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문제 정의
- 느타리버섯의 상업적 대량재배에서 가장 문제가 되는 것은 세균성갈반병의 발생이고, 본 연구는 박테리오파지를 이용하여 친환경적으로 갈반병 세균을 제어할 수 있는 방안을 강구하는 일환으로 수행되었다. 세균성갈반병은 P.
- 본 연구에서는 느타리버섯 재배 시 큰 피해를 유발하는 세균성갈반병의 방제를 위하여, 사용이 금지된 농약이나 항생제 대신에 숙주균에 특이적이며 사멸효과가 큰 박테리오파지를 이용하여 친환경적인 파지테라피 방법을 개발하고자 하였다. 갈반병 등을 유발한 균주들을 재배농가에서 분리하여 16S rRNA 유전자 분석을 통하여 동정하였고, 이들 중 병원균인 Pseudomonas tolaasii에 속하는 균주 총 23종을 동정하였으며, 이들을 P1그룹으로 명명하였다.
- tolaasii는 tolaasin을 분비하여 세포독성을 나타내는데, tolaasin은 느타리버섯의 세포막에 pore를 형성하여 버섯조직을 파괴하는 펩티드독소이다. 세포독성의 측정은 본래의 숙주균과 파지저항성 균주의 세포독성과 병원성 변화여부를 확인하기 위하여 실시하였다. 파지저항성 균주의 세포독성 측정은 쥐의 적혈구를 이용한 용혈활성 검정(hemolysis test)과 양송이버섯을 이용한 버섯함몰 검정법(pitting test)으로 이루어졌다.
제안 방법
- 또한, 이들을 다시 phylogenetic tree 분석을 통하여 크게 3종류로 분류하여 P1α, P1β, P1γ로 명명하였다(Yun 등, 2013). 갈반병이 발생한 농가에서 수집한 병원성 균주를 숙주균으로 이용하여 특이적인 박테리오파지를 분리하였고, 파지의 숙주균 사멸활성은 숙주균의 배지에 파지를 감염시켰을 때, 파지의 감염으로 숙주균이 사멸되어 나타나는 투명한 용균반(plaque)의 형성으로 확인하였다. 파지의 숙주균에 대한 독성에 따라 12시간 이상 배양하였을 때, 파지에 의한 용균반 형성과 용균반의 크기나 투명도가 다르게 나타났다(Kim 등, 2011).
- 이렇게 얻어진 파지저항성 균주는 동일한 파지에 의해 사멸되지 않았다. 그러므로 파지에 대한 저항성 획득 과정 중 균주의 특성에 어떠한 변화가 있었는지 확인하기 위하여 생화학적 대사의 변화, 세포독성을 평가하는 용혈활성과 갈반형성능의 변화를 측정하였다. 파지저항성을 획득한 균주들은 유전적인 특성이 같은 P1α 균주임에도 불구하고 각각 다른 변화가 관찰되어 생화학적 대사특성과 파지 저항성 사이에는 일정한 상관성이 없다는 결론을 얻었다.
- 본 연구에서는 갈반병이 발생한 느타리버섯 재배농가에서 병원성 균주들을 분리동정하여 분류하였고(Yun 등, 2013; Mu 등, 2015), 이들을 억제하는 독성파지를 재배사 인근이나 농가 인근의 하수에서 분리하였다. 분리한 파지는 파지테라피에 사용하기 위하여 숙주균에 대한 민감도를 조사하였고, 숙주균의 사멸효과가 높은 파지혼합액을 구성할 파지 종류를 선정하였다.
- 분리한 저항성균주의 특성을 조사하기 위하여 API kit(Biomérieux, Paris, France)를 이용하여 생화학적 대사특성을 측정하였다.
- 본 연구에서는 갈반병이 발생한 느타리버섯 재배농가에서 병원성 균주들을 분리동정하여 분류하였고(Yun 등, 2013; Mu 등, 2015), 이들을 억제하는 독성파지를 재배사 인근이나 농가 인근의 하수에서 분리하였다. 분리한 파지는 파지테라피에 사용하기 위하여 숙주균에 대한 민감도를 조사하였고, 숙주균의 사멸효과가 높은 파지혼합액을 구성할 파지 종류를 선정하였다. 파지는 갈반병 균주에 매우 특이적으로 작용하였고 살균효과가 뛰어나 파지테라피를 위한 유용한 균주로 확인되었다.
