고순도 β-1.3/1.6-Glucan이 대식세포 및 자연살해세포와 T 세포면역계에 미치는 영향 Effect of High Purity β-1.3/1.6-Glucan on Macrophages, Natural Killer Cells, and T Cell-Mediated Factors원문보기
본 연구에서는 고순도 ${\beta}$-1.3/1.6-glucan이 선천면역계에 중요한 역할을 하는 대식세포와 자연살해세포의 활성화와 적응면역계에서 중요한 역할을 하는 T 세포면역계에 대한 면역조절 효과를 살펴보고자 대식세포의 활성능, 자연살해 세포의 활성능, 그리고 T 세포 면역계에 조절작용을 하는 사이토카인, CD4+/CD8+ T 세포에 미치는 영향을 관찰하였다. 마우스 복강에서 불리한 대식세포를 이용하여 세포독성을 확인한 결과 고순도 ${\beta}$-1.3/1.6-glucan $10{\sim}200{\mu}g/mL$의 농도에서 독성이 나타나지 않았다. 또한, 고순도 ${\beta}$-1.3/1.6-glucan은 대식세포의 활성능, 자연살해세포의 활성능에 도움을 주어 활성능을 증가시켜 외부로부터 침입한 미생물, 감염된 세포나 종양세포 등을 효과적으로 제거할 수 있을 것이라 예상할 수 있었다. 마지막으로 T 세포 면역계에 조절작용을 하는 사이토카인과 CD4+/CD8+를 확인한 결과 고순도 ${\beta}$-1.3/1.6-glucan이 사이토카인들의 분비량 및 CD4+/CD8+를 증가시켜 T 세포 면역계에 조절뿐아니라 B 세포 면역계의 조절에 도움을 줄 것이라 예상할 수 있었다. 결론적으로 고순도 ${\beta}$-1.3/1.6-glucan은 선천면역뿐 아니라 적응면역에서 영향을 미칠 것이라 생각하며 면역조절에 긍정적인 변화를 보였으므로 추후 면역 조절제로서 기능성 식품의 상업화에 기초 자료가 되어 국내 기능성 소재로서의 개발 가능성을 기대할 수 있다.
본 연구에서는 고순도 ${\beta}$-1.3/1.6-glucan이 선천면역계에 중요한 역할을 하는 대식세포와 자연살해세포의 활성화와 적응면역계에서 중요한 역할을 하는 T 세포 면역계에 대한 면역조절 효과를 살펴보고자 대식세포의 활성능, 자연살해 세포의 활성능, 그리고 T 세포 면역계에 조절작용을 하는 사이토카인, CD4+/CD8+ T 세포에 미치는 영향을 관찰하였다. 마우스 복강에서 불리한 대식세포를 이용하여 세포독성을 확인한 결과 고순도 ${\beta}$-1.3/1.6-glucan $10{\sim}200{\mu}g/mL$의 농도에서 독성이 나타나지 않았다. 또한, 고순도 ${\beta}$-1.3/1.6-glucan은 대식세포의 활성능, 자연살해세포의 활성능에 도움을 주어 활성능을 증가시켜 외부로부터 침입한 미생물, 감염된 세포나 종양세포 등을 효과적으로 제거할 수 있을 것이라 예상할 수 있었다. 마지막으로 T 세포 면역계에 조절작용을 하는 사이토카인과 CD4+/CD8+를 확인한 결과 고순도 ${\beta}$-1.3/1.6-glucan이 사이토카인들의 분비량 및 CD4+/CD8+를 증가시켜 T 세포 면역계에 조절뿐아니라 B 세포 면역계의 조절에 도움을 줄 것이라 예상할 수 있었다. 결론적으로 고순도 ${\beta}$-1.3/1.6-glucan은 선천면역뿐 아니라 적응면역에서 영향을 미칠 것이라 생각하며 면역조절에 긍정적인 변화를 보였으므로 추후 면역 조절제로서 기능성 식품의 상업화에 기초 자료가 되어 국내 기능성 소재로서의 개발 가능성을 기대할 수 있다.
