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문제 정의
- CD4+ T 세포와 CD8+ T 세포의 세포 비율을 관찰하고자 실험을 진행하였다. 위의 실험들에서 250 μg/mL의 농도에서 유의적으로 세포를 감소하는 것에 대해 첫째는 과 activation으로 인하여 그러나 미생물 균체의 세포벽에 함유된 경우 불순물도 많이 포함하고 있고, 또한 물에 불용성이기 때문에 이러한 문제점을 해결하고자 본 연구에서는 Aspergillus pullulans 를 이용하여 수용성의 고순도 β-glucan인 β-1.3/1.6-glucan 생산하여 대식세포 및 자연살해세포와 T 세포 면역계의 영향을 관찰하여 면역조절 효과에 대한 기능성을 확인하고자 한다.
- 본 연구에서는 고순도 β-1.3/1.6-glucan의 처리가 사이토카인의 분비에 미치는 영향을 확인하였다.
- 본 연구에서는 고순도 β-1.3/1.6-glucan이 선천면역계에 중요한 역할을 하는 대식세포와 자연살해세포의 활성화와 적응면역계에서 중요한 역할을 하는 T 세포 면역계에 대한 면역조절 효과를 살펴보고자 대식세포의 활성능, 자연살해세포의 활성능, 그리고 T 세포 면역계에 조절작용을 하는 사이토카인, CD4+/CD8+ T 세포에 미치는 영향을 관찰하였다.
- 본 연구에서는 대식세포를 활성화시키는 zymosan과 함께 고순도 β-1.3/1.6-glucan의 처리가 대식세포 활성에 미치는 영향을 관찰하였다.
제안 방법
- 250 μg/ mL 농도에서 90.33±3.51%의 생존율을 보여 유의적으로 감소하였으나 90~100% 이상의 세포생존율을 보여 고순도 β-1.3/1.6-glucan 250 μg/mL 농도까지 실험농도로 설정하였지만, 250 μg/mL의 농도에서 세포생존율이 유의적으로 감소하는 것에 대하여 세포독성으로 인하여 감소한 것이라는 생각을 배제하지 않고 고순도 β-1.3/1.6-glucan 10~250 μg/mL의 농도로 설정하여 실험을 진행하였다.
- 45 μm cell strainer를 사용하여 세포 부유액을 만들었다. Red blood cell lysing buffer(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)로 적혈구를 용혈시켜 만든 비장 세포 부유액을 mouse NK cell enrichment kit(StemCell Technologies, Inc., Vancouver, Canada)을 사용하여 자연살해세포를 분리하였다.
- YAC-1 세포는 target 세포로 이용하였으며, effector 세포와 5:1로 co-culture 하여 고순도 β-1.3/1.6-glucan을 10, 75, 150, 250 μg/mL의 농도별로 처리한 후 4시간 동안 배양하였다.
- 고순도 β-1.3/1.6-glucan의 적정농도를 결정하기 위해 primary culture 한 대식세포에 10~250 μg/mL의 농도를 처리한 후 세포의 생존율을 측정하였다.
- 대식세포의 분리를 위하여 희생 3일 전 Balb/c mouse에 2 mL의 thioglycollate medium을 복강에 주사하였다. 3일 후 마우스의 복강에서 serum free media를 주입 후 대식세포를 분리하였다.
- 대식세포의 활성화를 위하여 kit에 포함된 zymosan 입자를 사용하여 고순도 β-1.3/1.6-glucan을 10, 75, 150, 250 μg/mL의 농도별로 처리한 후 ELISA reader를 이용하여 흡광도 405 nm에서 측정하였다.
- 후)μg/mL농도별로">μg/mL 농도별로 처리한 후 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 CD4+, CD8+ (Southern Biotech, Birmingham, AL, USA) Flow cytometry용 anti-body를 세포수에 맞추어 처리한 후 ice 상태에서 30분간 shaking 한 후 CytoFLEX(Beckman Coulter Inc., South Kraemer Boulevard, CA, USA)를 이용하여 측정하였다.
