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문제 정의
- 랫드를 이용한 동물시험에서(Lee 등, 2015) 호로파와 야관문 추출복합물이 테스토스테론의 양을 증가시키는 효능이 있는 것으로 나타난 바, 본 연구에서는 이러한 테스토스테론의 증가에 관여하는 효소(3β-HSD4, 17,20-desmorase) 및 감소에 관여하는 효소(aromatase, 5α-Reductase2)의 발현에 실제로 호로파와 야관문 추출혼합물이 어떠한 영향을 주는 지를 확인하고자 하였다.
- 그 결과 테스토스테론의 양도 점차 감소하여 남성갱년기의 증상이 나타나게 된다. 본 연구에서는 TM3 세포에 과산화수소를 처리함으로써 (Noh 등, 2012) 남성에서 나타나는 남성갱년기(andropause) 현상을 유사하게 만들어 이의 개선 가능성을 보고자 하였다. 남성갱년기에 대한 모델연구에서 남성갱년기의 원인으로 산화적 스트레스를 주요 원인중의 하나로 보고되고 있으며, 이러한 연구에서 in vitro의 경우 과산화수소를 이용한 산화적 스트레스모델이 많이 사용되고 왔다.
- 본 연구에서는 테스토스테론과 androstenedione를 estradiol로 분해하는 aromatase와 testosterone을 dihydrotestosterone (DHT)로 전환시키는 5α-reductase2의 발현을 조사하였다.
- 산화적 스트레스가 가해진 TM3 세포생존에 시료가 미치는 영향을 측정하고자, TM3 세포에 과산화수소를 처리하였다. 과산화수소의 처리 농도는 별도의 농도 설정시험을 통해 50 μM 로 설정하였다(data not shown).
제안 방법
- CCK-8 (Dojindo, Kamimashiki-gun, Kumamoto, Japan) 10 μL을 첨가 하고 37°C CO2 배양기에서 1시간 추가 배양한 후, ELISA leader (PowerWave XS, BioTek, Winooski, VT, USA)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하여 용매대조군 대비 세포생 존률을 구하여 시험에 사용할 농도를 결정하였다.
- Leydig 세포인 TM3에서 호로파 및 야관문 추출물 처리 시 테스토스테론 양을 얼마나 증가시킬 수 있는지를 확인하고, 최대한의 테스토스테론 증가를 얻기 위한 상기 두 추출물의 혼합 비율을 5:5, 8:2 그리고 2:8로 다양하게 혼합하여 시험을 실시하였다(Fig. 1). 시험에 사용한 각 시료들의 농도는 20 μg/mL로 통일하여 수행하였다.
- TM3 세포에 50 μM 과산화수소를 4시간 처리한 후, 시료를 농도 별로 넣어준 배지로 교환하여 20시간 추가 배양하여 세포생존률을 측정하였다.
- Total RNA 2 μg을 RevoScriptTM Reverse Transcriptase premix kit (iNtRON Biotechnology)를이용하여 총 부피 20 μL로 반응하여 cDNA로 합성하고, SYBG Green supermix (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) 5 μL, cDNA 1 μL, 각각의 프라이머(10 pmol/μL) 1 μL 그리고 2 μL 멸균증류수를 섞어 Chromo 4TM Real-Time Detector (Bio-rad)로 다음 조건으로 real time PCR을 수행하였다: 초기 변성은 95°C 에서 30초, Annealing & Extension은 60°C에서 30초 씩 40회 반복시켰다.
- YHM이 TM3 세포에 미치는 독성을 평가하기 위하여 각 시료를 농도별로 처리한 후 용매대조군(vehicle) 대비 세포의 생존률을 구하였다. YHM의 경우 20 μg/mL에서는 독성을 보이지 않았으며, 40 μg/mL을 처리하였을 때 용매대조군 대비 88.
- 4시간후 YHM이 농도별로 포함된 배양배지로 교환하여 20시간 배양하였다. easy-BLUETM (iNtRON Biotechnology, Seongnam, Korea)를 이용해 RNA를 추출하여 spectrophotometer (UV-2450, SHIMADZU, Nakagyo-ku, Kyoto, Japan)로 흡광도를 측정하여 정량하여 사용하였다. 측정에 사용된 유전자 및 primer 는 Table 1에 표시하였다.
- 산화적 스트레스로 인해 감소된 테스토스테론 분비가 YHM 처리 시 다시 정상상태로 회복되는 결과(Fig. 3)에 관여하는 효소를 확인하기 위해, 테스토스테론 합성에 관여하는 유전자들의 발현을 real-time PCR로 확인하였다. Pregenenolone과 androstenediol을 progesterone과 테스토스테론으로 변환시키는 3β-HSD4는 과산화수소를 처리하였을 때 control에 비해 46 %가 감소하였다.