- 병원성 숙주균에 대한 파지의 독성실험 중 2일 이상 배양하는 경우 시간의 경과에 따라서 투명했던 용균반 내부에 자주 세균의 성장이 관측되었으며, 새로이 나타난 세균은 용균반을 만든 파지에 감염되지 않거나 파지의 감염에 둔감한 파지-저항성 균주인 것으로 확인하였다. 용균반 관측실험은 숙주균과 파지를 제외하고 무균 조건에서 수행되었기에 새로이 용균반 내에서 나타난 균주는 원래의 숙주균이 파지에 대하여 저항성을 획득함으로써 나타난 것으로 추정하고, 이 균주들을 분리하여 특성을 조사하였다. 균주의 분리는 고체배지의 상부에 반고체배지를 만들고 파지를 접종하여 용균반을 생성시킨 후, 용균반 내부에서 성장하는 세균의 콜로니를 분리하여 얻었다(Fig.
- 병원성균주의 용혈활성은 균주가 분비하는 펩티드 독소의 세포독성에 의해 나타나는데, 이것은 독소와 적혈구 세포막 사이의 결합친화도(binding affinity)와 균주의 생육에 시기에 따른 독소의 분비량에 의해서도 차이가 난다. 용혈활성의 측정은 쥐의 적혈구를 독소와 배양하며 배양시간에 따른 세포의 파괴를 측정하여 이루어졌다(Fig. 3). P.
- 저항성 균주가 원래의 숙주균으로부터 유래된 것을 확인하기 위하여 16S rRNA 유전자 염기서열을 분석하고, 원래의 숙주균의 염기서열과 비교하였다. 각각의 숙주균으로부터 얻은 저항성균의 유전자 염기서열은 정확하게 숙주균의 유전자와 일치하였으며, 계통수 분석에서 같은 균주로 확인되었다(Fig.
- 버섯을 넣은 후에는 밀봉하여 수분증발을 방지하였다. 최종적인 평가는 점적부위의 변색과 함몰을 관찰하여 이루어졌다.
- 분리한 저항성균주의 특성을 조사하기 위하여 API kit(Biomérieux, Paris, France)를 이용하여 생화학적 대사특성을 측정하였다. 측정방법은 제조사의 지침을 따랐으며, 간략히 저항성 균주의 콜로니를 분리하여 현탁하고, NO3부터 PNPG까지 8개의 큐플의 아랫부분에 주입하였다. 이 중 GLU, ADH, URE는 무기오일을 첨가하여 혐기성 조건으로 만들어줬다.
- 1). 파지 저항성을 획득한 P. tolaasii 6264 균주는 원래의 숙주균과 구별하기 위하여 P. tolaasii 6264R로 명명하였으며, 마찬가지로 파지저항성을 획득한 P. tolaasii HK2는 P. tolaasii HK2R로 나타내, 파지 저항성 균주의 변종번호에 R을 가하여 변종을 구별하였다.
- 파지저항성 균주의 세포독성 변화 여부를 측정하기 위하여 병원성 균주의 갈반형성 측정법인 버섯조직함몰검정법으로 독성변화를 확인하였다. 이 검정법은 실제 갈반병이 발생하는 버섯조직에 균주의 독소를 처리하여 병원성을 측정하는 방법으로, 버섯 조직의 파괴정도를 측정할 수 있다.
- 파지저항성 획득으로 인한 균주의 대사특성에 변화 여부를 확인하기 위하여 API kit를 이용하였고, 총 22가지의 대사활성을 원래의 숙주균과 비교하여 측정하였다. P1α 세분류 균주들의 생화학적 활성은 Table 1에 보였다.
- 파지는 갈반병 균주에 매우 특이적으로 작용하였고 살균효과가 뛰어나 파지테라피를 위한 유용한 균주로 확인되었다. 하지만, 파지와 숙주균의 배양시간이 길어짐에 따라 파지에 대하여 저항성을 갖는 균주가 나타났기에, 원래의 숙주균과 여기서 발생한 파지저항성 균주들의 특성조사를 위하여 유전자적, 생화학적, 병원성의 차이를 조사하였다.
대상 데이터
- 버섯조직 함몰검정(pitting test)은 Gandy (1968)의 방법에 따라 양송이버섯을 이용하여 실시하였다. 양송이버섯은 갓 부분을 절단하여 사용하였다. 버섯의 갓 위 부분 1/3을 절단하고, 절단면에 균주의 배양액(108-109 cfu/mL)이나 tolaasin 추출액 10 μL 점적하여 흡수시켰다.
