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문제 정의
- 그리고 시판 중인 채소 주스와 조제분유를 이용하여 분리된 용균성 파지에 의한 C. sakazakii와 S. enterica Typhimurium의 제어 효과를 확인하고자 하였다(Fig. 7). 그 결과 조제분유의 경우 초기에 약 2 log CFU/mL에서 8시간 이후에 C.
- 따라서 본 연구에서는 조제분유에서 가장 큰 병원성 세균으로 알려진 S. enterica Typhimurium과 Cronobacter sakazakii에 작용하는 박테리오파지를 분리하고 이들 식품에 적용하여 활용이 가능한지를 연구하고자 하였다.
제안 방법
- 시료는 경기도 소재의 돼지 농장들로부터 분변시료를 채취한후 실험실에서 −80℃에 보관 후 용균성 박테리오파지의 분리에 사용하였다. C. sakazakii ATCC 29544와 S. enterica Typhimurium ATCC 12023을 DFI agar(Oxoid, Hampshire, UK)와 XLD agar(Oxoid)에 각각 평판 획선하고 37℃에서 배양한 후 단일 집락을 Luria Bertani broth(Difco Laboratory, Detroit, MI, USA)에 접종하고 37℃에서 200 rpm으로 교반하면서 배양하였다. 배양된 균주를 10 mM CaCl2(Sigma Aldrich, St.
- C. sakazakii와 S. enterica Typhimurium을 각각 LB broth에서 대수 증식기까지 배양하고, 배양액을 50 mL의 LBC broth에 각각 접종하고 MOI가 약 0.1 수준으로 ES2 파지와 ST2 파지를 각각 접종한 후 37℃에서 200 rpm으로 교반하여 배양하면서 시간에 따른 생육 저해 정도를 흡광도를 측정하여 확인하였다. 또한 실제 식품에 C.
- enterica Typhimurium균을 용해시키는 박테리오파지를 분리하였고 현미경과 그의 특성을 분석, 동정하였다. Cronobacter에 작용하는 ES2 파지와 Salmonella의 ST2 파지는 형태학적 특성이 각각 Myoviridae와 Siphoviridae로 각각 동정되었으며 제한효소지도와 SDS-PAGE 분석에 의하여 서로 다른 파지 임을 확인하였다. ES2 파지의 경우 latent period는 약 40분 정도였으며, ST2 파지는 약 30분 정도를 나타냈으며, burst size는 ES2파지는 약 52±5 PFU/cell, ST2 파지는 약 21±3 PFU/cell로 나타났다.
- enterica Typhimurium 용균성 파지의 형태학적 특성을 분석하기 위해 투과전자현미경을 사용하여 검경하였다. PEG 8000(Sigma)을 이용해 약 10-11 log PFU/mL 수준으로 농축된 파지를 2% uranyl acetate를 이용하여 negative stain을 수행한 후 80 kV 하에서 투과 전자 현미경을 통해 형태학적 특성을 확인하였다. 구조 단백질을 확인하기 위해 SDS-PAGE 를 수행하였다.
- PEG 8000(Sigma)을 이용해 약 10-11 log PFU/mL 수준으로 농축된 파지를 2% uranyl acetate를 이용하여 negative stain을 수행한 후 80 kV 하에서 투과 전자 현미경을 통해 형태학적 특성을 확인하였다. 구조 단백질을 확인하기 위해 SDS-PAGE 를 수행하였다. 농축된 파지용액 15 µL와 6×sample buffer를 혼합한 후 100℃에서 가열한 후 SDS-PAGE를 수행하고 coomassie blue 염색법으로 염색한 후 15% methanol과 10% acetic acid를 혼합한 탈색액으로 탈색한 후 단백질 패턴을 확인하였다.
- 그리고 10,000×g에서 10분 동안 원심 분리한 후 상등액을 취해 0.22 µm syringe filter (Millipore, Billerica, MA, USA)를 사용하여 제균한 후 제균액을 double overlay agar법을 통한 플라크 분석을 수행하고 37℃에서 24시간 배양하였다.
- 1 수준으로 접종한 후 흡착을 위해 약 10분 동안 배양한 후 10,000×g에서 10분 동안 원심 분리를 수행한다. 그리고 pellet을 새로운 LBC broth로 현탁한 후 37℃에서 배양하면서 5분 간격으로 시료를 채취하여 방출된 파지 양을 double agar overlay 방법으로 수행하여 확인하였다. 분리된 용균성 파지를 45, 50, 60℃에 노출시키고 처리 시간에 따라 희석하여 plaque assay를 수행한 후 플라크를 확인하였다.
- 그리고 용균성 파지 용액 10 µL를 분주한 후 37℃에서 24시간 배양하고 plaque 형성 여부를 확인하였다.
