포의 cell cycle arrest에 의한 증식억제하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 G1 cell cycle arrest는 AAE가 Akt 신호분자를 경유하여 일어나는 것으로 보인다.
- 본 실험에서는 Hep3B 세포에 AAE를 농도별로 처리하여 cell cycle 신호 단백질들의 양상을 알아보기 위하여 Western blotting을 실시하였다. 그 결과 Fig. 3에서 나타난 것과 같이 AAE를 농도별로 처리하였을 때 아무것도 처리하지 않은 대조군에 비하여 AAE의 농도가 증가함에 따라 p-Akt의 활성은 감소하고, p53의 발현은 증가하는 것을 확인하였다. 인산화된 Akt는 Mdm2를 인산화하여 p53을 낮은 수준으로 발현되게 함으로써 Cell cycle을 진행하는 것으로 보고되었다 [15].
- 그 결과, Fig. 2에서 나타난 것과 같이 G1 값이 40 µg/ mL에서 54.42%, 60 µg/mL에서 57.2%, 80 µg/mL에서 61.06%로 농도 의존적으로 증가하고 반면에, S 값이 40 µg/mL에서 22.72%, 60 µg/mL에서 21.04%, 80 µg/mL에서 16.67%와 G2 값이 40 µg/mL에서 23.96%, 60 µg/mL에서 21.83%, 80 µg/ mL에서 13.45%로 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인하였다.
- 1(a)에 따르면 AAE의 농도가 높아질수록 Hep 3B 간암세포의 증식이 억제되는 것을 확인하였으며, 12시간 보다 24시간에서 증식이 더 많이 억제되고 있다는 것을 확인 하였다. 따라서 Hep3B 간암세포의 증식억제가 AAE의 농도와 시간 의존적으로 일어남을 확인하였다. 또한 wound healing assay를 통하여 AAE이 세포 증식 억제에 미치는 영향을 확인하고자 하였다.
- 1(b)에서와 같이 control 군보다 물질처리군에서 시간이 지날수록 wound healing area이 감소함을 확인하였다. 따라서 본 실험에서 수행한 연구 결과를 통하여 AAE가 Hep3B 간암세포의 세포증식을 억제하고 있음을 확인하였다.
- 한편 LY294002를 단독으로 처리했을 때와 AAE 병행처리했을 때 p-Cdk2(T14,Y15), p21의 발현이 증가하였으며 Pifithrin-α를 단독으로 처리했을 때와 AAE 병행처했을 때 p-Cdk2(T14,Y15), p21의 발현이 감소함을 확인 하였다. 따라서 본 연구를 통하여 AAE가 Hep3B 간암세포의 cell cycle arrest효과가 Akt의존적으로 일어나는 것임을 확인하였다.
- 또한 Cyclin E의 subunit인 phosphoform CDK2는 증가함을 확인하였다. CDK2는 Threonine14과 Tyrosine15에 인산기가 붙게 되는데 인산기가 떨어져 나가면서 cell cycle 진행이 이루어지기 때문에 Phosphoform CDK2는 Inactive한 형태임을 확인하였다.
- 또한, Pifithrin-α는 p53의 발현을 억제하는 것이 아니기 때문에 Pifithrin-α 단독 처리시 세포증식억제에 영향을 미치치 않음을 알 수 있었다.
- 이러한 세포증식억제와 이동성억제가 cell cycle에 의한 것인지를 알아보기 위해 Flow cytometric를 실시한 결과 AAE 농도 의존적으로 G1 cell cycle arrest가 일어남을 확인하였다. 또한, cell cycle 신호 단백질들의 양상을 알아보기 위하여 Western blotting을 실시한 결과 cell cycle을 진행하는 단백질인 p-Akt 와 p-Mdm2, cyclin E의 발현은 감소하였고, cell cycle arrest를 유도하는 단백질인 p53, p-Cdk2(T14,Y15), p21의 발현은 증가함을 확인하였다. 한편 LY294002를 단독으로 처리했을 때와 AAE 병행처리했을 때 p-Cdk2(T14,Y15), p21의 발현이 증가하였으며 Pifithrin-α를 단독으로 처리했을 때와 AAE 병행처했을 때 p-Cdk2(T14,Y15), p21의 발현이 감소함을 확인 하였다.
- 반면에 Pifithrin-α 단독처리군은 control군에 비해 증가하였고, AAE병행처리군은 Pifithrin-α 단독처리군 보다 증식이 억제됨을 확인하였다.