- 후)처리한 후">처리한 후 4시간 동안 배양하였다. 배양하여 유리된 lactate dehydrogenase(LDH)를 cytotox 96 non radioactive cytotoxicity assay kit(Promega Corporation, Madison, WI, USA)을 이용하여 흡광도 490 nm에서 측정하여 계산하고 YAC-1 세포의 사멸 정도를 NK cell activity(%)로 나타내었다.
- 배양한 후 생성된 IL-2, TNF-α, IL-12, IFN-γ 양을 Douset Sandwich ELISA mouse kit(R&D System, McKinley Place NE, MN, USA)을 이용하여 측정하였다.
- 배지와 MTT 시약을 제거하고 DMSO(dimethyl sulfoxide) 시약 200 μL를 가하여 560 nm에서 ELISA reader(VERSAMAXSL-20, Molecular Devices, Seoul, Korea)를 이용하여 측정하였다.
- 본 연구에서는 Moloney virus-induced lymphoma 세포주인 YAC-1 세포를 target cell로, 자연살해세포를 effector cell로 설정하고 co-culture 하여 고순도 β-1.3/1.6-glucan의 처리가 자연살해세포 활성에 미치는 영향을 관찰하였다.
- 분리한 splenocyte를 24 well plate에 1×106 cells/well의 농도로 RPMI-1640 배양액에 분주하여 고순도 β-1.3/1.6-glucan, PC 비교 대조군을 10, 150 μg/mL 농도별로 처리한 후 24시간 동안 배양하였다.
- 분리한 대식세포를 96 well plate에 1×104 cells/well의농도로 10% FBS를 첨가한 DMEM(HyClone Laboratories) 배지에 분주하여 안정화시킨 후, 고순도 β-1.3/1.6- glucan을 10, 50, 100, 150, 200, 250 μg/mL의 농도로 처리하여 24시간 동안 배양하였다.
- 분리한 대식세포를 96 well plate에 1×105 cells/well의 농도로 DMEM 배양액에 분주하여 안정화시킨 후 고순도 β-1.3/1.6-glucan을 10, 75, 150, 250 μg/mL의 농도별로 처리하였다.
- 분리한 대식세포를 96 well plate에 1×106 cells/well의 농도로 DMEM 배양액에 분주하여 안정화시킨 후 Cytoselect 96-well phagocytosis assay kit(Cell Biolabs Inc., San Diego, CA, USA)을 이용하여 대식세포의 탐식능을 측정하였다.
- 원심분리한 상층액에 exo-(1.3/1.4/1.6)-β-glucanase와 β-glucosidase 효소혼합액을 첨가한 후 교반하여 40℃ 항온수조에서 60분간 반응시켜 glucose oxidase/peroxidase 혼합액을 넣어 흡광도 510 nm에서 측정하여 계산하였다.
- 자연살해세포의 분리를 위해 마우스에서 분리한 비장을 10% fetal bovine serum(FBS), 2 mmol/L glutamine, 100 mg/L penicillin-streptomycin을 첨가한 RPMI 1640으로 세척하고 0.45 μm cell strainer를 사용하여 세포 부유액을 만들었다.
대상 데이터
- 본 연구에서 사용된 YAC-1 세포는 American Type Culture Collection(ATCC, Manassas, VA, USA)에서 분양받았다. 10% fetal bovine serum(HyClone Laboratories, Logan, UT, USA), 2 mmol/L glutamine(HyClone Laboratories), 100 mg/L penicillin-streptomycin(HyClone Laboratories)을 첨가한 RPMI 1640(HyClone Laboratories)을 사용하여 37℃, 5% CO2의 조건인 incubator에서 배양하였다.
- 본 연구에서 사용된 고순도 β-glucan은 선일바이오(주)(Jangheung, Korea)에서 Aspergillus pullulans를 이용하여 균주 배양 후 원심분리 하여 균체를 제거하고, 농축(불순물 제거)과 주정침지(β-glucan 회수) 하여 동결건조 한 수용성의 β-1.3/1.6-glucan을 제공받아 D.W를 용매로 하여 사용하였다.
데이터처리
- Statistical analyses were performed by Duncan's multiple range tests after one-way ANOVA using SPSS software.