이론/모형
- 버섯조직 함몰검정(pitting test)은 Gandy (1968)의 방법에 따라 양송이버섯을 이용하여 실시하였다. 양송이버섯은 갓 부분을 절단하여 사용하였다.
- 세포독성의 측정은 본래의 숙주균과 파지저항성 균주의 세포독성과 병원성 변화여부를 확인하기 위하여 실시하였다. 파지저항성 균주의 세포독성 측정은 쥐의 적혈구를 이용한 용혈활성 검정(hemolysis test)과 양송이버섯을 이용한 버섯함몰 검정법(pitting test)으로 이루어졌다.
성능/효과
- 3). P. tolaasii 6264와 HK4 배양액을 처리한 경우 모든 적혈구를 용혈시키는데에 각각 40분, 60분이 소요되었지만, 각각의 파지저항성 균주인 6264R과 HK4R 균주는 20분이내에 모든 적혈구를 완전히 용혈시키는 높은 활성을 보여 파지저항성 획득과정중 세포독성이 증가한 것을 알 수 있었다. 반면, P.
- P1β와 P1γ 세분류 균주는 각각 P. tolaasii HK19R 균주와 HK23R을 대표균주로 생화학적 대사 변화여부를 조사하였으나, HK19R저항성 균주의 경우 대사활성의 변화가 없었고, HK23R 균주는 1가지 대사활성의 변화가 있었다(Table 2).
- 저항성 균주가 원래의 숙주균으로부터 유래된 것을 확인하기 위하여 16S rRNA 유전자 염기서열을 분석하고, 원래의 숙주균의 염기서열과 비교하였다. 각각의 숙주균으로부터 얻은 저항성균의 유전자 염기서열은 정확하게 숙주균의 유전자와 일치하였으며, 계통수 분석에서 같은 균주로 확인되었다(Fig. 2). 이러한 결과는 각 저항성 균주가 원래의 숙주균으로부터 유래하였음을 보여주며, 파지에 대한 저항성을 획득하는 과정에서 16S rRNA유전자의 염기서열에는 전혀 변화가 없었음을 확인하였다.
- 본 연구에서는 느타리버섯 재배 시 큰 피해를 유발하는 세균성갈반병의 방제를 위하여, 사용이 금지된 농약이나 항생제 대신에 숙주균에 특이적이며 사멸효과가 큰 박테리오파지를 이용하여 친환경적인 파지테라피 방법을 개발하고자 하였다. 갈반병 등을 유발한 균주들을 재배농가에서 분리하여 16S rRNA 유전자 분석을 통하여 동정하였고, 이들 중 병원균인 Pseudomonas tolaasii에 속하는 균주 총 23종을 동정하였으며, 이들을 P1그룹으로 명명하였다. 또한, 이들을 다시 phylogenetic tree 분석을 통하여 크게 3종류로 분류하여 P1α, P1β, P1γ로 명명하였다(Yun 등, 2013).
- tolaasii HK5 균주의 버섯함몰 활성보다 낮아진 것을 볼 수 있었다. 그러나, HK23R와 HK3R 균주의 경우는 용혈활성은 사라지거나 작아졌으나 갈반형성능은 원래의 균보다 오히려 증가한 것을 볼 수 있었다. 용혈활성이 없는 P.
- tolaasii 6264R과 HK2R 균주의 경우 각각 7가지와 8가지의 대사활성이 원래의 숙주균과 차이를 보여 파지저항성 획득과 함께 생화학적 대사활성에도 큰 변화가 나타났다. 그러나, HK3R 균주와 HK4R 균주, HK5R 균주는 각각 1가지, 3가지, 1가지의 대사활성이 원래의 숙주균과 다르게 나타나, 파지저항성 변이주의 생화학적 활성은 원래의 숙주균과 큰 변화를 보이지 않았다. P1β와 P1γ 세분류 균주는 각각 P.
- 그러나, 같은 P1α 세분류 균주의 파지 감염에서 얻어진 HK2R 균주와 HK3R, HK4R, HK5R 균주들은 저항성균주 성장반을 형성하지 않고 용균반 내부에 다수의 콜로니를 형성하였고, P1γ 세분류 균주의 파지 감염에서 얻어진 HK23R은 저항성균주 성장반과 콜로니 형태 두 가지 모두 관측되었다.