The present study investigated the immunomodulatory effects of high-purity ${\beta}$-1.3/1.6-glucan on macrophages, natural killer (NK) cells, and T cell-mediated factors. Effect of high-purity ${\beta}$-1.3/1.6-glucan on cytotoxicity in macrophages was investigated. Using macr...
The present study investigated the immunomodulatory effects of high-purity ${\beta}$-1.3/1.6-glucan on macrophages, natural killer (NK) cells, and T cell-mediated factors. Effect of high-purity ${\beta}$-1.3/1.6-glucan on cytotoxicity in macrophages was investigated. Using macrophages, cytotoxicity of high-purity ${\beta}$-1.3/1.6-glucan was evaluated by MTT assay. We treated high-purity ${\beta}$-1.3/1.6-glucan at concentrations of 10, 50, 100, 150, 200, and $250{\mu}g/mL$ in macrophages. High-purity ${\beta}$-1.3/1.6-glucan did not affect macrophage viability. Phagocytic activity was assessed using zymosan. Activity of high-purity ${\beta}$-1.3/1.6-glucan on macrophages significantly increased as compared with zymosan. We treated high-purity ${\beta}$-1.3/1.6-glucan to murine NK cells co-incubated with YAC-1 cells. High-purity ${\beta}$-1.3/1.6-glucan resulted in significantly increased activity of NK cells as compared with the control. In addition, treatment of macrophages with high-purity ${\beta}$-1.3/1.6-glucan resulted in significantly increased activity of T cell-mediated cytokine (IL-2, IL-12, $IFN-{\gamma}$, and $TNF-{\alpha}$) levels and CD4+/CD8+ T cells as compared with the control. In conclusion, high-purity ${\beta}$-1.3/1.6-glucan could enhance the immune response through activation of macrophages, NK cells, and T cell-mediated factors.
The present study investigated the immunomodulatory effects of high-purity ${\beta}$-1.3/1.6-glucan on macrophages, natural killer (NK) cells, and T cell-mediated factors. Effect of high-purity ${\beta}$-1.3/1.6-glucan on cytotoxicity in macrophages was investigated. Using macrophages, cytotoxicity of high-purity ${\beta}$-1.3/1.6-glucan was evaluated by MTT assay. We treated high-purity ${\beta}$-1.3/1.6-glucan at concentrations of 10, 50, 100, 150, 200, and $250{\mu}g/mL$ in macrophages. High-purity ${\beta}$-1.3/1.6-glucan did not affect macrophage viability. Phagocytic activity was assessed using zymosan. Activity of high-purity ${\beta}$-1.3/1.6-glucan on macrophages significantly increased as compared with zymosan. We treated high-purity ${\beta}$-1.3/1.6-glucan to murine NK cells co-incubated with YAC-1 cells. High-purity ${\beta}$-1.3/1.6-glucan resulted in significantly increased activity of NK cells as compared with the control. In addition, treatment of macrophages with high-purity ${\beta}$-1.3/1.6-glucan resulted in significantly increased activity of T cell-mediated cytokine (IL-2, IL-12, $IFN-{\gamma}$, and $TNF-{\alpha}$) levels and CD4+/CD8+ T cells as compared with the control. In conclusion, high-purity ${\beta}$-1.3/1.6-glucan could enhance the immune response through activation of macrophages, NK cells, and T cell-mediated factors.
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문제 정의
CD4+ T 세포와 CD8+ T 세포의 세포 비율을 관찰하고자 실험을 진행하였다. 위의 실험들에서 250 μg/mL의 농도에서 유의적으로 세포를 감소하는 것에 대해 첫째는 과 activation으로 인하여
그러나 미생물 균체의 세포벽에 함유된 경우 불순물도 많이 포함하고 있고, 또한 물에 불용성이기 때문에 이러한 문제점을 해결하고자 본 연구에서는 Aspergillus pullulans 를 이용하여 수용성의 고순도 β-glucan인 β-1.3/1.6-glucan 생산하여 대식세포 및 자연살해세포와 T 세포 면역계의 영향을 관찰하여 면역조절 효과에 대한 기능성을 확인하고자 한다.