- 농축된 파지용액 15 µL와 6×sample buffer를 혼합한 후 100℃에서 가열한 후 SDS-PAGE를 수행하고 coomassie blue 염색법으로 염색한 후 15% methanol과 10% acetic acid를 혼합한 탈색액으로 탈색한 후 단백질 패턴을 확인하였다.
- 농축된 파지용액을 20 µg/mL의 DNase와 RNase(Sigma)를 처리한 후 약 15분 동안 37℃에서 배양하고 10 mg/mL proteinase K(Sigma)와 150 µL lysis buffer(0.5 M EDTA, 10% SDS, 1 M Tris(pH 8.0))을 첨가하였다.
- 다양한 돼지 농장으로부터 얻은 10개의 돼지 분변 시료로부터 C. sakazakii와 S. enterica Typhimurium의 용균성 파지를 분리하였다. 분리된 5개의 파지 중에서 가장 플라크가 선명한 2개의 파지를 C.
- 돼지 분변 시료를 취해 균질화한 후 LBC broth에서 전 배양된 C. sakazakii와 S. enterica Typhimurium을 약 7-8 log CFU/mL 수준의 배양액을 균질화한 시료에 첨가한 후 24시간 동안 150 rpm으로 37℃에서 교반하며 배양하였다. 그리고 10,000×g에서 10분 동안 원심 분리한 후 상등액을 취해 0.
- enterica Typhimurium을 박테리오파지로 제어하기 위하여 용균성 박테리오파지를 분리, 동정하였고 조제분유와 채소 주스에 이들 세균에 적용하여 그의 효과를 분석하였다. 박테리오 파지는 돼지 분변에서 C. sakazakii와 S. enterica Typhimurium균을 용해시키는 박테리오파지를 분리하였고 현미경과 그의 특성을 분석, 동정하였다. Cronobacter에 작용하는 ES2 파지와 Salmonella의 ST2 파지는 형태학적 특성이 각각 Myoviridae와 Siphoviridae로 각각 동정되었으며 제한효소지도와 SDS-PAGE 분석에 의하여 서로 다른 파지 임을 확인하였다.
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분리 파지의 형태학적 특성 및 구조 단백질 분석
분리된 C. sakazakii와 S. enterica Typhimurium 용균성 파지의 형태학적 특성을 분석하기 위해 투과전자현미경을 사용하여 검경하였다. PEG 8000(Sigma)을 이용해 약 10-11 log PFU/mL 수준으로 농축된 파지를 2% uranyl acetate를 이용하여 negative stain을 수행한 후 80 kV 하에서 투과 전자 현미경을 통해 형태학적 특성을 확인하였다.
- 그리고 pellet을 새로운 LBC broth로 현탁한 후 37℃에서 배양하면서 5분 간격으로 시료를 채취하여 방출된 파지 양을 double agar overlay 방법으로 수행하여 확인하였다. 분리된 용균성 파지를 45, 50, 60℃에 노출시키고 처리 시간에 따라 희석하여 plaque assay를 수행한 후 플라크를 확인하였다.
- 순수 분리된 C. sakazakii와 S. enterica Typhimurium의 용균성파지를 대상으로 하여 B. cereus, E. coli O157:H7, S. aureus, L. monocytogenes 등의 식중독 세균과 본 연구팀에서 분리, 동정하여 보유하고 있는 C. sakazakii와 S. enterica Typhimurium를 대상으로 host spectrum을 spot assay를 수행하여 확인하였다. 다양한 식중독 세균들은 tryptic soy broth(Difco)에서 3회 이상 계대 배양한 후 LBC broth에 접종한 후 0.
- 22 µm syringe filter (Millipore, Billerica, MA, USA)를 사용하여 제균한 후 제균액을 double overlay agar법을 통한 플라크 분석을 수행하고 37℃에서 24시간 배양하였다. 이 분석을 통해 생성된 플라크의 크기, opaque 정도 등의 형태학적인 특성에 따라 단일 플라크를 취해 다시 플라크 분석을 하여 순수 분리하였다. 순수 분리된 용균성 파지의 증식과 농축은 Sambrook 등에 의한 방법(24)에 준하여 수행하였다.
- 그리고 상등액을 취해 chloroform:isoamyl alcohol을 첨가하고 동일하게 원심분리를 수행한 후 상등액을 취해 ethanol로 침전하고 수세한 후 증류수로 현탁하고 −80℃에서 보관하며 실험에 사용하였다. 제한 효소의 절단 패턴은 제한효소에 특성에 맞게 실험을 수행하였으며, 실험 후 절단된 DNA의 패턴은 agarose gel electrophoresis를 통해 확인하였다.