- Statistical analyses were performed by Duncan's multiple range tests after oneway ANOVA using SPSS software.
- 모든 실험은 3회 반복 시행하였으며 얻어진 결과는 SPSS 22.0 software(IBM, cambridge, MA, USA)를 이용하여 분석하였으며, 모든 측정 항목의 결과는 평균(mean)±표준편차(standard deviation, SD)로 표시하였다.
- 실험군 간 평균 차이를 one-way ANOVA로 확인한 후 그룹 간의 통계적 유의성을 Duncan's multiple range test를 이용하여 검증하였으며 5% 이내에서 통계적 유의성을 부여하였다(P<0.05).
성능/효과
- CD4+ T 세포의 경우 control군에서 CD4+ T 세포는 40.29±0.50%였으나 고순도 β-1.3/1.6-glucan을 10 μg/mL 농도로 처리한 군에서는 41.62±1.14%로 유의적인 차이가 없었으나 150 μg/mL 농도로 처리한 군에서는 43.63±0.53%로 유의적으로 증가하였음을 확인하였다.
- CD8+ T 세포의 경우 control군에서 CD8+ T 세포는 4.80±0.26%였으나 고순도 β-1.3/1.6-glucan을 처리한 군들은 10 μg/mL, 150 μg/mL 농도로 각각 12.64±0.30%, 13.59±0.33%로 농도 의존적으로 증가하였음을 확인하였다.
- IFN-γ의 분비량 측정 결과 Fig. 4D에서 나타난 바와 같이 control군 5.79±0.43 pg/mL보다 10, 75, 150, 250 μg/mL 농도 모두에서 각각 11.49±0.66 pg/mL, 14.08±0.66 pg/mL, 14.78±0.10 pg/mL, 14.68±0.76 pg/mL로 유의적으로 분비량이 증가하는 것을 확인하였다.
- IL-12의 분비량 측정 결과 Fig. 4C에서 나타난 바와 같이 control군 34.26±1.44 pg/mL보다 10, 75, 150, 250 μg/mL 농도 모두에서 각각 76.10±3.92 pg/mL, 91.48±3.93 pg/mL, 103.28±0.62 pg/mL, 100.18±4.76 pg/mL로 유의적으로 분비량이 증가하는 것을 확인하였다.
- IL-2의 분비량 측정 결과 Fig. 4B에서 나타난 바와 같이 control군 16.20±0.44 pg/mL보다 10, 75, 150, 250 μg/ mL 농도 모두에서 각각 51.37±3.00 pg/mL, 63.14±3.00 pg/mL, 66.28±0.47 pg/mL, 65.86±3.44 pg/mL로 유의적으로 분비량이 증가하는 것을 확인하였다.
- TNF-α의 분비량 측정 결과 Fig. 4A에서 나타난 바와 같이 control군 57.56±3.12 pg/mL에 비하여 10, 75, 150, 250 μg/mL 농도 모두에서 각각 148.22±8.51 pg/mL, 181.56±8.51 pg/mL, 207.11±1.34 pg/mL, 200.39±10.31 pg/mL로 유의적으로 분비량이 증가하는 것을 확인하였다.
- 고순도 β-1.3/1.6-glucan 75, 150μg/mL 농도에서는 각 115.04±7.06%, 108.17±3.67%로 zymosan만 처리한 군에 비해 유의적으로 증가하였음을 알 수 있었다.
- 대식세포를 활성화시켜 탐식작용을 자극하는 zymosan 을 처리한 군에서의 탐식작용 활성을 100%로 비교하였을 때 정상군의 25.33±4.08%보다 유의적으로 증가한 것으로 보아 zymosan이 정상적으로 작용하여 대식세포를 활성화시켰음을 확인하였다.
- 또한, 고순도 β-1.3/1.6-glucan은 대식세포의 활성능, 자연살해세포의 활성능에 도움을 주어 활성능을 증가시켜 외부로부터 침입한 미생물, 감염된 세포나 종양세포 등을 효과적으로 제거할 수 있을 것이라 예상할 수 있었다.