본 연구에서는 고순도 β-1.3/1.6-glucan의 처리가 사이토카인의 분비에 미치는 영향을 확인하였다.
본 연구에서는 고순도 β-1.3/1.6-glucan이 선천면역계에 중요한 역할을 하는 대식세포와 자연살해세포의 활성화와 적응면역계에서 중요한 역할을 하는 T 세포 면역계에 대한 면역조절 효과를 살펴보고자 대식세포의 활성능, 자연살해세포의 활성능, 그리고 T 세포 면역계에 조절작용을 하는 사이토카인, CD4+/CD8+ T 세포에 미치는 영향을 관찰하였다.
본 연구에서는 대식세포를 활성화시키는 zymosan과 함께 고순도 β-1.3/1.6-glucan의 처리가 대식세포 활성에 미치는 영향을 관찰하였다.
제안 방법
250 μg/ mL 농도에서 90.33±3.51%의 생존율을 보여 유의적으로 감소하였으나 90~100% 이상의 세포생존율을 보여 고순도 β-1.3/1.6-glucan 250 μg/mL 농도까지 실험농도로 설정하였지만, 250 μg/mL의 농도에서 세포생존율이 유의적으로 감소하는 것에 대하여 세포독성으로 인하여 감소한 것이라는 생각을 배제하지 않고 고순도 β-1.3/1.6-glucan 10~250 μg/mL의 농도로 설정하여 실험을 진행하였다.
45 μm cell strainer를 사용하여 세포 부유액을 만들었다. Red blood cell lysing buffer(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)로 적혈구를 용혈시켜 만든 비장 세포 부유액을 mouse NK cell enrichment kit(StemCell Technologies, Inc., Vancouver, Canada)을 사용하여 자연살해세포를 분리하였다.
YAC-1 세포는 target 세포로 이용하였으며, effector 세포와 5:1로 co-culture 하여 고순도 β-1.3/1.6-glucan을 10, 75, 150, 250 μg/mL의 농도별로 처리한 후 4시간 동안 배양하였다.
고순도 β-1.3/1.6-glucan의 적정농도를 결정하기 위해 primary culture 한 대식세포에 10~250 μg/mL의 농도를 처리한 후 세포의 생존율을 측정하였다.
대식세포의 분리를 위하여 희생 3일 전 Balb/c mouse에 2 mL의 thioglycollate medium을 복강에 주사하였다. 3일 후 마우스의 복강에서 serum free media를 주입 후 대식세포를 분리하였다.
대식세포의 활성화를 위하여 kit에 포함된 zymosan 입자를 사용하여 고순도 β-1.3/1.6-glucan을 10, 75, 150, 250 μg/mL의 농도별로 처리한 후 ELISA reader를 이용하여 흡광도 405 nm에서 측정하였다.
후)μg/mL농도별로">μg/mL 농도별로 처리한 후 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 CD4+, CD8+ (Southern Biotech, Birmingham, AL, USA) Flow cytometry용 anti-body를 세포수에 맞추어 처리한 후 ice 상태에서 30분간 shaking 한 후 CytoFLEX(Beckman Coulter Inc., South Kraemer Boulevard, CA, USA)를 이용하여 측정하였다.
후)처리한 후">처리한 후 4시간 동안 배양하였다. 배양하여 유리된 lactate dehydrogenase(LDH)를 cytotox 96 non radioactive cytotoxicity assay kit(Promega Corporation, Madison, WI, USA)을 이용하여 흡광도 490 nm에서 측정하여 계산하고 YAC-1 세포의 사멸 정도를 NK cell activity(%)로 나타내었다.
배양한 후 생성된 IL-2, TNF-α, IL-12, IFN-γ 양을 Douset Sandwich ELISA mouse kit(R&D System, McKinley Place NE, MN, USA)을 이용하여 측정하였다.
배지와 MTT 시약을 제거하고 DMSO(dimethyl sulfoxide) 시약 200 μL를 가하여 560 nm에서 ELISA reader(VERSAMAXSL-20, Molecular Devices, Seoul, Korea)를 이용하여 측정하였다.