- enterica Typhimurium이 검출되지 않은 분유를 이용하여 조제한 후 실험에 사용하였다. 조제분유와 채소 주스 시료에 C. sakazakii와 S. enterica Typhimurium을 약 4 log CFU/mL 수준으로 각각 접종한 후 ES2 파지와 ST2 파지를 각각 접종(MOI≒1) 후 37℃에서 배양하면서 시간에 따른 생균수를 10진 희석법에 따라 DFI agar(Oxoid)와 XLD agar(Oxoid)에 각각 도말한 후 24시간 이후에 계수하였다.
- 즉석 편이식품에서 위해도가 가장 큰 C. sakazakii와 S. enterica Typhimurium을 박테리오파지로 제어하기 위하여 용균성 박테리오파지를 분리, 동정하였고 조제분유와 채소 주스에 이들 세균에 적용하여 그의 효과를 분석하였다. 박테리오 파지는 돼지 분변에서 C.
대상 데이터
- 1 수준으로 ES2 파지와 ST2 파지를 각각 접종한 후 37℃에서 200 rpm으로 교반하여 배양하면서 시간에 따른 생육 저해 정도를 흡광도를 측정하여 확인하였다. 또한 실제 식품에 C. sakazakii와 S. enterica Typhimurium이 오염되어 있을 경우에 생육 억제 효과를 확인하기 위해 시판하는 채소 주스와 조제 분유 중 C. sakazakii와 S. enterica Typhimurium이 검출되지 않은 분유를 이용하여 조제한 후 실험에 사용하였다. 조제분유와 채소 주스 시료에 C.
- enterica Typhimurium ATCC 12023을 DFI agar(Oxoid, Hampshire, UK)와 XLD agar(Oxoid)에 각각 평판 획선하고 37℃에서 배양한 후 단일 집락을 Luria Bertani broth(Difco Laboratory, Detroit, MI, USA)에 접종하고 37℃에서 200 rpm으로 교반하면서 배양하였다. 배양된 균주를 10 mM CaCl2(Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA)가 첨가된 LB broth(LBC)에 접종한 후 동일한 조건으로 배양하고 실험에 사용하였다.
- 시료는 경기도 소재의 돼지 농장들로부터 분변시료를 채취한후 실험실에서 −80℃에 보관 후 용균성 박테리오파지의 분리에 사용하였다.
이론/모형
- 이 분석을 통해 생성된 플라크의 크기, opaque 정도 등의 형태학적인 특성에 따라 단일 플라크를 취해 다시 플라크 분석을 하여 순수 분리하였다. 순수 분리된 용균성 파지의 증식과 농축은 Sambrook 등에 의한 방법(24)에 준하여 수행하였다.
성능/효과
- ES2 파지의 경우 latent period는 약 40분 정도였으며, ST2 파지는 약 30분 정도를 나타냈으며, burst size는 ES2파지는 약 52±5 PFU/cell, ST2 파지는 약 21±3 PFU/cell로 나타났다.
- ES2의 경우 latent period는약 40분 정도였으며, ST2 는 약 30분 정도를 나타냈으며, burst size는 ES2는 약 52±5 PFU/cell, ST2는 약 21±3 PFU/cell로 확인되었다.
- 이 분리 파지를 조제분유와 채소 주스에 직접 적용한 효과는 ES2에 의한 Cronobacter 제어는 접종 후 6시간까지는 균수가 일정하게 유지하였고 균의 증식을 일어나지 않는 것으로 나타났다. ST2 파지에 의한 Salmonella는 생육저해가 잘 일어나 접종시간이 지남에 따라 균수가 감소하는 것을 확인하였다. 그러므로 C.
- 3과 같다. 그 결과 ES2와 ST2는 서로 전혀 다른 구조 단백질을 가지고 있는 것으로 제한 효소를 이용한 DNA 절단 패턴 역시 서로 상이하게 나타나는 것으로 확인되었다. 이는 전자 현미경을 이용한 형태학적 특성을 확인했을 때 Myoviriadae family와 Siphoviridae family로 서로 다른 family에 속하고 있어 다른 구조 단백질과 DNA 염기서열을 보유하고 있는 것으로 판단된다.
- 6과 같다. 그 결과 용균성 파지를 접종하지 않았을 경우는 C. sakazakii는 흡광도 값이 약 1.2, S. enterica Typhimurium은 약 0.9 수준까지 증가하였으나, ES2와 ST2를 각각 접종하였을 경우는 흡광도 값이 약 0.4-0.5 수준으로 나타나 생육이 억제 혹은 사멸하는 현상을 알 수 있었다.