- 산화적 스트레스를 받은 TM3 세포에서 감소된 테스토스테론의 양을 YHM이 다시 회복시킬 수 있는 가능성의 하나로, 테스토스테론을 다른 물질로 전환시켜 테스토스테론의 양을 감소시키는 효소에 대한 영향을 분석하였다. 본 연구에서는 테스토스테론과 androstenedione를 estradiol로 분해하는 aromatase와 testosterone을 dihydrotestosterone (DHT)로 전환시키는 5α-reductase2의 발현을 조사하였다.
- 세포를 분주하고 24시간 후, 50 μM 과산화수소(SigmaAldrich, St. Louis, MO, USA)를 첨가한 serum free 배지에서 4시간 배양하는 방법으로 세포에 산화적 스트레스를 유발시키고, 이후 시료가 농도 별로 포함된 배양배지에서 추가로 20시간 배양한 뒤 세포 및 배지를 수거하여 사용하였다.
- 호로파 추출물은 호로파 종자를 70 % 에탄올로 60~80°C에서 3시간 동안 추출한 후 여과시켜 농축한 다음, 95°C에서 1시간 동안 살균 후 분무건조기를 사용하여 분말로 제조하였다. 야관문 추출물은 잎과 줄기를 사용하였으며 추출방법은 호로파 추출물과 동일하게 실시하였다. 시험에 사용한 호로파 및 야관문 추출혼합물 중 호로파와 야관문 추출분말이 8:2로 혼합한 것을 YHM이라 명명하였다.
- 테스토스테론은 Enzo Life Sciences의 ELISA kit (Farmingdale, NY, USA)를 aromatase와 5α-reductase2의 농도는 EIAab Science의 kit (Wuhan, China)를 사용하여 측정하였다.
- 호로파 추출물 및 야관문 추출물의 최적의 혼합비율을 결정하기 위해 96well에 7.5×103 cells/0.1 mL/well이 되도록 세포를 분주하고 24시간 후 추출물 및 여러 가지 비율로 혼합한 추출 물이 포함된 배지로 교환하여 24시간 배양하고 배양배지를 수거하여 테스토스테론 농도를 측정하였다.
- 호로파 추출물은 호로파 종자를 70 % 에탄올로 60~80°C에서 3시간 동안 추출한 후 여과시켜 농축한 다음, 95°C에서 1시간 동안 살균 후 분무건조기를 사용하여 분말로 제조하였다.
대상 데이터
- Mus musculus (mouse)의 Leydig cell인 TM3 cell은 한국세포 주은행(Seoul, Korea)에서 구입하였다. 10 % fetal bovine serum 및 antibiotics (Gibco BRL, Life Technologies Co., New York, NY, USA)가 포함된 DMEM 배지(Gibco BRL, Life Technologies Co.)에 3일에 한번씩 계대배양 하였다. 세포는 5 % CO2 가 유지되는 37°C 배양기에서 배양하면서 사용하 였다.
- Mus musculus (mouse)의 Leydig cell인 TM3 cell은 한국세포 주은행(Seoul, Korea)에서 구입하였다. 10 % fetal bovine serum 및 antibiotics (Gibco BRL, Life Technologies Co.
- 세포는 5 % CO2 가 유지되는 37°C 배양기에서 배양하면서 사용하 였다.
- 야관문 추출물은 잎과 줄기를 사용하였으며 추출방법은 호로파 추출물과 동일하게 실시하였다. 시험에 사용한 호로파 및 야관문 추출혼합물 중 호로파와 야관문 추출분말이 8:2로 혼합한 것을 YHM이라 명명하였다.
데이터처리
- One-way analysis of variation (ANOVA) 를 실시하여 유의성이 관찰되면 대조군과 유의차가 있는 시험 군을 확인하기 위해 Dunnett’s t-test를 실시하였다(유의수준 양측 5 %).
- 모든 자료들은 평균과 표준편차로 나타내었으며 SPSS 프로그램(ver. 21.0, SPSS INC., Chicago, IL, USA)을 이용하여 통계해석을 실시하였다. One-way analysis of variation (ANOVA) 를 실시하여 유의성이 관찰되면 대조군과 유의차가 있는 시험 군을 확인하기 위해 Dunnett’s t-test를 실시하였다(유의수준 양측 5 %).
이론/모형
- 모든 반응은 housekeeping 유전자인 β-actin으로 보정하고 과산화수소를 처리하지 않은 control을 기준으로 보정하 였다. 보정은 Vandesompele 등(2002)의 방법으로 계산하였다.
성능/효과
- YHM 10 μg/mL을 추가로 처리하면 테스토스테론의 양은 30.0±2.1 pg/mL으로 과산화수소만 처리한 군과 차이가 없었으나, YHM을 20, 40 μg/mL으로 농도를 높여 처리하면 46.69±3.6, 51.85±2.5 pg/mL으로 높아져 control 세포에서의 양과 비슷하거나 증가되는 것으로 나타났다(Fig. 3).