본 연구에서는 Moloney virus-induced lymphoma 세포주인 YAC-1 세포를 target cell로, 자연살해세포를 effector cell로 설정하고 co-culture 하여 고순도 β-1.3/1.6-glucan의 처리가 자연살해세포 활성에 미치는 영향을 관찰하였다.
분리한 splenocyte를 24 well plate에 1×106 cells/well의 농도로 RPMI-1640 배양액에 분주하여 고순도 β-1.3/1.6-glucan, PC 비교 대조군을 10, 150 μg/mL 농도별로 처리한 후 24시간 동안 배양하였다.
분리한 대식세포를 96 well plate에 1×104 cells/well의농도로 10% FBS를 첨가한 DMEM(HyClone Laboratories) 배지에 분주하여 안정화시킨 후, 고순도 β-1.3/1.6- glucan을 10, 50, 100, 150, 200, 250 μg/mL의 농도로 처리하여 24시간 동안 배양하였다.
자연살해세포의 분리를 위해 마우스에서 분리한 비장을 10% fetal bovine serum(FBS), 2 mmol/L glutamine, 100 mg/L penicillin-streptomycin을 첨가한 RPMI 1640으로 세척하고 0.45 μm cell strainer를 사용하여 세포 부유액을 만들었다.
대상 데이터
본 연구에서 사용된 YAC-1 세포는 American Type Culture Collection(ATCC, Manassas, VA, USA)에서 분양받았다. 10% fetal bovine serum(HyClone Laboratories, Logan, UT, USA), 2 mmol/L glutamine(HyClone Laboratories), 100 mg/L penicillin-streptomycin(HyClone Laboratories)을 첨가한 RPMI 1640(HyClone Laboratories)을 사용하여 37℃, 5% CO2의 조건인 incubator에서 배양하였다.
본 연구에서 사용된 고순도 β-glucan은 선일바이오(주)(Jangheung, Korea)에서 Aspergillus pullulans를 이용하여 균주 배양 후 원심분리 하여 균체를 제거하고, 농축(불순물 제거)과 주정침지(β-glucan 회수) 하여 동결건조 한 수용성의 β-1.3/1.6-glucan을 제공받아 D.W를 용매로 하여 사용하였다.
데이터처리
Statistical analyses were performed by Duncan's multiple range tests after one-way ANOVA using SPSS software.
Statistical analyses were performed by Duncan's multiple range tests after oneway ANOVA using SPSS software.
모든 실험은 3회 반복 시행하였으며 얻어진 결과는 SPSS 22.0 software(IBM, cambridge, MA, USA)를 이용하여 분석하였으며, 모든 측정 항목의 결과는 평균(mean)±표준편차(standard deviation, SD)로 표시하였다.
실험군 간 평균 차이를 one-way ANOVA로 확인한 후 그룹 간의 통계적 유의성을 Duncan's multiple range test를 이용하여 검증하였으며 5% 이내에서 통계적 유의성을 부여하였다(P<0.05).
성능/효과
CD4+ T 세포의 경우 control군에서 CD4+ T 세포는 40.29±0.50%였으나 고순도 β-1.3/1.6-glucan을 10 μg/mL 농도로 처리한 군에서는 41.62±1.14%로 유의적인 차이가 없었으나 150 μg/mL 농도로 처리한 군에서는 43.63±0.53%로 유의적으로 증가하였음을 확인하였다.
CD8+ T 세포의 경우 control군에서 CD8+ T 세포는 4.80±0.26%였으나 고순도 β-1.3/1.6-glucan을 처리한 군들은 10 μg/mL, 150 μg/mL 농도로 각각 12.64±0.30%, 13.59±0.33%로 농도 의존적으로 증가하였음을 확인하였다.
IFN-γ의 분비량 측정 결과 Fig. 4D에서 나타난 바와 같이 control군 5.79±0.43 pg/mL보다 10, 75, 150, 250 μg/mL 농도 모두에서 각각 11.49±0.66 pg/mL, 14.08±0.66 pg/mL, 14.78±0.10 pg/mL, 14.68±0.76 pg/mL로 유의적으로 분비량이 증가하는 것을 확인하였다.