- 마우스 복강에서 불리한 대식세포를 이용하여 세포독성을 확인한 결과 고순도 β-1.3/1.6-glucan 10~200 μg/ mL의 농도에서 독성이 나타나지 않았다.
- 마지막으로 T 세포 면역계에 조절작용을 하는 사이토카인과 CD4+/CD8+를 확인한 결과 고순도 β-1.3/1.6-glucan이 사이토카인들의 분비량 및 CD4+/CD8+를 증가시켜 T 세포 면역계에 조절뿐 아니라 B 세포 면역계의 조절에 도움을 줄 것이라 예상할 수 있었다.
- 반면 고순도 β-1.3/1.6-glucan을 처리한 군들은 control군과 비교하여 모두 유의적으로 높아졌음을 확인하였다.
- 본 연구에서는 고순도 β-1.3/1.6-glucan이 면역관련 세포의 활성, 특히 선천면역계에 중요한 대식세포와 자연살해 세포의 활성능을 측정하여 확인한 결과 선천면역계 면역세포의 활성에 도움을 주는 것을 확인하였다.
- 실험 결과 Fig. 1에서 나타난 바와 같이 100 μg/mL 농도에서 90.13±1.53%의 생존율을 보여 유의적으로 감소하였으나 이전 10, 50 μg/ mL 농도와 이후 150, 200 μg/mL 농도에서 다시 증가하여 유의적으로 control군과 차이가 없었으므로 실험적인 오차로 인하여 유의적인 차이를 보인 것으로 예상되며 100 μg/ mL의 농도에서는 독성이 없으므로 판단할 수 있다.
후속연구
- 결론적으로 고순도 β-1.3/1.6-glucan은 선천면역뿐 아니라 적응면역에서 영향을 미칠 것이라 생각하며 면역조절에 긍정적인 변화를 보였으므로 추후 면역 조절제로서 기능성 식품의 상업화에 기초 자료가 되어 국내 기능성 소재로서의 개발 가능성을 기대할 수 있다.
- 그러나 고순도 β-1.3/1.6-glucan은 10, 75, 150 μg/mL의 농도에서 자연살해세포 활성을 도움으로써 virus에 감염된 세포, 종양세포, 비정상적인 세포의 제거하는 역할에 기여할 것이라 예상된다.
- 후)적응 면역계에">적응면역계에 중요한 역할을 하게 되는 T 세포면역계의 영향을 주는 사이토카인의 분비 및 CD4+/ CD8+ T 세포를 측정한 결과 사이토카인과 CD4+/CD8+ T 세포를 조절함으로써 더 나아가 B 세포면역계에 영향을 미쳐 항체의 생성에 도움을 주어 병원균이나 virus에 감염된 숙주를 제거하고 추후 감염에도 빠른 면역계 항상성 유지에 큰 도움을 줄 것으로 생각한다. 따라서 추후 면역 조절제로서 기능성 식품의 상업화에 기초 자료가 되어 국내 기능성 소재로서의 개발 가능성을 기대할 수 있다.
- 후)인하 여">인하여 병원균이나 virus에 감염된 숙주를 초기에 제거함으로써 면역계를 조절하는 데 도움을 줄 것으로 생각한다. 또한, 적응면역계에 중요한 역할을 하게 되는 T 세포면역계의 영향을 주는 사이토카인의 분비 및 CD4+/ CD8+ T 세포를 측정한 결과 사이토카인과 CD4+/CD8+ T 세포를 조절함으로써 더 나아가 B 세포면역계에 영향을 미쳐 항체의 생성에 도움을 주어 병원균이나 virus에 감염된 숙주를 제거하고 추후 감염에도 빠른 면역계 항상성 유지에 큰 도움을 줄 것으로 생각한다. 따라서 추후 이로 인하여 β-glucan 생성 시 미생물 균체의 세포벽에 함유된 경우 불순물이 많이 포함되어 순도의 저하가 발생하는 문제점을 보완하여 불순물의 함량을 낮추어 β-glucan의 순도를 높이고, 또한 물에 불용성인 문제점을 보완하여 수용성의 β-glucan을 생산하여 함량별 효능이 상대적으로 우수할 것이라 예상된다(data not shown).
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