- 파지저항성을 획득한 균주들은 유전적인 특성이 같은 P1α 균주임에도 불구하고 각각 다른 변화가 관찰되어 생화학적 대사특성과 파지 저항성 사이에는 일정한 상관성이 없다는 결론을 얻었다. 그러나, 이러한 파지저항성 균주 중 HK5R은 용혈활성과 버섯함몰 활성을 기존의 균주와 비교하였을 때, 세포독성이 약해지거나 사라져 적혈구 파괴가 이루어지지 않았고, 갈반형성이 약해지는 것을 확인하였다. 이는 P.
- 버섯함몰 검정법에 따른 측정결과와 용혈활성 측정 결과를 비교하였을 때, 6264R 균주는 용혈활성이 증가하였지만 버섯함몰활성은 변함이 없었고, HK4R의 경우에는 용혈활성과 버섯함몰 활성이 모두 증가한 것으로 확인되었다. 또한 용혈활성이 사라진 HK5R 균주의 버섯함몰 활성이 원래의 P. tolaasii HK5 균주의 버섯함몰 활성보다 낮아진 것을 볼 수 있었다. 그러나, HK23R와 HK3R 균주의 경우는 용혈활성은 사라지거나 작아졌으나 갈반형성능은 원래의 균보다 오히려 증가한 것을 볼 수 있었다.
- 먼저, P. tolaasii 균주 중 P1α 세분류에 속하는 숙주균인 P. tolaasii 6264와 HK2, HK3, HK4, HK5에 각각의 특이적 파지인 φ6264, φHK2, φHK3, φHK4, φHK5를 접종하였고, 다른 세분류 P1β, P1γ에 속하는 숙주균 P. tolaasii HK19, P. tolaasii HK23에 각각 φHK19와 φHK23를 접종하였다.
- tolaasii 6264 균주의 경우 파지저항성 획득에 따른 갈반형성능의 변화는 나타나지 않았다. 반면, P. tolaasii HK3와 HK4 균주는 저항성 획득에 따라 갈반의 깊이가 깊어지고 갈색이 짙어지는 결과로 갈반형성능이 커짐을 확인하였고, P. tolaasii HK5 균주의 경우 저항성 균주에서 갈반형성이 약해져 세포독성이 작아짐을 보였다. 한편, HK2, HK19, HK23 균주의 갈반생성은 저항성 획득에 따라 변화가 없었다.
- 버섯함몰 검정법에 따른 측정결과와 용혈활성 측정 결과를 비교하였을 때, 6264R 균주는 용혈활성이 증가하였지만 버섯함몰활성은 변함이 없었고, HK4R의 경우에는 용혈활성과 버섯함몰 활성이 모두 증가한 것으로 확인되었다. 또한 용혈활성이 사라진 HK5R 균주의 버섯함몰 활성이 원래의 P.
- 병원성 숙주균에 대한 파지의 독성실험 중 2일 이상 배양하는 경우 시간의 경과에 따라서 투명했던 용균반 내부에 자주 세균의 성장이 관측되었으며, 새로이 나타난 세균은 용균반을 만든 파지에 감염되지 않거나 파지의 감염에 둔감한 파지-저항성 균주인 것으로 확인하였다. 용균반 관측실험은 숙주균과 파지를 제외하고 무균 조건에서 수행되었기에 새로이 용균반 내에서 나타난 균주는 원래의 숙주균이 파지에 대하여 저항성을 획득함으로써 나타난 것으로 추정하고, 이 균주들을 분리하여 특성을 조사하였다.
- 용균반 내부에서 생장하는 균주는 숙주균에 파지를 처리하였을 때 저항성을 획득하여 나타났거나, 아니면 파지가 특이적으로 작용하지 못하는 다른 균주의 오염에 의해서 나타났을 것이다. 새로이 나타난 균주의 16S rRNA 유전자 염기서열을 분석하고 계통수 분석을 수행하였을 때, 기존의 숙주균과 파지저항성 균주로 분리된 균주가 같게 분류되어 새로이 나타난 균주는 숙주균이 파지저항성을 획득한 것임을 확인하였다.