- 7). 그 결과 조제분유의 경우 초기에 약 2 log CFU/mL에서 8시간 이후에 C. sakazakii는 약 7 log CFU/mL, S. enterica Typhimurium은 약 6 log CFU/mL 수준으로 증가되는 것으로 나타났으며, ES2 파지와 ST2 파지를 각각 처리했을 경우는 C. sakazakii는 초기 2 log CFU/mL 수준을 유지하고 있었으며, S. enterica Typhimurium은 검출되지 않았다. 또한 채소 주스의 경우 초기에 약 4 log CFU/mL에서 9 시간 이후에는 약 6 log CFU/mL로 증가하였으나, ES2 파지와 ST2 파지를 각각 첨가하였을 때는 C.
- ES2의 경우 latent period는약 40분 정도였으며, ST2 는 약 30분 정도를 나타냈으며, burst size는 ES2는 약 52±5 PFU/cell, ST2는 약 21±3 PFU/cell로 확인되었다. 또한 45, 50, 60℃에 따른 열안정성을 확인한 결과는 Fig. 5와 같으며, 45와 50℃의 경우 100분 동안 노출되었을 때 ES2와 ST2 파지 모두 안정한 것으로 나타났다(자료 미제시). 하지만 60℃의 경우는 ST2 파지의 경우 100분 동안 안정한 것으로 나타났으나, ES2 파지는 30분 이후부터는 확인되지 않았다.
- monocytogenes 등의 서로 다른 식중독 세균에 대해서는 감염하지 않음을 확인할 수 있었다. 또한 본 연구팀에서 보유하고 있는 17주의 C. sakazakii와 20주의 S. enterica Typhimurium의 분리균들을 대상으로 host spectrum을 확인한 결과, ES2 파지는 9주의 C. sakazakii, ST2 파지는 12주의 S. enterica Typhimurium을 용해시켰다(자료 미제시). 최근 다양한 식중독 세균들에 대한 virulent phage에 대한 보고가 되고 있으며, 이를 이용해 식중독 세균의 제어에 응용하려는 연구가 많이 진행되고 있다.
- enterica Typhimurium은 검출되지 않았다. 또한 채소 주스의 경우 초기에 약 4 log CFU/mL에서 9 시간 이후에는 약 6 log CFU/mL로 증가하였으나, ES2 파지와 ST2 파지를 각각 첨가하였을 때는 C. sakazakii는 조제분유와 마찬가지로 초기 균수를 유지하였으며, S. enterica Typhimurium은 초기에 비해 약 2 log CFU/mL이 감소되었음을 확인할 수 있었다. Kim 등 (23)은 sewage 시료로부터 C.
- enterica Typhimurium의 용균성 파지를 분리하였다. 분리된 5개의 파지 중에서 가장 플라크가 선명한 2개의 파지를 C. sakazakii는 ES2 파지와 S. enterica Typhimurium은 ST2파지라고 명명하였다. 분리된 ES2 파지와 ST2 파지의 형태학적 특성을 투과 전자 현미경을 통해 확인한 결과 ES2는 Myoviriadae family, ST2는 Siphoviridae family에 속하는 것으로 확인되었다 (Fig.
- enterica Typhimurium은 ST2파지라고 명명하였다. 분리된 ES2 파지와 ST2 파지의 형태학적 특성을 투과 전자 현미경을 통해 확인한 결과 ES2는 Myoviriadae family, ST2는 Siphoviridae family에 속하는 것으로 확인되었다 (Fig. 1). 이 ES2와 ST2에 대한 숙주작용 범위를 분석한 결과, B.
- 1). 이 ES2와 ST2에 대한 숙주작용 범위를 분석한 결과, B. cereus, E. coli O157:H7, S. aureus, L. monocytogenes 등의 서로 다른 식중독 세균에 대해서는 감염하지 않음을 확인할 수 있었다. 또한 본 연구팀에서 보유하고 있는 17주의 C.
- 따라서 ST2 파지가 ES2 파지에 비해 열안정성이 높은 것을알 수 있었다. 이 분리 파지를 조제분유와 채소 주스에 직접 적용한 효과는 ES2에 의한 Cronobacter 제어는 접종 후 6시간까지는 균수가 일정하게 유지하였고 균의 증식을 일어나지 않는 것으로 나타났다. ST2 파지에 의한 Salmonella는 생육저해가 잘 일어나 접종시간이 지남에 따라 균수가 감소하는 것을 확인하였다.
후속연구
- com)들이 생산 되고 있다. 따라서 본 연구를 통해 분리된 ES2 파지와 ST2 파지를 이용해 추가적으로 다양한 식품에 적용을 통해 C. sakazakii와 S. enterica Typhimurium을 제어에 이용할 수 있을 것으로 사료된다.
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