IL-12의 분비량 측정 결과 Fig. 4C에서 나타난 바와 같이 control군 34.26±1.44 pg/mL보다 10, 75, 150, 250 μg/mL 농도 모두에서 각각 76.10±3.92 pg/mL, 91.48±3.93 pg/mL, 103.28±0.62 pg/mL, 100.18±4.76 pg/mL로 유의적으로 분비량이 증가하는 것을 확인하였다.
IL-2의 분비량 측정 결과 Fig. 4B에서 나타난 바와 같이 control군 16.20±0.44 pg/mL보다 10, 75, 150, 250 μg/ mL 농도 모두에서 각각 51.37±3.00 pg/mL, 63.14±3.00 pg/mL, 66.28±0.47 pg/mL, 65.86±3.44 pg/mL로 유의적으로 분비량이 증가하는 것을 확인하였다.
TNF-α의 분비량 측정 결과 Fig. 4A에서 나타난 바와 같이 control군 57.56±3.12 pg/mL에 비하여 10, 75, 150, 250 μg/mL 농도 모두에서 각각 148.22±8.51 pg/mL, 181.56±8.51 pg/mL, 207.11±1.34 pg/mL, 200.39±10.31 pg/mL로 유의적으로 분비량이 증가하는 것을 확인하였다.
고순도 β-1.3/1.6-glucan 75, 150μg/mL 농도에서는 각 115.04±7.06%, 108.17±3.67%로 zymosan만 처리한 군에 비해 유의적으로 증가하였음을 알 수 있었다.
대식세포를 활성화시켜 탐식작용을 자극하는 zymosan 을 처리한 군에서의 탐식작용 활성을 100%로 비교하였을 때 정상군의 25.33±4.08%보다 유의적으로 증가한 것으로 보아 zymosan이 정상적으로 작용하여 대식세포를 활성화시켰음을 확인하였다.
또한, 고순도 β-1.3/1.6-glucan은 대식세포의 활성능, 자연살해세포의 활성능에 도움을 주어 활성능을 증가시켜 외부로부터 침입한 미생물, 감염된 세포나 종양세포 등을 효과적으로 제거할 수 있을 것이라 예상할 수 있었다.
마우스 복강에서 불리한 대식세포를 이용하여 세포독성을 확인한 결과 고순도 β-1.3/1.6-glucan 10~200 μg/ mL의 농도에서 독성이 나타나지 않았다.
마지막으로 T 세포 면역계에 조절작용을 하는 사이토카인과 CD4+/CD8+를 확인한 결과 고순도 β-1.3/1.6-glucan이 사이토카인들의 분비량 및 CD4+/CD8+를 증가시켜 T 세포 면역계에 조절뿐 아니라 B 세포 면역계의 조절에 도움을 줄 것이라 예상할 수 있었다.
반면 고순도 β-1.3/1.6-glucan을 처리한 군들은 control군과 비교하여 모두 유의적으로 높아졌음을 확인하였다.
본 연구에서는 고순도 β-1.3/1.6-glucan이 면역관련 세포의 활성, 특히 선천면역계에 중요한 대식세포와 자연살해 세포의 활성능을 측정하여 확인한 결과 선천면역계 면역세포의 활성에 도움을 주는 것을 확인하였다.
실험 결과 Fig. 1에서 나타난 바와 같이 100 μg/mL 농도에서 90.13±1.53%의 생존율을 보여 유의적으로 감소하였으나 이전 10, 50 μg/ mL 농도와 이후 150, 200 μg/mL 농도에서 다시 증가하여 유의적으로 control군과 차이가 없었으므로 실험적인 오차로 인하여 유의적인 차이를 보인 것으로 예상되며 100 μg/ mL의 농도에서는 독성이 없으므로 판단할 수 있다.
후속연구
결론적으로 고순도 β-1.3/1.6-glucan은 선천면역뿐 아니라 적응면역에서 영향을 미칠 것이라 생각하며 면역조절에 긍정적인 변화를 보였으므로 추후 면역 조절제로서 기능성 식품의 상업화에 기초 자료가 되어 국내 기능성 소재로서의 개발 가능성을 기대할 수 있다.