- aromatase 유전자의 발현은 과산화수소를 처리하였을 때 control 보다 2.8배 증가되는데, YHM을 10, 20, 40 μg/mL을 처리하면 과산화수소만 처리하였을 때보다 76.5, 77.1, 79.0 % 감소하였다.
- 과산화수소를 처리하지 않은 군에 비해 과산화수소만 4시간 처리한 군은 77.4±5.6 %의 세포생존률을 보였으며, 여기에 YHM 10, 20, 40 μg/mL을 추가로 처리하였을 때에도 과산화수소만 처리한 군과 비교했을 때 유사한 세포생존률을 보였다(Fig. 2B).
- 2B). 따라서 YHM은 산화적 스트레스를 받은 TM3 세포의 증식에는 별다른 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다.
- 또한 17-OH progesterone를 dehydroepiandrosterone (DHEA)과 androstenediol로 변환시키는 17,20-desmorase의 경우 과산화수소를 처리하였을 때 control에 비해 30 % 감소하였는데, YHM을 20 μg/mL 처리하면 control 수준으로 회복되고 40 μg/mL을 처리하면 control에 비해 1.7배까지 증가하였다(Fig. 4B).
- 또한 5α-Reductase2 효소의 양은 과산화수소를 처리하였을 때 352.9±24.4 pg/mL로 control의 129.0±17.5 pg/mL에 비해 2.7배로 증가하였고, YHM을 10, 20, 40 μg/mL 처리하였을 때는 각각 280.0±43.7, 207.9±46.6, 60.4 ±21.0 pg/mL로 농도 의존적으로 감소하였으며, 특히 40 μg/mL 처리하였을 때는 control 보다 약 50 % 감소한 것으로 나타났다(Fig. 5D).
- 이러한 결과는 Fig. 3에서 본 것처럼 스트레스에 의해 발현이 감소된 테스토스테론 합성관련 유전자를 YHM이 원상태로 회복시킬 뿐만 아니라, YHM은 스트레스에 의해 발현이 증가된 테스토스테론 전환관련 유전자를 원상태로 다시 감소시키는 작용을 하여 양적으로 이상이 생긴 테스토스테론의 양을 원상 태로 되돌리는 탁월한 역할을 해주는 것으로 보인다.
- 3). 이러한 결과는 TM3 세포에서 산화적 스트레스에 의해 감소된 테스토스테론을 YHM이 정상으로 회복시킬 수 있음을 보여주는 것인데, 이러한 결과는 남성갱년기 모델 세포에서 YHM이 저하된 테스토스테론 양의 회복 개선에 효과가 있음을 시사한다고 볼 수있다.
- 테스토스테론을 DHT로 전환시키는 5α-Reductase2의 경우, 과산화수소에 의해 mRNA의 발현이 control에 비해 2.7배 증가한 반면 YHM을 10, 20, 40 μg/mL 처리하였을 때는 과산화수소만 처리하였을 때보다 각각 46.2, 60.6 그리고 68.9 % 감소하였으며, 20, 40 μg/mL 처리 시의 값은 control 수준으로 회복되는 것으로 나타났다(Fig. 5B).
- 시험에 사용한 각 시료들의 농도는 20 μg/mL로 통일하여 수행하였다. 호로파 또는 야관문 추출물 각각을 단독으로 처리했을 때와, 호로파와 야관문 추출물을 비율별로 혼합하여 처리한 결과를 비교하였을 때, 호로파와 야관문 추출물을 단독으로 처리한 경우보다, 호로파와 야관문 추출물의 혼합비율이 8:2인 경우 테스토스테론 양이 가장 많이 증가되는 것으로 나타났다. 따라서 본 실험에서는 이러한 8:2 혼합물을 YHM이라 명하고 실험에 사용하였다.
후속연구
- 상기의 논문에서는 YHM에 의한 혈중 테스토스테론 증가의 원인으로 호로파에 다량 함유되어있는 것으로 알려진 생리활성 성분인 diosgenin이 체내에서 DHEA로 전환되어 테스토스테론의 전구체로 작용할 수 있다는 보고(Murakami 등, 2000; Taylor 등, 2000; Sato와 Fujita 2014)에 기인한다고 추정하였으나, 본 연구의 결과에 의하면 YHM이 테스토스테론의 합성과 전환에 관여하는 유전자의 발현을 조절하는 요인으로 보인다. 이 결과는 YHM 투여가 생체 내에서도 감소된 테스토스테론의 분비를 다시 회복시킬 수 있음을 시사함으로써, 테스토스테론 감소로 인해 야기되는 남성갱년기의 증상 완화에 도움이 될 수 있을 것으로 판단된다.
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