- P1α 세분류 균주들의 생화학적 활성은 Table 1에 보였다. 숙주균과 저항성 변이주 사이에 대부분의 생화학적 대사활성이 일치하였으나, P. tolaasii 6264R과 HK2R 균주의 경우 각각 7가지와 8가지의 대사활성이 원래의 숙주균과 차이를 보여 파지저항성 획득과 함께 생화학적 대사활성에도 큰 변화가 나타났다. 그러나, HK3R 균주와 HK4R 균주, HK5R 균주는 각각 1가지, 3가지, 1가지의 대사활성이 원래의 숙주균과 다르게 나타나, 파지저항성 변이주의 생화학적 활성은 원래의 숙주균과 큰 변화를 보이지 않았다.
- tolaasii HK23에 각각 φHK19와 φHK23를 접종하였다. 시간이 경과함에 따라 용균반내부에서 저항성 균주의 콜로니가 발생하는 것을 확인하였다(Fig. 1). 파지 저항성을 획득한 P.
- 2). 이러한 결과는 각 저항성 균주가 원래의 숙주균으로부터 유래하였음을 보여주며, 파지에 대한 저항성을 획득하는 과정에서 16S rRNA유전자의 염기서열에는 전혀 변화가 없었음을 확인하였다.
- tolaasii HK19R 균주와 HK23R을 대표균주로 생화학적 대사 변화여부를 조사하였으나, HK19R저항성 균주의 경우 대사활성의 변화가 없었고, HK23R 균주는 1가지 대사활성의 변화가 있었다(Table 2). 이상의 결과를 통하여 숙주균이 파지저항성을 획득할 때, 파지저항성 획득과 동시에 대사활성에도 변화가 유발될 수 있으나 변화정도는 균주에 따라 다르게 나타남을 알 수 있었다.
- tolaasii HK2, HK19, HK3 균주의 경우 파지저항성 획득에 따라 용혈 활성 변화는 관측되지 않아 변화가 없었다. 이상의 결과에서 파지저항성 균주의 세포독성 변화는 균주마다 다른 양상을 보여, 각 균주마다 파지에 대한 저항성을 획득할 때 파지저항성과 무관하게 세포독성 등의 생리생화학적 특성에 변화가 일어났음을 확인하였다.
- 분리한 파지는 파지테라피에 사용하기 위하여 숙주균에 대한 민감도를 조사하였고, 숙주균의 사멸효과가 높은 파지혼합액을 구성할 파지 종류를 선정하였다. 파지는 갈반병 균주에 매우 특이적으로 작용하였고 살균효과가 뛰어나 파지테라피를 위한 유용한 균주로 확인되었다. 하지만, 파지와 숙주균의 배양시간이 길어짐에 따라 파지에 대하여 저항성을 갖는 균주가 나타났기에, 원래의 숙주균과 여기서 발생한 파지저항성 균주들의 특성조사를 위하여 유전자적, 생화학적, 병원성의 차이를 조사하였다.
- 파지저항성 균주들의 콜로니 양태를 관측하면 P. tolaasii 6264R 균주와 HK19R 균주는 용균반 전체로 퍼져 나타났으며, 저항성균 성장반 주위에는 파지의 확산에 따라 용균반 밖에는 파지감수성 균이, 내부에는 파지저항성 균이 성장하여 퍼지는 상태로 이 사이에는 투명한 용균선이 관측되었다. 그러나, 같은 P1α 세분류 균주의 파지 감염에서 얻어진 HK2R 균주와 HK3R, HK4R, HK5R 균주들은 저항성균주 성장반을 형성하지 않고 용균반 내부에 다수의 콜로니를 형성하였고, P1γ 세분류 균주의 파지 감염에서 얻어진 HK23R은 저항성균주 성장반과 콜로니 형태 두 가지 모두 관측되었다.
- 파지저항성을 획득한 균주들은 유전적인 특성이 같은 P1α 균주임에도 불구하고 각각 다른 변화가 관찰되어 생화학적 대사특성과 파지 저항성 사이에는 일정한 상관성이 없다는 결론을 얻었다.
후속연구
- tolaasii HK5 균주가 파지 φHK5의 자극에 의해 저항성을 획득할 때, 세포독성 물질을 분비하지 못하는 비병원성 균주로 변이 된 것으로 보인다(Simon 등, 2010; Julie 등, 2013). 이것은 HK23균주에서도 유사하게 관측되어 파지저항성 획득과 세포독성 감소 사이에 상관관계를 분자수준에서 조사하여 밝혀냄으로써 숙주균 특성에서의 파지테라피 문제점을 이해하여야 이 방법의 효율을 높일 수 있을 것이다.
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