- 반면에 Pifithrin-α 단독처리군의 G1 값이 51.6% AAE병행처리군은 52.16%로 AAE에 의해 더욱 증가하였고, G2값은 Pifithrin-α 단독처리군에서는 24.52% AAE를 병행처리군은 16.43%로 감소하였다.
- 반면에 Pifithrin-α 처리군은 control군과 wound healing area이 비슷하게 증가하였으며 AAE병행처리군은 Pifithrin-α단독처리군보다 wound healing area이 억제되었음을 확인하였다.
- 또한 Akt pathway는 cell cycle protein의 활성을 조절함으로써 G1에서 S기로의 cycle을 진행시킨다 [16,17]. 선행연구에서 cell cycle에 관여 하는 Akt와 Mdm2의 활성이 p53과 Cdk2, Cyclin E 그리고 p21의 활성을 감소하는 것을 확인하였고 [18,19], 본 실험에서 수행한 연구결과를 통하여 AAE가 Hep3B 간암세포에서 cell cycle에 관여하는 p-Akt와 p-Mdm2 신호분자의 활성을 감소시키고 p53과 CDK2, Cyclin E 억제제인 p21의 발현양이 증가하면서 Cyclin E의 발현양은 감소하는 것을 확인하였다.
- p-Cdk2(T14,Y15), p21은 LY294002와 AAE를 병행처리했을 때 LY294002 단독처리군과 비교하여 발현양이 증가하였고 Pifithrin-α와 AAE병행처리했을 때 AAE에 의해 증가하였지만 Pifithrin-α의 영향으로 AAE 단독처리군과 비교하여 발현양이 감소한 것으로 보인다. 이러한 결과로 보아 AAE에 의한 p-Cdk2(T14,Y15), Cyclin E, p21 신호분자의 조절은 Akt의존적인 경로를 통해 일어남을 확인 하였다. 한편 Pifithrin-α를 단독으로 처리했을 때 p-Cdk2(T 14,Y15), p21의 발현이 감소하였으며, Cyclin E는 증가하였다.
- 이와 같이 Akt를 저해했을 때 AAE에 의한 G1 cell cycle arrest효과가 더욱 강하게 나타나며 Akt가 세포증식에 중요인자임을 나타낸다. 이러한 결과를 토대로 AAE에 의한 cell cycle arrest가 Akt의존적으로 진행됨을 알 수 있었다. 동일한 조건에서 AAE가 p-Cdk2(T14,Y15), Cyclin E, p21 신호분자 조절에 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위해 Western blotting을 실시하였다.
- 반면에 Pifithrin-α 처리군은 control군과 wound healing area이 비슷하게 증가하였으며 AAE병행처리군은 Pifithrin-α단독처리군보다 wound healing area이 억제되었음을 확인하였다. 이러한 결과를 토대로 Akt가 암세포의 증식에 있어서 중요한 역할을 하며, Akt의 작용이 억제되었을 시 세포증식과 관련된 인자들이 억제됨을 알 수 있었다. 또한, Pifithrin-α는 p53의 발현을 억제하는 것이 아니기 때문에 Pifithrin-α 단독 처리시 세포증식억제에 영향을 미치치 않음을 알 수 있었다.
- Wound healing assay를 통한 이동성 실험에서 AAE가 농도와 시간에 의존적으로 세포 이동성이 감소됨을 확인하였다. 이러한 세포증식억제와 이동성억제가 cell cycle에 의한 것인지를 알아보기 위해 Flow cytometric를 실시한 결과 AAE 농도 의존적으로 G1 cell cycle arrest가 일어남을 확인하였다. 또한, cell cycle 신호 단백질들의 양상을 알아보기 위하여 Western blotting을 실시한 결과 cell cycle을 진행하는 단백질인 p-Akt 와 p-Mdm2, cyclin E의 발현은 감소하였고, cell cycle arrest를 유도하는 단백질인 p53, p-Cdk2(T14,Y15), p21의 발현은 증가함을 확인하였다.
- 45%로 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인하였다. 이러한 실험 결과를 통하여 AAE가 Hep3B 세포의 G1 checkpoint arrest를 유도함을 확인하였다.
- 한편 LY294002를 단독으로 처리했을 때와 AAE 병행처리했을 때 p-Cdk2(T14,Y15), p21의 발현이 증가하였으며 Pifithrin-α를 단독으로 처리했을 때와 AAE 병행처했을 때 p-Cdk2(T14,Y15), p21의 발현이 감소함을 확인 하였다.
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