그러나 고순도 β-1.3/1.6-glucan은 10, 75, 150 μg/mL의 농도에서 자연살해세포 활성을 도움으로써 virus에 감염된 세포, 종양세포, 비정상적인 세포의 제거하는 역할에 기여할 것이라 예상된다.
후)적응 면역계에">적응면역계에 중요한 역할을 하게 되는 T 세포면역계의 영향을 주는 사이토카인의 분비 및 CD4+/ CD8+ T 세포를 측정한 결과 사이토카인과 CD4+/CD8+ T 세포를 조절함으로써 더 나아가 B 세포면역계에 영향을 미쳐 항체의 생성에 도움을 주어 병원균이나 virus에 감염된 숙주를 제거하고 추후 감염에도 빠른 면역계 항상성 유지에 큰 도움을 줄 것으로 생각한다. 따라서 추후 면역 조절제로서 기능성 식품의 상업화에 기초 자료가 되어 국내 기능성 소재로서의 개발 가능성을 기대할 수 있다.
후)인하 여">인하여 병원균이나 virus에 감염된 숙주를 초기에 제거함으로써 면역계를 조절하는 데 도움을 줄 것으로 생각한다. 또한, 적응면역계에 중요한 역할을 하게 되는 T 세포면역계의 영향을 주는 사이토카인의 분비 및 CD4+/ CD8+ T 세포를 측정한 결과 사이토카인과 CD4+/CD8+ T 세포를 조절함으로써 더 나아가 B 세포면역계에 영향을 미쳐 항체의 생성에 도움을 주어 병원균이나 virus에 감염된 숙주를 제거하고 추후 감염에도 빠른 면역계 항상성 유지에 큰 도움을 줄 것으로 생각한다. 따라서 추후
이로 인하여 β-glucan 생성 시 미생물 균체의 세포벽에 함유된 경우 불순물이 많이 포함되어 순도의 저하가 발생하는 문제점을 보완하여 불순물의 함량을 낮추어 β-glucan의 순도를 높이고, 또한 물에 불용성인 문제점을 보완하여 수용성의 β-glucan을 생산하여 함량별 효능이 상대적으로 우수할 것이라 예상된다(data not shown).
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
면역 방어 체계는 어떻게 구분되는가?
면역(immunity)이란 인체 내로 침입하는 미생물, 세균, 바이러스뿐만 아니라 체내 조직이나 불필요한 산물 등을 인식하여 제거하고 항상성을 유지하는 방어 체계이다. 이 방어체계에는 선천면역(innate immunity)과 후천면역(adaptive immunity)으로 구분된다(1,2). 선천면역은 대식세포(macrophage), 자연살해세포(natural killer cell; NK cell) 등이 외부물질을 인식하여 탐식작용(phagocytosis) 및 제거 작용을 하게 되며 선천면역에 제거되지 못한 외부 물질은 antigen presenting cell(APC)에 의해 전달되어 후천성 면역 반응 활성화하게 된다.
면역이란?
면역(immunity)이란 인체 내로 침입하는 미생물, 세균, 바이러스뿐만 아니라 체내 조직이나 불필요한 산물 등을 인식하여 제거하고 항상성을 유지하는 방어 체계이다. 이 방어체계에는 선천면역(innate immunity)과 후천면역(adaptive immunity)으로 구분된다(1,2).
β-glucan의 문제점은?
최근 버섯류에 많이 함유되어 있는 것으로 밝혀졌으며, 버섯의 종류에 따라 다양한 형태가 존재한다고 보고되었으며, 항암, 고혈압 등에 효과가 있는 것으로 알려져 있다(12, 13). 그러나 미생물 균체의 세포벽에 함유된 경우 불순물도 많이 포함하고 있고, 또한 물에 불용성이기 때문에 이러한 문제점을 해결하고자 본 연구에서는 Aspergillus pullulans 를 이용하여 수용성의 고순도 β-glucan인 β-1.3/1.
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